Efeito das variantes genéticas PNPLA3, TM6SF2 e MBOAT7 no resultado terapêutico da doença hepática gordurosa não alcoólica.

O objetivo deste estudo foi avaliar se o PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 e MBOAT7 rs641738 poderiam influenciar a resposta de pacientes com DHGNA quanto a parâmetros metabólicos, dano hepático e acúmulo de gordura hepática, ao tratamento com 303 mg do complexo silibina-fosfolipídios, 10 mg de vitamina D e 15 mg de vitamina E duas vezes ao dia durante seis meses.

Os investigadores realizaram uma comparação inicial de peso, relação cintura-altura (RCEst), medição da pressão arterial, índice de massa corporal (IMC), glicemia e insulina, o modelo homeostático para avaliação da resistência à insulina (HOMA-IR), aspartato e alanina aminotransferase (AST, ALT), gama-glutamil transferase (GGT), hemograma, proteína C reativa (PCR), substância reativa ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), rigidez hepática e parâmetro de atenuação controlada (CAP) entre os três grupos de estudo: Grupo de controle NAFLD de tipo selvagem (n. 30), grupo de tipo selvagem tratado com NAFLD (n. 30), grupo mutado tratado com NAFLD (n. 32). O método de randomização em bloco foi usado para randomizar os 60 pacientes não mutados no grupo de controle NAFLD de tipo selvagem e NAFLD tipo selvagem tratado, usando o software de randomização online http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

O grupo controle selvagem foi composto por pacientes com DHGNA sem mutações PNPLA3, TM6SF2 e MBOAT7 que não receberam nenhum tipo de tratamento durante o período do estudo.

Os pacientes inseridos nos grupos DHGNA tipo selvagem e DHGNA mutado foram submetidos à administração oral de 303mg do complexo silibina-fosfolipídio, 10mg de vitamina D e 15mg de vitamina E, duas vezes ao dia, durante seis meses. Nenhum dos pacientes inscritos abandonou o estudo.

Ao final do tratamento, foi refeita a avaliação da RCEst, medida da pressão arterial, IMC, glicemia e insulina, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, hemograma, PCR, TBARS, rigidez hepática e PAC. Durante a observação experimental, os pacientes estavam em dieta livre com base nos hábitos alimentares antes da inclusão e qualquer tipo de exercício físico foi recomendado durante o período do estudo. A ingestão alimentar foi avaliada no início e no final do tratamento usando um software computadorizado. Os pesquisadores registraram, com um diário alimentar, a ingestão alimentar de uma semana completa, incluindo dias úteis e finais de semana. Com base nas quantidades e qualidades dos alimentos consumidos, o soft elabora a ingestão energética diária e a percentagem/quantidade calórica dos macronutrientes. Para a avaliação do exercício físico, os investigadores submeteram um questionário específico no início e no final do tratamento com algumas perguntas simples: O participante pratica ou já praticou (nos últimos dois anos) desporto de forma contínua e regular? O participante mudou sua atividade física diária nos últimos seis meses? 1: não, 2: sim; se sim, a atividade física melhorou ou piorou? O consumo de álcool foi avaliado no início e no final do tratamento. Cento e dois pacientes com diagnóstico histológico de DHGNA seguidos pela Divisão de Hepatogastroenterologia da Universidade da Campânia "Luigi Vanvitelli, entre janeiro e outubro de 2017 foram rastreados, após a assinatura de um consentimento informado, para as variantes genéticas PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 e MBOAT7 rs641738 e trinta e dois preencheram os critérios de inclusão para o estudo e apresentaram pelo menos um entre as variantes genéticas PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K e MBOAT7 TMC4C/T ou TMC4T/T, foram inscritos juntamente com sessenta pacientes sem as mutações. Dez pacientes foram excluídos da inclusão devido à coexistência de várias comorbidades e/ou doença hepática em estágios avançados, como cirrose e/ou carcinoma hepatocelular (CHC).

A definição da presença/ausência de DHGNA e o estadiamento foram avaliados por meio de biópsia hepática, testes sorológicos e coleta de dados clínicos. Antecedentes médicos, consumo de álcool (AUDIT-C), medicamentos, abuso de drogas, hábitos tabágicos também foram investigados. Pressão arterial, peso e altura foram medidos diretamente e a RCEst foi calculada. O IMC também foi calculado dividindo-se o peso (kg) pelo quadrado da altura (m). Os pacientes foram submetidos, após jejum de 12 horas, à coleta de amostras de sangue venoso periférico para avaliação de alguns parâmetros bioquímicos e realização da análise genética.

Os níveis de insulina, GGT, PCR foram medidos enzimaticamente usando kits disponíveis comercialmente, AST, ALT e glicose usando kit de ensaio colorimétrico (Amplite 13801/13803 e Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). O HOMA-IR também foi calculado usando a fórmula: insulina em jejum (μU/mL) × glicose plasmática (mmol/L)/22,5.

A elastografia transitória FibroScan® (TE) foi realizada usando o FibroScan® versão 502 (Echosens, Paris, França) com sondas padrão (sondas M e XL. A sonda extralarga (XL) foi utilizada quando a distância da pele à cápsula hepática, avaliada por ultrassonografia, ultrapassava 2,5 cm e/ou quando o IMC era >30. O FibroScan® foi realizado por um médico especialista obtendo dez medições aceitáveis, definidas como uma medição bem-sucedida da rigidez hepática (LS), com o número máximo de tentativas estabelecido em 20. Os critérios propostos por Boursier et al. foram usados ​​para considerar a medida "muito confiável" (IQR/M ≤ 0:1), "confiável" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 ou IQR/M > 0:3 com mediana LS < 7:1 kPa) ou "pouco confiável" (IQR/M > 0:3 com mediana LS ≥ 7:1 kPa). Com base nesses escores de PAC, os investigadores classificaram os pacientes inscritos em S0, sem esteatose (0%-10% de gordura; 0-237 dB/m); S1, esteatose leve (11%-33% de gordura; 238-259 dB/m); S2, esteatose moderada (34%-66% gordura; 260-292 dB/m); e S3, esteatose grave (>67% de gordura; ≥293 dB/m) de acordo com o cálculo da atenuação dos sinais ultrassônicos utilizados para TE.

O ensaio TBARS foi realizado usando 10 μl de soro. O cromogênio TBARS foi quantificado usando um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 532nm com 1,1,3,3-tetrametoxiprofano como padrão. A quantidade de TBARS foi expressa em nmol/μg de proteína. Os dados apresentados são a média ± desvio padrão, resultantes de três experimentos independentes.

A extração do DNA genômico das amostras de sangue periférico foi realizada com o kit de extração PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen da Life Technologies, EUA). A quantidade de DNA de cada amostra foi avaliada por espectrofotômetro (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) usando um comprimento de onda de 260 nm. A presença de contaminação da amostra foi avaliada usando uma avaliação de comprimento de onda de 280 nm e todas as amostras apresentaram bom grau de pureza porque a razão 260/280 estava entre 1,8 e 2. O DNA extraído foi então armazenado em freezer a -20°C até a análise dos polimorfismos.

A análise dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), utilizando o código de acesso ao banco de dados TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), foi realizada utilizando a genotipagem de DNA RealTime PCR com TaqMan (Applied Biosystem) c_89463510_10 para SNP 1, c_8716820_10 para SNP 2, c_7241_10 para sondas SNP 3. Todas as avaliações foram feitas em três fases: amplificação de DNA por PCR, identificação alélica e análise de ponto final com curva de fusão.

A primeira fase foi feita usando a DNA polimerase AmpliTaq Gold® contida no TaqMan Universal PCR Master Mix amplificando a sequência alvo por primers específicos contidos no SNP Genotyping Assay 40X juntamente com sondas TaqMan® MGB: uma marcada com fluorocromo VIC® que reconhece a sequência do alelo 1 e outra sonda marcada com fluorocromo FAM™ que reconhece a sequência do alelo 2. Para cada experimento foi utilizada uma placa de 48 poços, na qual, uma parte das amostras biológicas de genótipo desconhecido para análise de SNP, três controles negativos diferentes foram analisados ​​para evitar possíveis erros devido à contaminação das amostras. Cada experimento foi feito em triplicado. As amplificações foram realizadas usando o StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems). A avaliação da genotipagem é baseada na discriminação alélica graças a uma fluorescência diferente do primer do gene específico, usando duas sondas MGB TaqMan®, marcadas em 5' com um fluorocromo diferente: SNP1 em G reverso em VIC® e A em FAM™; SNIP2 no encaminhamento C em VIC® e T em FAM™; SNIP3 em forward C em VIC® e G em FAM™. Para a análise dos resultados, o software StepOne™2.0 foi usado. Após a diferenciação da fluorescência feita das sondas para o fundo em cada poço, mede as intensidades de sinal normalizadas (Rn) projetando os resultados em gráfico de discriminação alélica. O software fornece às amostras um genótipo específico com base na posição do sinal de fluorescência: eixo horizontal (alelo um), eixo vertical (alelo 2) eixo diagonal (ambos alelo um e dois). A prevalência de uma fluorescência específica sobre a outra identificou o genótipo homozigótico, ao contrário a presença de ambos o heterozigótico.

Análise estatística O número de pacientes (30 no grupo de controle NAFLD de tipo selvagem, 30 no tipo selvagem tratado com NAFLD e 32 nos mutados tratados com NAFLD) foi calculado usando a função de cálculo de poder e tamanho de amostra do STATA-14® para mac- OS, com base em uma diferença esperada entre os grupos de estudo na resposta do HOMA-IR à terapia, assumindo uma quantidade dupla de resposta do paciente à terapia no grupo de tipo selvagem em comparação com o mutante. Especificamente, os investigadores consideraram o paciente respondedor se pelo menos um dos seguintes critérios fosse abordado: normalização do HOMA-IR (

As análises estatísticas foram realizadas usando o Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0.