Efecto de las variantes genéticas PNPLA3, TM6SF2 y MBOAT7 en el resultado terapéutico de la enfermedad del hígado graso no alcohólico.

El objetivo de este estudio fue evaluar si el PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 y MBOAT7 rs641738 podrían influir en la respuesta de pacientes con EHGNA en cuanto a parámetros metabólicos, daño hepático y acumulación de grasa hepática, a un tratamiento con 303 mg del complejo silibina-fosfolípidos, 10 mg de vitamina D y 15 mg de vitamina E dos veces al día durante seis meses.

Los investigadores realizaron una comparación inicial de peso, relación cintura-altura (WHtR), medición de la presión arterial, índice de masa corporal (IMC), glucosa e insulina en sangre, el modelo homeostático para la evaluación de la resistencia a la insulina (HOMA-IR), aspartato y alanina aminotransferasa (AST, ALT), gamma-glutamil transferasa (GGT), hemograma, proteína C reactiva (PCR), sustancia reactiva del ácido tiobarbitúrico (TBARS), rigidez hepática y parámetro de atenuación controlada (CAP) entre los tres grupos de estudio: Grupo de control de tipo salvaje NAFLD (n. 30), grupo de tipo salvaje tratado con NAFLD (n. 30), grupo mutado tratado con NAFLD (n. 32). El método de aleatorización en bloque se usó para aleatorizar a los 60 pacientes no mutados en el grupo de control de tipo salvaje NAFLD y el tipo salvaje tratado con NAFLD, usando el software de aleatorización en línea http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

El grupo de control de tipo salvaje estaba compuesto por pacientes con NAFLD sin mutaciones en PNPLA3, TM6SF2 y MBOAT7 que no recibieron ningún tipo de tratamiento durante el período de estudio.

Los pacientes insertados en los grupos de tipo salvaje tratados con NAFLD y mutados tratados con NAFLD se sometieron a una administración oral de 303 mg de complejo de silibina-fosfolípido, 10 mg de vitamina D y 15 mg de vitamina E, dos veces al día durante seis meses. Ninguno de los pacientes inscritos abandonó el estudio.

Al final del tratamiento se volvió a realizar la valoración de WHtR, toma de presión arterial, IMC, Glucosa e insulina en sangre, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, hemograma, PCR, TBARS, rigidez hepática y CAP. Durante la observación experimental, los pacientes se encontraban en dieta libre en base a los hábitos alimentarios previos al enrolamiento y se recomendaba cualquier tipo de ejercicio físico durante el período de estudio. La ingesta de alimentos se evaluó tanto al inicio como al final del tratamiento utilizando un software computarizado. Los investigadores registraron, con un diario de dieta, la ingesta de alimentos de una semana completa, incluidos los días laborables y el fin de semana. En base a las cantidades y calidades de los alimentos consumidos, el soft elabora la ingesta energética diaria y el porcentaje/cantidad calórica de macronutrientes. Para la evaluación del ejercicio físico, los investigadores enviaron un cuestionario específico al inicio y al final del tratamiento con algunas preguntas simples: ¿El participante está haciendo o ha hecho alguna vez (en los últimos dos años) deporte de forma continua y regular? ¿Ha cambiado el participante su actividad física diaria en los últimos seis meses? 1: no, 2: sí; en caso afirmativo, ¿ha mejorado o empeorado la actividad física? Se evaluó el consumo de alcohol al inicio y al final del tratamiento. Ciento dos pacientes con diagnóstico histológico de NAFLD seguidos por la División de Hepatogastroenterología de la Universidad de Campania "Luigi Vanvitelli, entre enero y octubre de 2017 fueron examinados, después de firmar un consentimiento informado, para las variantes genéticas PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 y MBOAT7 rs641738 y treinta y dos cumplieron con los criterios de inclusión para el estudio y mostraron al menos una de las variantes genéticas PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K y MBOAT7 TMC4C/T o TMC4T/T, se inscribieron junto con sesenta pacientes sin las mutaciones. Diez pacientes fueron excluidos de la inscripción debido a la coexistencia de varias comorbilidades y/o enfermedad hepática en estadios avanzados como cirrosis y/o carcinoma hepatocelular (CHC).

La definición de presencia/ausencia de EHGNA y la estadificación se evaluaron mediante la realización de una biopsia hepática, pruebas serológicas y recogida de datos clínicos. También se investigaron antecedentes médicos, consumo de alcohol (AUDIT-C), medicamentos, abuso de drogas, hábito de fumar. La presión arterial, el peso, la altura se midieron directamente y se calculó el WHtR. El IMC también se calculó dividiendo el peso (kg) por el cuadrado de la altura (m). Los pacientes fueron sometidos después de 12 horas de ayuno a la recolección de muestras de sangre venosa periférica para evaluar algunos parámetros bioquímicos y realizar el análisis genético.

Los niveles de insulina, GGT, PCR se midieron enzimáticamente usando kits disponibles comercialmente, AST, ALT y glucosa usando un kit de ensayo colorimétrico (Amplite 13801/13803 y Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). El HOMA-IR también se calculó mediante la fórmula: insulina en ayunas (μU/mL) × glucosa plasmática (mmol/L)/22,5.

La elastografía transitoria (TE) de FibroScan® se realizó utilizando la versión 502 de FibroScan® (Echosens, París, Francia) con sondas estándar (sondas M y XL. La sonda extra grande (XL) se utilizó cuando la distancia de la piel a la cápsula hepática, evaluada por ultrasonografía, superaba los 2,5 cm y/o cuando el IMC era > 30. FibroScan® fue realizado por un médico experto obteniendo diez mediciones aceptables, definidas como una medición exitosa de rigidez hepática (LS), con el número máximo de intentos establecido en 20. Los criterios propuestos por Boursier et al. se utilizaron para considerar la medida "muy confiable" (IQR/M ≤ 0:1), "confiable" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 o IQR/M > 0:3 con mediana LS < 7:1 kPa), o "poco confiable" (IQR/M > 0:3 con LS mediana ≥ 7:1 kPa). Sobre la base de estas puntuaciones CAP, los investigadores clasificaron a los pacientes incluidos en S0, sin esteatosis (0%-10% de grasa; 0-237 dB/m); S1, esteatosis leve (11%-33% grasa; 238-259 dB/m); S2, esteatosis moderada (34%-66% grasa; 260-292 dB/m); y S3, esteatosis severa (>67% grasa; ≥293 dB/m) según cálculo de atenuación de señales ultrasónicas utilizado para TE.

El ensayo TBARS se realizó utilizando 10 μl de suero. El cromógeno TBARS se cuantificó utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 532 nm con 1,1,3,3-tetrametoxiprofano como estándar. La cantidad de TBARS se expresó como nmol/μg de proteína. Los datos presentados son la media ± desviación estándar, resultantes de tres experimentos independientes.

La extracción de ADN genómico a partir de muestras de sangre periférica se realizó mediante el kit de extracción PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen by Life Technologies, EE. UU.). La cantidad de ADN de cada muestra se evaluó mediante un espectrofotómetro (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) utilizando una longitud de onda de 260 nm. La presencia de contaminación de la muestra se evaluó mediante una evaluación de longitud de onda de 280 nm y toda la muestra mostró un buen grado de pureza debido a que la relación 260/280 estaba entre 1,8 y 2. El ADN extraído se almacenó en un congelador a -20 °C hasta que el análisis de los polimorfismos.

El análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), utilizando el código de acceso al banco de datos TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), se realizó mediante el genotipado de ADN RealTime PCR con TaqMan (Applied Biosystem) c_89463510_10 para SNP 1, c_8716820_10 para SNP 2, c_7241_10 para sondas SNP 3. Todas las evaluaciones se realizaron en tres fases: amplificación de ADN por PCR, identificación alélica y análisis de punto final con curva de fusión.

La primera fase se realizó utilizando la ADN polimerasa AmpliTaq Gold® contenida en TaqMan Universal PCR Master Mix amplificando la secuencia diana mediante cebadores específicos contenidos en SNP Genotyping Assay 40X junto con sondas TaqMan® MGB: una marcada con fluorocromo VIC® que reconoce la secuencia del alelo 1 y otra sonda marcada con fluorocromo FAM™ que reconoce la secuencia del alelo 2. Para cada experimento se utilizó una placa de 48 pozos, en la cual, parte de las muestras biológicas de genotipo desconocido para el análisis de SNP, Se analizaron tres controles negativos diferentes para evitar posibles errores por contaminación de las muestras. Cada experimento se realizó por triplicado. Las amplificaciones se realizaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real StepOne™ (Applied Biosystems). La evaluación del genotipado se basa en la discriminación alélica gracias a una fluorescencia diferente del cebador del gen específico, utilizando dos sondas MGB TaqMan®, marcadas en 5' con un fluorocromo diferente: SNP1 en G invertida en VIC® y A en FAM™; SNIP2 en adelante C en VIC® y T en FAM™; SNIP3 en C directa en VIC® y G en FAM™. Para el análisis de resultados el software StepOne™2.0 se utilizó. Tras la diferenciación de la fluorescencia realizada desde las sondas al fondo en cada pocillo, se miden las intensidades de señal normalizadas (Rn) proyectando los resultados en gráfico de discriminación alélica. El software da a las muestras un genotipo específico basado en la posición de la señal de fluorescencia: eje horizontal (alelo uno), eje vertical (alelo 2) eje diagonal (alelo uno y dos). El predominio de una fluorescencia específica sobre otra identificó el genotipo homocigosis, por el contrario la presencia de ambas heterocigosis.

Análisis estadístico El número de pacientes (30 en el grupo de control de tipo salvaje NAFLD, 30 en el tipo salvaje tratado con NAFLD y 32 en los tratados con NAFLD mutados) se calculó utilizando la función de cálculo de potencia y tamaño de muestra de STATA-14® para Mac. OS, sobre la base de una diferencia esperada entre los grupos de estudio en la respuesta del HOMA-IR a la terapia, asumiendo una cantidad doble de pacientes que respondieron a la terapia en el grupo de tipo salvaje en comparación con el mutado. Específicamente, los investigadores consideraron que los pacientes respondían si se cumplía al menos uno de los siguientes criterios: normalización del HOMA-IR (

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Programa Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS®) vs.18.0.