Effetto delle varianti genetiche PNPLA3, TM6SF2 e MBOAT7 sull'esito terapeutico della malattia del fegato grasso non alcolico.

Lo scopo di questo studio era valutare se PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 e MBOAT7 rs641738 potessero influenzare la risposta dei pazienti con NAFLD riguardo ai parametri metabolici, danno epatico e accumulo di grasso epatico, a un trattamento con 303 mg di complesso silibina-fosfolipidi, 10 mg di vitamina D e 15 mg di vitamina E due volte al giorno per sei mesi.

I ricercatori hanno eseguito un confronto di base di peso, rapporto vita-altezza (WHtR), misurazione della pressione sanguigna, indice di massa corporea (BMI), glicemia e insulina, il modello omeostatico per la valutazione della resistenza all'insulina (HOMA-IR), aspartato e alanina aminotransferasi (AST, ALT), gamma-glutamil transferasi (GGT), conta ematica, proteina C reattiva (CRP), sostanza reattiva all'acido tiobarbiturico (TBARS), rigidità epatica e parametro di attenuazione controllata (CAP) tra i tre gruppi di studio: Gruppo di controllo wild type NAFLD (n. 30), gruppo wild type trattato con NAFLD (n. 30), gruppo mutato trattato con NAFLD (n. 32). Il metodo di randomizzazione a blocchi è stato utilizzato per randomizzare i 60 pazienti non mutati nel gruppo di controllo wild-type con NAFLD e il wild-type trattato con NAFLD, utilizzando il software di randomizzazione online http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Il gruppo di controllo wild-type era composto da pazienti NAFLD senza mutazioni PNPLA3, TM6SF2 e MBOAT7 che non hanno ricevuto alcun tipo di trattamento durante il periodo di studio.

I pazienti inseriti nei gruppi wild type trattati con NAFLD e mutati trattati con NAFLD sono stati sottoposti a somministrazione orale di 303 mg di complesso silibina-fosfolipide, 10 mg di vitamina D e 15 mg di vitamina E, due volte al giorno per sei mesi. Nessuno dei pazienti arruolati ha abbandonato lo studio.

Al termine del trattamento è stata ripetuta la valutazione di WHtR, misurazione della pressione arteriosa, BMI, glicemia e insulina, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, emocromo, CRP, TBARS, rigidità epatica e CAP. Durante l'osservazione sperimentale, i pazienti erano a dieta libera sulla base delle abitudini alimentari prima dell'arruolamento e durante il periodo di studio è stato raccomandato qualsiasi tipo di esercizio fisico. L'assunzione di cibo è stata valutata sia al basale che alla fine del trattamento utilizzando un software computerizzato. Gli investigatori hanno registrato, con un diario dietetico, l'assunzione di cibo di un'intera settimana, compresi i giorni lavorativi e il fine settimana. Sulla base delle quantità e qualità degli alimenti consumati, il soft elabora l'apporto energetico giornaliero e l'apporto percentuale/calorico dei macronutrienti. Per la valutazione dell'esercizio fisico, i ricercatori hanno presentato un questionario specifico al basale e alla fine del trattamento con alcune semplici domande: il partecipante pratica o ha mai praticato (negli ultimi due anni) sport in modo continuativo e regolare? Il partecipante ha cambiato la sua attività fisica quotidiana negli ultimi sei mesi? 1: no, 2: sì; se sì, l'attività fisica è migliorata o peggiorata? Il consumo di alcol è stato valutato all'inizio e alla fine del trattamento. Centodue pazienti con diagnosi istologica di NAFLD seguiti dalla Divisione di Epatogastroenterologia dell'Università della Campania "Luigi Vanvitelli", tra gennaio e ottobre 2017 sono stati sottoposti a screening, previa firma di un consenso informato, per le varianti genetiche PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 e MBOAT7 rs641738 e trentadue hanno soddisfatto i criteri di inclusione per lo studio e hanno mostrato almeno una tra le varianti genetiche PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K e MBOAT7 TMC4C/T o TMC4T/T, sono stati arruolati insieme a sessanta pazienti senza le mutazioni. Dieci pazienti sono stati esclusi dall'arruolamento a causa della coesistenza di diverse comorbilità e/o malattia epatica in stadio avanzato come cirrosi e/o carcinoma epatocellulare (HCC).

La definizione della presenza/assenza di NAFLD e la stadiazione sono state valutate eseguendo una biopsia epatica, test sierologici e raccogliendo dati clinici. Sono stati studiati anche anamnesi, consumo di alcol (AUDIT-C), farmaci, abuso di droghe, abitudine al fumo. La pressione sanguigna, il peso, l'altezza sono stati misurati direttamente ed è stato calcolato WHtR. Il BMI è stato anche calcolato dividendo il peso (kg) per il quadrato dell'altezza (m). I pazienti sono stati sottoposti dopo 12 ore di digiuno al prelievo di sangue venoso periferico per valutare alcuni parametri biochimici ed eseguire l'analisi genetica.

I livelli di insulina, GGT, CRP sono stati misurati enzimaticamente utilizzando kit disponibili in commercio, AST, ALT e glucosio utilizzando il kit di analisi colorimetrico (Amplite 13801/13803 e Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). Anche l'HOMA-IR è stato calcolato utilizzando la formula: insulina a digiuno (μU/mL) × glucosio plasmatico (mmol/L)/22,5.

L'elastografia transitoria FibroScan® (TE) è stata eseguita utilizzando la versione FibroScan® 502 (Echosens, Parigi, Francia) con sonde standard (sonde M e XL. La sonda extra large (XL) è stata utilizzata quando la distanza dalla pelle alla capsula epatica, valutata mediante ecografia, superava i 2,5 cm e/o quando il BMI era >30. FibroScan® è stato eseguito da un medico esperto ottenendo dieci misurazioni accettabili, definite come una misurazione della rigidità epatica (LS) riuscita, con il numero massimo di tentativi fissato a 20. I criteri proposti da Boursier et al. sono stati utilizzati per considerare la misurazione "molto affidabile" (IQR/M ≤ 0:1), "affidabile" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 o IQR/M > 0:3 con mediana LS < 7:1 kPa), o "scarsamente affidabile" (IQR/M > 0:3 con mediana LS ≥ 7:1 kPa). Sulla base di questi punteggi CAP, i ricercatori hanno classificato i pazienti arruolati in S0, nessuna steatosi (0%-10% di grassi; 0-237 dB/m); S1, steatosi lieve (11%-33% di grassi; 238-259 dB/m); S2, steatosi moderata (34%-66% di grassi; 260-292 dB/m); e S3, steatosi grave (>67% di grasso; ≥293 dB/m) secondo il calcolo dell'attenuazione dei segnali ultrasonici utilizzato per TE.

Il test TBARS è stato eseguito utilizzando 10 μl di siero. Il cromogeno TBARS è stato quantificato utilizzando uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 532 nm con 1,1,3,3-tetrametossiprofano come standard. La quantità di TBARS è stata espressa come nmol/μg di proteine. I dati presentati sono la media ± deviazione standard, risultante da tre esperimenti indipendenti.

L'estrazione del DNA genomico da campioni di sangue periferico è stata eseguita utilizzando il kit di estrazione PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen di Life Technologies, USA). La quantità di DNA di ciascun campione è stata valutata mediante spettrofotometro (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) utilizzando una lunghezza d'onda di 260 nm. La presenza di contaminazione del campione è stata valutata utilizzando una lunghezza d'onda di 280 nm e tutto il campione ha mostrato un buon grado di purezza poiché il rapporto 260/280 era compreso tra 1,8 e 2. Il DNA estratto è stato quindi conservato in congelatore a -20°C fino al l'analisi dei polimorfismi.

L'analisi dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs), utilizzando il codice di accesso alla banca dati TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), è stata eseguita utilizzando il DNA genotyping RealTime PCR con TaqMan (Applied Biosystem) c_89463510_10 per SNP 1, c_8716820_10 per SNP 2, c_7241_10 per SNP 3 sonde. Tutte le valutazioni sono state effettuate in tre fasi: amplificazione PCR del DNA, identificazione allelica e analisi del punto finale con curva di melting.

La prima fase è stata eseguita utilizzando la DNA polimerasi AmpliTaq Gold® contenuta nel TaqMan Universal PCR Master Mix amplificando la sequenza target mediante primer specifici contenuti nel SNP Genotyping Assay 40X insieme alle sonde TaqMan® MGB: una marcata con fluorocromo VIC® che riconosce la sequenza dell'allele 1 e un'altra sonda marcata con fluorocromo FAM™ che riconoscono la sequenza dell'allele 2. Per ogni esperimento è stata utilizzata una piastra da 48 pozzetti, nella quale, una parte dei campioni biologici di genotipo sconosciuto per l'analisi SNP, sono stati analizzati tre diversi controlli negativi al fine di evitare possibili errori dovuti alla contaminazione dei campioni. Ogni esperimento è stato fatto in triplice copia. Le amplificazioni sono state eseguite utilizzando il sistema PCR in tempo reale StepOne™ (Applied Biosystems). La valutazione della genotipizzazione si basa sulla discriminazione allelica grazie a una diversa fluorescenza del primer genico specifico, utilizzando due sonde MGB TaqMan®, marcate in 5' con un diverso fluorocromo: SNP1 in reverse G in VIC® e A in FAM™; SNIP2 in Do avanti in VIC® e T in FAM™; SNIP3 in DO avanti in VIC® e SOL in FAM™. Per l'analisi dei risultati il ​​software StepOne™2.0 era usato. Dopo la differenziazione della fluorescenza effettuata dalle sonde al fondo in ciascun pozzetto, misura le intensità del segnale normalizzato (Rn) proiettando i risultati in grafico di discriminazione allelica. Il software assegna ai campioni un genotipo specifico basato sulla posizione del segnale di fluorescenza: asse orizzontale (allele uno), asse verticale (allele 2) asse diagonale (sia allele uno che allele due). La prevalenza di una fluorescenza specifica sull'altra identificava il genotipo dell'omozigosi, al contrario la presenza di entrambe le eterozigosi.

Analisi statistica Il numero di pazienti (30 nel gruppo di controllo wild-type con NAFLD, 30 nel wild-type trattato con NAFLD e 32 in quelli mutati trattati con NAFLD) è stato calcolato utilizzando la funzione di calcolo della potenza e della dimensione del campione di STATA-14® per mac- OS, sulla base di una differenza attesa tra i gruppi di studio nella risposta dell'HOMA-IR alla terapia, assumendo una quantità doppia di pazienti responder alla terapia nel gruppo wild type rispetto a quello mutato. In particolare, i ricercatori hanno considerato i pazienti responder se almeno uno dei seguenti criteri è stato affrontato: normalizzazione dell'HOMA-IR (

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il programma statistico per le scienze sociali (SPSS®) vs.18.0.