Wirkung der genetischen Varianten PNPLA3, TM6SF2 und MBOAT7 auf das therapeutische Ergebnis der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung.

Das Ziel dieser Studie war es zu bewerten, ob PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 und MBOAT7 rs641738 die Reaktion von NAFLD-Patienten auf eine Behandlung mit 303 mg des Silybin-Phospholipid-Komplexes in Bezug auf Stoffwechselparameter, Leberschäden und Leberfettansammlungen beeinflussen könnten, 10 mg Vitamin D und 15 mg Vitamin E zweimal täglich für sechs Monate.

Die Ermittler führten einen Baseline-Vergleich von Gewicht, Waist-to-Height-Ratio (WHtR), Blutdruckmessung, Body-Mass-Index (BMI), Blutzucker und Insulin, dem homöostatischen Modell zur Beurteilung der Insulinresistenz (HOMA-IR), Aspartat und Aspartat durch Alanin-Aminotransferase (AST, ALT), Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT), Blutbild, C-reaktives Protein (CRP), die Thiobarbitursäure-reaktive Substanz (TBARS), Lebersteifigkeit und kontrollierter Attenuierungsparameter (CAP) unter den drei Studiengruppen: NAFLD-Wildtyp-Kontrollgruppe (n. 30), mit NAFLD behandelte Wildtypgruppe (n. 30), mit NAFLD behandelte mutierte Gruppe (n. 32). Die Block-Randomisierungsmethode wurde verwendet, um die 60 nicht mutierten Patienten in der NAFLD-Wildtyp-Kontrollgruppe und der NAFLD-behandelten Wildtyp-Gruppe unter Verwendung der Online-Randomisierungssoftware http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm zu randomisieren.

Die Wildtyp-Kontrollgruppe bestand aus NAFLD-Patienten ohne PNPLA3-, TM6SF2- und MBOAT7-Mutationen, die während des Studienzeitraums keinerlei Behandlung erhielten.

Die Patienten, die in die NAFLD-behandelten Wildtyp- und NAFLD-behandelten mutierten Gruppen eingefügt wurden, wurden einer oralen Verabreichung von 303 mg Silybin-Phospholipid-Komplex, 10 mg Vitamin D und 15 mg Vitamin E unterzogen, zweimal täglich für sechs Monate. Keiner der eingeschlossenen Patienten brach die Studie ab.

Am Ende der Behandlung wurde die Bewertung von WHtR, Blutdruckmessung, BMI, Blutzucker und Insulin, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, Blutbild, CRP, TBARS, Lebersteifheit und CAP erneut durchgeführt. Während der experimentellen Beobachtung erhielten die Patienten auf der Grundlage ihrer Ernährungsgewohnheiten vor der Aufnahme eine kostenlose Diät, und jede Art von körperlicher Betätigung wurde während des Studienzeitraums empfohlen. Die Nahrungsaufnahme wurde sowohl zu Beginn als auch am Ende der Behandlung unter Verwendung einer computergestützten Software bewertet. Die Ermittler erfassten mit einem Ernährungstagebuch die Nahrungsaufnahme einer kompletten Woche, einschließlich der Arbeitstage und des Wochenendes. Auf der Grundlage der Mengen und Qualitäten der verzehrten Lebensmittel berechnet soft die tägliche Energieaufnahme und den Prozentsatz/Kaloriengehalt der Makronährstoffe. Für die Bewertung der körperlichen Aktivität reichten die Forscher zu Beginn und am Ende der Behandlung einen spezifischen Fragebogen mit einigen einfachen Fragen ein: Treibt der Teilnehmer oder hat der Teilnehmer jemals (in den letzten zwei Jahren) Sport auf eine kontinuierliche und regelmäßige Weise gemacht? Hat der Teilnehmer seine tägliche körperliche Aktivität in den letzten sechs Monaten geändert? 1: nein, 2: ja; Wenn ja, hat sich die körperliche Aktivität erhöht oder verschlechtert? Der Alkoholkonsum wurde zu Beginn und am Ende der Behandlung erhoben. 102 Patienten mit histologischer NAFLD-Diagnose, gefolgt von der Abteilung für Hepatogastroenterologie der Universität Kampanien „Luigi Vanvitelli“, wurden zwischen Januar und Oktober 2017 nach Unterzeichnung einer Einverständniserklärung auf die genetischen Varianten PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 und MBOAT7 rs641738 untersucht Zweiunddreißig erfüllten die Einschlusskriterien für die Studie und zeigten mindestens eine der genetischen Varianten PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K und MBOAT7 TMC4C/T oder TMC4T/T und wurden zusammen mit sechzig aufgenommen Patienten ohne die Mutationen. Zehn Patienten wurden aufgrund des gleichzeitigen Vorliegens mehrerer Komorbiditäten und/oder fortgeschrittener Lebererkrankungen wie Leberzirrhose und/oder hepatozellulärem Karzinom (HCC) von der Aufnahme ausgeschlossen.

Die Definition des Vorliegens/Fehlens von NAFLD und das Staging wurden anhand einer Leberbiopsie, serologischer Tests und Erhebung klinischer Daten beurteilt. Anamnese, Alkoholkonsum (AUDIT-C), Medikamente, Drogenmissbrauch, Rauchgewohnheiten wurden ebenfalls erhoben. Blutdruck, Gewicht, Größe wurden direkt gemessen und WHtR berechnet. Der BMI wurde auch berechnet, indem das Gewicht (kg) durch das Quadrat der Körpergröße (m) dividiert wurde. Die Patienten wurden nach 12 Stunden nüchtern einer peripheren venösen Blutentnahme unterzogen, um einige biochemische Parameter auszuwerten und die genetische Analyse durchzuführen.

Insulin-, GGT-, CRP-Spiegel wurden enzymatisch unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits, AST, ALT und Glukose unter Verwendung eines kolorimetrischen Assay-Kits (Amplite 13801/13803 und Thermo Fisher Scientific EIAGLUC) gemessen. HOMA-IR wurde auch mit folgender Formel berechnet: Nüchterninsulin (μU/ml) × Plasmaglukose (mmol/l)/22,5.

Die transiente FibroScan® Elastographie (TE) wurde unter Verwendung des FibroScan® Version 502 (Echosens, Paris, Frankreich) mit Standardsonden (M- und XL-Sonden) durchgeführt. Die extragroße (XL) Sonde wurde verwendet, wenn der Abstand von der Haut zur Leberkapsel, gemessen durch Ultraschall, mehr als 2,5 cm betrug und/oder wenn der BMI > 30 war. FibroScan® wurde von einem erfahrenen Arzt durchgeführt, der zehn akzeptable Messungen erhielt, die als erfolgreiche Messung der Lebersteifigkeit (LS) definiert wurden, wobei die maximale Anzahl von Versuchen auf 20 festgelegt wurde. Die von Boursier et al. wurden verwendet, um die Messung als „sehr zuverlässig“ (IQR/M ≤ 0:1), „zuverlässig“ (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 oder IQR/M > 0:3 mit LS-Median < 7:1) einzustufen kPa) oder „wenig zuverlässig“ (IQR/M > 0:3 mit LS-Median ≥ 7:1 kPa). Auf der Grundlage dieser CAP-Werte klassifizierten die Forscher die eingeschlossenen Patienten in S0, keine Steatose (0 %–10 % Fett; 0–237 dB/m); S1, leichte Steatose (11 %–33 % Fett; 238–259 dB/m); S2, mäßige Steatose (34 %–66 % Fett; 260–292 dB/m); und S3, schwere Steatose (>67 % Fett; ≥293 dB/m) in Übereinstimmung mit der Berechnung der Dämpfung von Ultraschallsignalen, die für TE verwendet werden.

Der TBARS-Assay wurde unter Verwendung von 10 &mgr;l Serum durchgeführt. Das Cromogen-TBARS wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 532 nm mit 1,1,3,3-Tetramethoxypropan als Standard quantifiziert. Die Menge an TBARS wurde als nmol/μg Protein ausgedrückt. Die präsentierten Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung, resultierend aus drei unabhängigen Experimenten.

Die genomische DNA-Extraktion aus peripheren Blutproben wurde unter Verwendung des Extraktionskits PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen von Life Technologies, USA) durchgeführt. Die DNA-Menge jeder Probe wurde mit einem Spektrophotometer (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Das Vorhandensein einer Probenkontamination wurde unter Verwendung einer 280-nm-Wellenlängenbewertung bewertet, und alle Proben zeigten einen guten Reinheitsgrad, da das 260/280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2 lag. Die extrahierte DNA wurde dann in einem Gefrierschrank bei –20 °C gelagert die Analyse der Polymorphismen.

Die Analyse der Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) unter Verwendung des Zugangscodes zur Datenbank TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3) wurde unter Verwendung der DNA-Genotypisierung RealTime PCR mit TaqMan (Applied Biosystem) durchgeführt. c_89463510_10 für SNP 1, c_8716820_10 für SNP 2, c_7241_10 für SNP 3-Sonden. Alle Bewertungen wurden in drei Phasen durchgeführt: DNA-PCR-Amplifikation, allelische Identifizierung und Endpunktanalyse mit Schmelzkurve.

In der ersten Phase wurde die im TaqMan Universal PCR Master Mix enthaltene AmpliTaq Gold® DNA-Polymerase verwendet, die die Zielsequenz durch spezifische Primer amplifizierte, die im SNP Genotyping Assay 40X zusammen mit TaqMan® MGB-Sonden enthalten waren: eine mit Fluorochrom VIC® markierte Erkennung die Sequenz des Allels 1 und eine weitere mit Fluorochrom FAM™ markierte Sonde, die die Sequenz des Allels 2 erkennt. Für jedes Experiment wurde eine 48-Well-Platte verwendet, in der ein Teil der biologischen Proben unbekannten Genotyps für die SNP-Analyse, drei verschiedene Negativkontrollen wurden analysiert, um mögliche Fehler aufgrund von Probenkontaminationen zu vermeiden. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Amplifikationen wurden mit dem StepOne™ Real Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Genotypisierungsbewertung basiert auf der allelischen Unterscheidung dank einer unterschiedlichen Fluoreszenz des spezifischen Genprimers unter Verwendung von zwei MGB TaqMan®-Sonden, die an 5' mit einem unterschiedlichen Fluorochrom markiert sind: SNP1 in umgekehrtem G in VIC® und A in FAM™; SNIP2 in Weiterleitung C in VIC® und T in FAM™; SNIP3 in Weiterleitung C in VIC® und G in FAM™. Für die Ergebnisanalyse wird die Software StepOne™2.0 verwendet wurde benutzt. Nach der Differenzierung der Fluoreszenz, die von den Sonden zum Hintergrund in jeder Vertiefung gemacht wird, misst es die normalisierten Signalintensitäten (Rn) und projiziert die Ergebnisse in ein Allel-Diskriminierungsdiagramm. Die Software gibt den Proben einen spezifischen Genotyp basierend auf der Position des Fluoreszenzsignals: horizontale Achse (Allel eins), vertikale Achse (Allel 2), diagonale Achse (beide Allele eins und zwei). Das Vorherrschen einer spezifischen Fluoreszenz auf der anderen Seite identifiziert den Homozygotie-Genotyp, im Gegensatz dazu das Vorhandensein von beiden die Heterozygotie.

Statistische Analyse Die Anzahl der Patienten (30 in der NAFLD-Wildtyp-Kontrollgruppe, 30 in der NAFLD-behandelten Wildtyp- und 32 in NAFLD-behandelten mutierten) wurde unter Verwendung der Power- und Sample-Size-Berechnungsfunktion von STATA-14® für Mac- OS, basierend auf einem erwarteten Unterschied zwischen den Studiengruppen in der Reaktion des HOMA-IR auf die Therapie, unter der Annahme einer doppelten Menge an Patienten, die auf die Therapie in der Wildtypgruppe im Vergleich zu der mutierten Gruppe ansprechen. Insbesondere betrachteten die Forscher den Patienten als Responder, wenn mindestens eines der folgenden Kriterien angesprochen wurde: Normalisierung des HOMA-IR (

Statistische Analysen wurden mit dem Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0 durchgeführt.