Geneettisten PNPLA3-, TM6SF2- ja MBOAT7-muunnosten vaikutus alkoholittomien rasvamaksasairauksien hoitotuloksiin.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida, voisivatko PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 ja MBOAT7 rs641738 vaikuttaa NAFLD-potilaiden vasteeseen aineenvaihduntaparametrien, maksavaurioiden ja maksan rasvan kertymisen suhteen hoidossa, jossa on 303 mg pholisilybiinikompleksia mg D-vitamiinia ja 15 mg E-vitamiinia kahdesti päivässä kuuden kuukauden ajan.

Tutkijat suorittivat painon, vyötärön ja pituuden suhteen (WHtR), verenpainemittauksen, painoindeksin (BMI), verensokerin ja insuliinin, insuliiniresistenssin arvioinnin homeostaattisen mallin (HOMA-IR), aspartaatin ja alaniiniaminotransferaasi (AST, ALT), gammaglutamyylitransferaasi (GGT), verenkuva, C-reaktiivinen proteiini (CRP), tiobarbituurihapporeaktiivinen aine (TBARS), maksan jäykkyys ja kontrolloitu vaimennusparametri (CAP) kolmen tutkimusryhmän joukossa: NAFLD villityypin kontrolliryhmä (n. 30), NAFLD-käsitelty villityypin ryhmä (n. 30), NAFLD-käsitelty mutatoitu ryhmä (n. 32). Lohkosatunnaistusmenetelmää käytettiin satunnaistamaan 60 potilasta, joilla ei ollut mutatoituja NAFLD-villityypin kontrolliryhmässä ja NAFLD-hoidossa villityypin yksi, käyttämällä online-satunnaistusohjelmistoa http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Villityypin kontrolliryhmä koostui NAFLD-potilaista, joilla ei ollut PNPLA3-, TM6SF2- ja MBOAT7-mutaatioita ja jotka eivät saaneet minkäänlaista hoitoa tutkimusjakson aikana.

Potilaille, jotka oli lisätty NAFLD:llä hoidettuun villityypin ja NAFLD:llä hoidettuun mutatoituneeseen ryhmiin, annettiin suun kautta 303 mg silybiini-fosfolipidikompleksia, 10 mg D-vitamiinia ja 15 mg E-vitamiinia kahdesti päivässä kuuden kuukauden ajan. Yksikään tutkimukseen osallistuneista potilaista ei keskeyttänyt tutkimusta.

Hoidon lopussa suoritettiin uudelleen WHtR, verenpaineen mittaus, BMI, verensokeri ja insuliini, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, verenkuva, CRP, TBARS, maksan jäykkyys ja CAP. Kokeellisen havainnoinnin aikana potilaat olivat ruokailutottumusten perusteella ilmaisella ruokavaliolla ennen ilmoittautumista ja kaikenlaista liikuntaa suositeltiin tutkimusjakson aikana. Ruoan saanti arvioitiin sekä lähtötilanteessa että hoidon lopussa tietokoneohjelmistolla. Tutkijat kirjasivat ruokavaliopäiväkirjaan koko viikon ruokailun, mukaan lukien työpäivät ja viikonlopun. Pehmeä määrittelee kulutetun ruoan määrien ja ominaisuuksien perusteella päivittäisen energiansaannin ja makroravinteiden prosenttiosuuden/kalorimäärän. Fyysisen harjoituksen arviointia varten tutkijat lähettivät hoidon alussa ja lopussa erityisen kyselylomakkeen, jossa oli muutamia yksinkertaisia ​​kysymyksiä: Harrastaako osallistuja tai onko osallistuja koskaan harrastanut (viimeisten kahden vuoden aikana) urheilua jatkuvasti ja säännöllisesti? Onko osallistuja muuttanut päivittäistä fyysistä aktiivisuuttaan viimeisen kuuden kuukauden aikana? 1: ei, 2: kyllä; jos kyllä, onko fyysinen aktiivisuus lisääntynyt tai huonontunut? Alkoholin kulutus arvioitiin hoidon alussa ja lopussa. Sadakahdelle potilaalle, joilla oli histologinen NAFLD-diagnoosi, jota seurasi Campanian yliopiston hepatogastroenterologian osasto "Luigi Vanvitelli, tammi-lokakuussa 2017, seulottiin tietoisen suostumuksen allekirjoittamisen jälkeen PNPLA3 rs738409-, TM6SF2 rs58542926- ja MBOAT7 rs641173-geenivarianttien varalta. kolmekymmentäkaksi täytti tutkimuksen mukaanottokriteerit ja osoitti, että vähintään yksi PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K ja MBOAT7 TMC4C/T tai TMC4T/T geneettisistä varianteista oli mukana kuudenkymmenen kanssa. potilaita, joilla ei ole mutaatioita. Kymmenen potilasta suljettiin pois ilmoittautumisesta useiden samanaikaisten sairauksien ja/tai pitkälle edenneen maksasairauden, kuten kirroosin ja/tai hepatosellulaarisen karsinooman (HCC) rinnakkaiselon vuoksi.

NAFLD:n olemassaolon/puuttumisen määritelmä ja vaiheistus arvioitiin suorittamalla maksabiopsia, serologiset testit ja keräämällä kliinisiä tietoja. Myös sairaushistoria, alkoholinkäyttö (AUDIT-C), lääkkeet, huumeiden väärinkäyttö, tupakointitottumukset tutkittiin. Verenpaine, paino, pituus mitattiin suoraan ja WHtR laskettiin. BMI laskettiin myös jakamalla paino (kg) pituuden neliöllä (m). Potilaat otettiin 12 tunnin paaston jälkeen ääreislaskimoverinäytteisiin joidenkin biokemiallisten parametrien arvioimiseksi ja geneettisen analyysin suorittamiseksi.

Insuliini-, GGT-, CRP-tasot mitattiin entsymaattisesti käyttämällä kaupallisesti saatavia kittejä, AST:ta, ALT:tä ja glukoosia käyttäen kolorimetristä määrityspakkausta (Amplite 13801/13803 ja Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR laskettiin myös käyttämällä kaavaa: paastoinsuliini (μU/ml) × plasman glukoosi (mmol/l)/22,5.

FibroScan®-transientti elastografia (TE) suoritettiin käyttämällä FibroScan®-versiota 502 (Echosens, Pariisi, Ranska) standardikoettimilla (M- ja XL-koettimet). Erittäin suurta (XL) koetinta käytettiin, kun etäisyys ihosta maksakapseliin ultraäänellä arvioituna ylitti 2,5 cm ja/tai kun BMI oli >30. Asiantuntijalääkäri suoritti FibroScan®-testin saamalla kymmenen hyväksyttävää mittausta, jotka määriteltiin onnistuneeksi maksan jäykkyyden (LS) mittaukseksi, ja yritysten enimmäismääräksi asetettiin 20. Boursier et al.:n ehdottamat kriteerit. mittausta käytettiin pitämään mittausta "erittäin luotettavana" (IQR/M ≤ 0:1), "luotettavana" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 tai IQR/M > 0:3 LS-mediaanin ollessa < 7:1 kPa) tai "heikosti luotettava" (IQR/M > 0:3 ja LS-mediaani ≥ 7:1 kPa). Näiden CAP-pisteiden perusteella tutkijat luokittelivat tutkimukseen osallistuneet potilaat luokkaan S0, ei steatoosia (0-10 % rasvaa; 0-237 dB/m); S1, lievä steatoosi (11–33 % rasvaa; 238–259 dB/m); S2, kohtalainen steatoosi (34–66 % rasvaa; 260–292 dB/m); ja S3, vaikea steatoosi (> 67 % rasvaa; ≥ 293 dB/m) TE:ssä käytettyjen ultraäänisignaalien vaimennuslaskelman mukaisesti.

TBARS-määritys suoritettiin käyttämällä 10 μl seerumia. Kromogeeni TBARS kvantifioitiin käyttämällä spektrofotometriä aallonpituudella 532 nm käyttäen 1,1,3,3-tetrametoksipropaania standardina. TBARS:n määrä ilmaistiin nmol/μg proteiinia. Esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± standardipoikkeama, jotka on saatu kolmesta riippumattomasta kokeesta.

Genomisen DNA:n uuttaminen perifeerisistä verinäytteistä suoritettiin käyttämällä uuttosarjaa PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen, Life Technologies, USA). Kunkin näytteen DNA-määrä arvioitiin spektrofotometrillä (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) käyttämällä aallonpituutta 260 nm. Näytteen kontaminaation esiintyminen arvioitiin käyttämällä 280 nm:n aallonpituuden arviointia ja kaikki näytteet osoittivat hyvää puhtausastetta, koska suhde 260/280 oli välillä 1,8 ja 2. Uutettua DNA:ta säilytettiin sitten -20°C pakastimessa kunnes polymorfismien analyysi.

Yhden nukleotidin polymorfismien (SNP) analyysi, jossa käytettiin pääsykoodia tietopankkiin TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), suoritettiin DNA-genotyypitysmenetelmällä RealTime PCR (PCR) TaqManin kanssa. c_89463510_10 SNP 1:lle, c_8716820_10 SNP 2:lle, c_7241_10 SNP 3:lle. Kaikki arvioinnit tehtiin kolmessa vaiheessa: DNA PCR -amplifikaatio, alleelitunnistus ja loppupisteanalyysi sulamiskäyrällä.

Ensimmäinen vaihe tehtiin käyttämällä TaqMan Universal PCR Master Mixin sisältämää AmpliTaq Gold® DNA -polymeraasia, joka monistaa kohdesekvenssin spesifisillä SNP Genotyping Assay 40X:n sisältämillä alukkeilla yhdessä TaqMan® MGB -koettimien kanssa: yksi oli merkitty fluorokromi VIC®:llä, joka tunnistaa. alleelin 1 sekvenssi ja toinen fluorokromi FAM™:lla merkitty koetin, joka tunnistaa alleelin 2 sekvenssin. Jokaiseen kokeeseen käytettiin 48-kuoppaista levyä, jossa osa tuntemattoman genotyypin biologisista näytteistä SNP-analyysiä varten, kolme erilaista negatiivista kontrollia analysoitiin mahdollisten näytteiden kontaminaatiosta johtuvien virheiden välttämiseksi. Jokainen koe tehtiin kolmena kappaleena. Monistukset suoritettiin käyttämällä StepOne™ Real Time PCR -järjestelmää (Applied Biosystems). Genotyypityksen arviointi perustuu alleeliseen erotteluun spesifisen geenialukkeen erilaisen fluoresenssin ansiosta käyttämällä kahta MGB TaqMan® -koetinta, jotka on merkitty 5':ssä eri fluorokromilla: SNP1 käänteisessä G:ssä VIC®:ssä ja A FAM™:ssa; SNIP2 eteenpäin C:ssä VIC®:ssä ja T FAM™:ssa; SNIP3 eteenpäin C:ssä VIC®:ssä ja G FAM™:ssa. Tulosten analysointia varten ohjelmisto StepOne™2.0 käytettiin. Sen jälkeen kun koettimista tehty fluoresenssi on erotettu taustalle kussakin kuopassa, se mittaa normalisoidut signaalin intensiteetit (Rn) projisoiden tulokset alleelisen erottelun kuvaajassa. Ohjelmisto antaa näytteille tietyn genotyypin fluoresenssisignaalin sijainnin perusteella: vaaka-akseli (alleeli yksi), pystyakseli (alleeli 2) diagonaaliakseli (sekä alleeli yksi että kaksi). Spesifisen fluoresenssin esiintyvyys toisessa tunnisti homotsygoosin genotyypin, päinvastoin molempien heterotsygoosien läsnäolo.

Tilastollinen analyysi Potilaiden lukumäärä (30 NAFLD:llä hoidetussa villityypin kontrolliryhmässä, 30 NAFLD:llä hoidetulla villityypillä ja 32 NAFLD:llä hoidetuilla mutatoituneilla potilailla) laskettiin käyttämällä STATA-14®:n tehon ja näytteen koon laskentafunktiota mac- OS, perustuen odotettuun eroon tutkimusryhmien välillä HOMA-IR:n vasteessa terapiaan, olettaen, että villityypin ryhmässä on kaksinkertainen määrä potilaiden vastetta hoitoon verrattuna mutatoituneeseen. Erityisesti tutkijat pitivät potilaita vasteena, jos vähintään yksi seuraavista kriteereistä täyttyi: HOMA-IR:n normalisoituminen (

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Statistical Program for Social Sciences (SPSS®) vs.18.0.