Effet des variants génétiques PNPLA3, TM6SF2 et MBOAT7 sur le résultat thérapeutique de la stéatose hépatique non alcoolique.

Le but de cette étude était d'évaluer si le PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 et MBOAT7 rs641738 pouvaient influencer la réponse des patients NAFLD concernant les paramètres métaboliques, les dommages hépatiques et ceux de l'accumulation de graisse hépatique, à un traitement avec 303 mg de complexe silybine-phospholipides, 10 mg de vitamine D et 15 mg de vitamine E deux fois par jour pendant six mois.

Les enquêteurs ont effectué une comparaison de base du poids, du rapport taille-taille (WHtR), de la mesure de la pression artérielle, de l'indice de masse corporelle (IMC), de la glycémie et de l'insuline, du modèle homéostatique pour l'évaluation de la résistance à l'insuline (HOMA-IR), de l'aspartate et alanine aminotransférase (AST, ALT), gamma-glutamyl transférase (GGT), formule sanguine, protéine C réactive (CRP), substance réactive à l'acide thiobarbiturique (TBARS), rigidité hépatique et paramètre d'atténuation contrôlée (CAP) parmi les trois groupes d'étude : Groupe de contrôle de type sauvage NAFLD (n. 30), groupe de type sauvage traité NAFLD (n. 30), groupe muté traité NAFLD (n. 32). La méthode de randomisation en bloc a été utilisée pour randomiser les 60 patients non mutés dans le groupe témoin de type sauvage NAFLD et le groupe de type sauvage traité par NAFLD, en utilisant le logiciel de randomisation en ligne http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Le groupe témoin de type sauvage était composé de patients NAFLD sans mutations PNPLA3, TM6SF2 et MBOAT7 qui n'ont reçu aucun type de traitement pendant la période d'étude.

Les patients insérés dans les groupes de type sauvage traité par NAFLD et muté traité par NAFLD ont été soumis à une administration orale de 303 mg de complexe silybine-phospholipide, 10 mg de vitamine D et 15 mg de vitamine E, deux fois par jour pendant six mois. Aucun des patients inscrits n'a abandonné l'étude.

À la fin du traitement, l'évaluation de la WHtR, de la mesure de la pression artérielle, de l'IMC, de la glycémie et de l'insuline, de l'HOMA-IR, de l'AST, de l'ALT, de la GGT, de la numération globulaire, de la CRP, de la TBARS, de la raideur hépatique et de la CAP a été refaite. Au cours de l'observation expérimentale, les patients suivaient un régime alimentaire libre sur la base de leurs habitudes alimentaires avant l'inscription et tout type d'exercice physique était recommandé pendant la période d'étude. La prise alimentaire a été évaluée à la fois au début et à la fin du traitement à l'aide d'un logiciel informatisé. Les enquêteurs ont enregistré, avec un journal alimentaire, les apports alimentaires d'une semaine complète, y compris les jours ouvrables et le week-end. Sur la base des quantités et qualités d'aliments consommés, le soft élabore l'apport énergétique journalier et le pourcentage/quantité calorique de macronutriments. Pour l'évaluation de l'exercice physique, les investigateurs ont soumis un questionnaire spécifique au départ et à la fin du traitement avec quelques questions simples : Le participant fait-il ou a-t-il déjà fait (au cours des deux dernières années) du sport de manière continue et régulière ? Le participant a-t-il changé son activité physique quotidienne au cours des six derniers mois ? 1 : non, 2 : oui ; Si oui, l'activité physique s'est-elle améliorée ou aggravée ? La consommation d'alcool a été évaluée au début et à la fin du traitement. Cent deux patients avec un diagnostic histologique de NAFLD suivis par la division d'hépatogastroentérologie de l'Université de Campanie "Luigi Vanvitelli, entre janvier et octobre 2017 ont été dépistés, après avoir signé un consentement éclairé, pour les variantes génétiques PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 et MBOAT7 rs641738 et trente-deux remplissaient les critères d'inclusion de l'étude et montraient qu'au moins un parmi les variants génétiques PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K et MBOAT7 TMC4C/T ou TMC4T/T, étaient inclus avec soixante patients sans mutations. Dix patients ont été exclus du recrutement en raison de la coexistence de plusieurs comorbidités et/ou d'une maladie hépatique avancée telle qu'une cirrhose et/ou un carcinome hépatocellulaire (CHC).

La définition de la présence/absence de NAFLD et la stadification ont été évaluées en réalisant une biopsie hépatique, des tests sérologiques et en recueillant des données cliniques. Les antécédents médicaux, la consommation d'alcool (AUDIT-C), les médicaments, l'abus de drogues, les habitudes tabagiques ont également été étudiés. La pression artérielle, le poids, la taille ont été directement mesurés et le WHtR a été calculé. L'IMC a également été calculé en divisant le poids (kg) par le carré de la taille (m). Les patients ont été soumis après 12 heures de jeûne à des prélèvements sanguins veineux périphériques afin d'évaluer certains paramètres biochimiques et d'effectuer l'analyse génétique.

Les niveaux d'insuline, de GGT, de CRP ont été mesurés par voie enzymatique à l'aide de kits disponibles dans le commerce, AST, ALT et glucose à l'aide d'un kit de dosage colorimétrique (Amplite 13801/13803 et Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR a également été calculé à l'aide de la formule : insuline à jeun (μU/mL) × glucose plasmatique (mmol/L)/22,5.

L'élastographie transitoire (ET) FibroScan® a été réalisée à l'aide du FibroScan® version 502 (Echosens, Paris, France) avec des sondes standards (sondes M et XL. La sonde extra large (XL) était utilisée lorsque la distance de la peau à la capsule hépatique, évaluée par échographie, dépassait 2,5 cm et/ou lorsque l'IMC était > 30. Le FibroScan® a été réalisé par un médecin expert obtenant dix mesures acceptables, définies comme une mesure réussie de la rigidité hépatique (LS), avec un nombre maximum de tentatives fixé à 20. Les critères proposés par Boursier et al. ont été utilisés pour considérer la mesure "très fiable" (IQR/M ≤ 0:1), "fiable" (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 ou IQR/M > 0:3 avec LS médian < 7:1 kPa), ou "peu fiable" (IQR/M > 0:3 avec médiane LS ≥ 7:1 kPa). Sur la base de ces scores CAP, les investigateurs ont classé les patients inscrits en S0, pas de stéatose (0%-10% graisse ; 0-237 dB/m) ; S1, stéatose légère (11 %-33 % de matières grasses ; 238-259 dB/m) ; S2, stéatose modérée (34 % à 66 % de matières grasses ; 260 à 292 dB/m) ; et S3, stéatose sévère (> 67 % graisse ; ≥ 293 dB/m) conformément au calcul de l'atténuation des signaux ultrasonores utilisé pour l'ET.

Le dosage TBARS a été réalisé en utilisant 10 μl de sérum. Le chromogène TBARS a été quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 532 nm avec du 1,1,3,3-tétraméthoxyprophane comme standard. La quantité de TBARS a été exprimée en nmol/μg de protéine. Les données présentées sont la moyenne ± écart type, résultant de trois expériences indépendantes.

L'extraction de l'ADN génomique à partir d'échantillons de sang périphérique a été réalisée à l'aide du kit d'extraction PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen by Life Technologies, USA). La quantité d'ADN de chaque échantillon a été évaluée par spectrophotomètre (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) en utilisant une longueur d'onde de 260 nm. La présence de contamination de l'échantillon a été évaluée à l'aide d'une évaluation de longueur d'onde de 280 nm et tous les échantillons ont montré un bon degré de pureté car le rapport 260/280 était compris entre 1,8 et 2. L'ADN extrait a ensuite été stocké dans un congélateur à -20 ° C jusqu'à ce que l'analyse des polymorphismes.

L'analyse des polymorphismes mononucléotidiques (SNPs), utilisant le code d'accès à la banque de données TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3), a été réalisée à l'aide de la PCR en temps réel de génotypage ADN avec TaqMan (Applied Biosystem) c_89463510_10 pour SNP 1, c_8716820_10 pour SNP 2, c_7241_10 pour SNP 3 sondes. Toutes les évaluations ont été réalisées en trois phases : amplification par PCR de l'ADN, identification allélique et analyse du point final avec courbe de fusion.

La première phase a été réalisée en utilisant l'ADN polymérase AmpliTaq Gold® contenue dans le TaqMan Universal PCR Master Mix amplifiant la séquence cible par des amorces spécifiques contenues dans le SNP Genotyping Assay 40X avec des sondes TaqMan® MGB : une marquée avec le fluorochrome VIC® qui reconnaît la séquence de l'allèle 1 et une autre sonde marquée au fluorochrome FAM™ qui reconnaît la séquence de l'allèle 2. Pour chaque expérience une plaque 48 puits a été utilisée, dans laquelle, une partie des échantillons biologiques de génotype inconnu pour l'analyse SNP, trois contrôles négatifs différents ont été analysés afin d'éviter d'éventuelles erreurs dues à la contamination des échantillons. Chaque expérience a été réalisée en triple. Les amplifications ont été réalisées à l'aide du système de PCR en temps réel StepOne™ (Applied Biosystems). L'évaluation du génotypage est basée sur la discrimination allélique grâce à une fluorescence différente de l'amorce spécifique du gène, à l'aide de deux sondes MGB TaqMan®, marquées en 5' avec un fluorochrome différent : SNP1 en reverse G dans VIC® et A dans FAM™ ; SNIP2 en avant C dans VIC® et T dans FAM™ ; SNIP3 en avant C en VIC® et G en FAM™. Pour l'analyse des résultats, le logiciel StepOne™2.0 a été utilisé. Après la différenciation de la fluorescence faite des sondes au bruit de fond dans chaque puits, on mesure les intensités de signal normalisées (Rn) en projetant les résultats sur un tracé de discrimination allélique. Le logiciel donne aux échantillons un génotype spécifique basé sur la position du signal de fluorescence : axe horizontal (allèle un), axe vertical (allèle 2) axe diagonal (allèle un et deux). La prévalence d'une fluorescence spécifique sur l'autre identifiait le génotype homozygote, au contraire la présence des deux hétérozygotes.

Analyse statistique Le nombre de patients (30 dans le groupe témoin de type sauvage NAFLD, 30 dans le groupe de type sauvage traité par NAFLD et 32 ​​dans les patients mutés traités par NAFLD) a été calculé à l'aide de la fonction de calcul de puissance et de taille d'échantillon de STATA-14® pour mac- OS, sur la base d'une différence attendue entre les groupes d'étude dans la réponse de l'HOMA-IR à la thérapie, en supposant une double quantité de patients répondeurs à la thérapie dans le groupe de type sauvage par rapport au groupe muté. Plus précisément, les investigateurs ont considéré les patients répondeurs si au moins un des critères suivants était pris en compte : normalisation de l'HOMA-IR (

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du programme statistique pour les sciences sociales (SPSS®) vs.18.0.