Влияние генетических вариантов PNPLA3, TM6SF2 и MBOAT7 на терапевтический исход неалкогольной жировой болезни печени.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить, могут ли PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 и MBOAT7 rs641738 влиять на реакцию пациентов с НАЖБП в отношении метаболических параметров, повреждения печени и накопления жира в печени на лечение 303 мг силибин-фосфолипидного комплекса, 10 мг витамина D и 15 мг витамина Е два раза в день в течение шести месяцев.

Исследователи выполнили базовое сравнение веса, отношения талии к росту (WHtR), измерения артериального давления, индекса массы тела (ИМТ), уровня глюкозы в крови и инсулина, гомеостатической модели для оценки резистентности к инсулину (HOMA-IR), аспартата и аланинаминотрансфераза (АСТ, АЛТ), гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ), анализ крови, С-реактивный белок (СРБ), вещество, реагирующее с тиобарбитуровой кислотой (ТБАРС), жесткость печени и параметр контролируемого ослабления (КАП) среди трех исследуемых групп: Контрольная группа НАЖБП дикого типа (n. 30), группа дикого типа, получавшая лечение НАЖБП (n. 30), группа мутантов, получавших лечение НАЖБП (n. 32). Метод блочной рандомизации был использован для рандомизации 60 пациентов без мутаций в контрольной группе дикого типа с НАЖБП и группе дикого типа, получавшей лечение с НАЖБП, с использованием программного обеспечения для онлайн-рандомизации http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm.

Контрольная группа дикого типа состояла из пациентов с НАЖБП без мутаций PNPLA3, TM6SF2 и MBOAT7, которые не получали никакого лечения в течение периода исследования.

Пациенты, включенные в группы дикого типа, получавшие лечение НАЖБП, и мутантные группы, получавшие лечение НАЖБП, подвергались пероральному введению 303 мг силибин-фосфолипидного комплекса, 10 мг витамина D и 15 мг витамина Е два раза в день в течение шести месяцев. Ни один из включенных в исследование пациентов не выбыл из исследования.

В конце лечения повторно проводилась оценка WHtR, измерение артериального давления, ИМТ, уровня глюкозы и инсулина в крови, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, анализа крови, CRP, TBARS, жесткости печени и CAP. В ходе экспериментального наблюдения пациенты находились на свободном питании на основании пищевых привычек до включения в исследование, а в период исследования им рекомендовались любые виды физических упражнений. Потребление пищи оценивали как в начале, так и в конце лечения с использованием компьютеризированного программного обеспечения. Исследователи записали в дневник диеты потребление пищи за всю неделю, включая рабочие дни и выходные. На основе количества и качества потребляемой пищи программа рассчитывает дневное потребление энергии и процентное/калорийное количество макронутриентов. Для оценки физических упражнений исследователи представили специальную анкету в начале и в конце лечения с несколькими простыми вопросами: Занимается ли участник или занимался ли он когда-либо (за последние два года) спортом на постоянной и регулярной основе? Изменил ли участник свою ежедневную физическую активность за последние шесть месяцев? 1: нет, 2: да; если да, увеличилась или ухудшилась физическая активность? Употребление алкоголя оценивали в начале и в конце лечения. Сто два пациента с гистологическим диагнозом НАЖБП, наблюдавшиеся в отделении гепатогастроэнтерологии Университета Кампании имени Луиджи Ванвителли в период с января по октябрь 2017 года, после подписания информированного согласия были обследованы на наличие генетических вариантов PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 и MBOAT7 rs641738 и тридцать два соответствовали критериям включения в исследование и показали по крайней мере один из генетических вариантов PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K и MBOAT7 TMC4C/T или TMC4T/T, были включены вместе с шестьюдесятью пациентов без мутаций. Десять пациентов были исключены из включения из-за сосуществования нескольких сопутствующих заболеваний и/или поздних стадий заболевания печени, таких как цирроз и/или гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК).

Определение наличия/отсутствия НАЖБП и стадирование оценивали путем выполнения биопсии печени, серологических тестов и сбора клинических данных. Также исследовались история болезни, употребление алкоголя (AUDIT-C), лекарственные препараты, злоупотребление наркотиками, курение. Артериальное давление, вес, рост измерялись непосредственно, и рассчитывался WHtR. ИМТ также рассчитывали путем деления веса (кг) на квадрат роста (м). Через 12 часов натощак у пациентов проводили забор образцов периферической венозной крови для оценки некоторых биохимических показателей и проведения генетического анализа.

Уровни инсулина, ГГТ, СРБ измеряли ферментативно с использованием имеющихся в продаже наборов, АСТ, АЛТ и глюкозы с помощью набора для колориметрического анализа (Amplite 13801/13803 и Thermo Fisher Scientific EIAGLUC). HOMA-IR также рассчитывали по формуле: инсулин натощак (мкЕд/мл) × глюкоза плазмы (ммоль/л)/22,5.

Транзиентная эластография (ТЭ) FibroScan® выполнялась с использованием FibroScan® версии 502 (Echosens, Париж, Франция) со стандартными датчиками (датчики M и XL). Сверхбольшой (XL) зонд использовали, когда расстояние от кожи до капсулы печени, оцениваемое с помощью УЗИ, превышало 2,5 см и/или когда ИМТ был >30. FibroScan® был выполнен опытным врачом, получив десять приемлемых измерений, определяемых как успешное измерение жесткости печени (LS), с максимальным количеством попыток, равным 20. Критерии, предложенные Boursier et al. использовались, чтобы считать измерение «очень надежным» (IQR/M ≤ 0:1), «надежным» (0:1 < IQR/M ≤ 0:3 или IQR/M > 0:3 с медианой LS < 7:1). кПа) или «плохо надежный» (IQR/M > 0:3 с медианой LS ≥ 7:1 кПа). На основании этих показателей CAP исследователи классифицировали включенных пациентов в S0, без стеатоза (0–10% жира; 0–237 дБ/м); S1, умеренный стеатоз (11–33% жира; 238–259 дБ/м²); S2, умеренный стеатоз (34–66% жира; 260–292 дБ/м²); и S3, выраженный стеатоз (>67% жира; ≥293 дБ/м) в соответствии с расчетом затухания ультразвуковых сигналов, использованным для ТЭ.

Анализ TBARS проводили с использованием 10 мкл сыворотки. Кромоген TBARS количественно определяли с использованием спектрофотометра при длине волны 532 нм с 1,1,3,3-тетраметоксипрофаном в качестве стандарта. Количество TBARS выражали в нмоль/мкг белка. Представленные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение, полученное в результате трех независимых экспериментов.

Выделение геномной ДНК из образцов периферической крови проводили с использованием набора для выделения PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen by Life Technologies, США). Количество ДНК в каждом образце оценивали с помощью спектрофотометра (NanoDrop Thermo Fisher Scientific) с длиной волны 260 нм. Наличие загрязнения образца оценивали с помощью оценки длины волны 280 нм, и все образцы показали хорошую степень чистоты, поскольку соотношение 260/280 составляло от 1,8 до 2. Экстрагированную ДНК затем хранили в морозильной камере при температуре -20°C до тех пор, пока анализ полиморфизмов.

Анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с использованием кода доступа к банку данных TM6SF2 rs58542926 (SNP 1), MBOAT7 rs641738 (SNP2), PNPLA3 rs738409 (SNP3) проводили методом ДНК-генотипирования ПЦР в реальном времени с помощью TaqMan (Applied Biosystem). c_89463510_10 для SNP 1, c_8716820_10 для SNP 2, c_7241_10 для зондов SNP 3. Все оценки проводились в три этапа: ПЦР-амплификация ДНК, идентификация аллелей и анализ конечной точки с кривой плавления.

Первую фазу проводили с использованием ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold®, содержащейся в универсальном мастер-миксе для ПЦР TaqMan, амплифицируя последовательность-мишень с помощью специфических праймеров, содержащихся в тесте SNP Genotyping Assay 40X, вместе с зондами TaqMan® MGB: один из них помечен флуорохромом VIC®, который распознает последовательность аллеля 1 и другой зонд, помеченный флуорохромом FAM™, который распознает последовательность аллеля 2. Для каждого эксперимента использовали 48-луночный планшет, в котором часть биологических образцов неизвестного генотипа для анализа SNP, были проанализированы три различных отрицательных контроля, чтобы избежать возможных ошибок из-за загрязнения образцов. Каждый эксперимент проводили в трехкратной повторности. Амплификацию проводили с использованием системы ПЦР в реальном времени StepOne™ (Applied Biosystems). Оценка генотипирования основана на распознавании аллелей благодаря различной флуоресценции праймера специфического гена с использованием двух зондов MGB TaqMan®, помеченных на 5'-конце другим флуорохромом: SNP1 в обратной G в VIC® и A в FAM™; SNIP2 в прямой C в VIC® и T в FAM™; SNIP3 в прямой C в VIC® e G в FAM™. Для анализа результатов используется программа StepOne™2.0. было использовано. После дифференциации флуоресценции зондов на фон в каждой лунке измеряют нормализованную интенсивность сигнала (Rn), проецируя результаты на график дискриминации аллелей. Программное обеспечение присваивает образцам определенный генотип на основе положения сигнала флуоресценции: горизонтальная ось (аллель один), вертикальная ось (аллель 2), диагональная ось (аллель один и два). Преобладание специфической флуоресценции над другой определяло гомозиготный генотип, наоборот наличие обоих гетерозиготных.

Статистический анализ Количество пациентов (30 в контрольной группе с НАЖБП дикого типа, 30 в группе дикого типа, получавшей лечение НАЖБП, и 32 в группе пациентов с мутацией, получавших НАЖБП) было рассчитано с использованием функции расчета мощности и размера выборки STATA-14® для mac- OS, на основе ожидаемой разницы между исследуемыми группами в ответе HOMA-IR на терапию, предполагая двойное количество пациентов, ответивших на терапию в группе дикого типа по сравнению с мутантным. В частности, исследователи считали пациента респондером, если был соблюден хотя бы один из следующих критериев: нормализация HOMA-IR (

Статистический анализ был выполнен с использованием Статистической программы для социальных наук (SPSS®) против 18.0.