PNPLA3, TM6SF2 및 MBOAT7 유전자 변이체가 비알코올성 지방간 질환 치료 결과에 미치는 영향.

이 연구의 목적은 PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 및 MBOAT7 rs641738이 303mg의 실리빈-인지질 복합체를 사용한 치료에 대한 대사 매개변수, 간 손상 및 간 지방 축적과 관련하여 NAFLD 환자의 반응에 영향을 미칠 수 있는지 평가하는 것이었습니다. 6개월 동안 비타민 D 15mg, 비타민 E 15mg을 하루에 두 번 복용합니다.

연구자들은 체중, 허리-신장 비율(WHtR), 혈압 측정, 체질량 지수(BMI), 혈당 및 인슐린, 인슐린 저항성 평가를 위한 항상성 모델(HOMA-IR), 아스파르테이트 및 인슐린의 기준선 비교를 수행했습니다. 알라닌 아미노전이효소(AST, ALT), 감마-글루타밀 전이효소(GGT), 혈구 수, C 반응성 단백질(CRP), 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS), 간 경직성 및 통제된 감쇠 매개변수(CAP) NAFLD 야생형 대조군(n. 30), NAFLD 처리된 야생형 그룹(n. 30), NAFLD 치료 돌연변이 그룹(n. 32). 블록 무작위화 방법은 온라인 무작위화 소프트웨어 http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm을 사용하여 NAFLD 야생형 대조군과 NAFLD 처리 야생형 1에서 돌연변이되지 않은 60명의 환자를 무작위화하는 데 사용되었습니다.

야생형 대조군은 PNPLA3, TM6SF2 및 MBOAT7 돌연변이가 없고 연구 기간 동안 어떠한 유형의 치료도 받지 않은 NAFLD 환자로 구성되었습니다.

NAFLD 치료 야생형과 NAFLD 치료 돌연변이군에 삽입된 환자들은 6개월 동안 실리빈-인지질 복합체 303mg, 비타민 D 10mg, 비타민 E 15mg을 1일 2회 경구 투여하였다. 등록된 환자 중 누구도 연구를 중단하지 않았습니다.

치료 종료 시 WHtR, 혈압 측정, BMI, 혈당 및 인슐린, HOMA-IR, AST, ALT, GGT, 혈구 수, CRP, TBARS, 간 경직 및 CAP 평가를 다시 수행했습니다. 실험 관찰 기간 동안 환자는 등록 전 식습관에 따라 무료 식이 요법을 받았으며 연구 기간 동안 모든 유형의 신체 운동이 권장되었습니다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 기준선과 치료 종료 시점에 음식 섭취량을 평가했습니다. 조사관은 근무일과 주말을 포함하여 일주일 전체의 음식 섭취량을 다이어트 일지로 기록했습니다. 소비되는 음식의 양과 질을 기준으로 소프트는 일일 에너지 섭취량과 다량 영양소의 백분율/칼로리 양을 자세히 설명합니다. 신체 운동 평가를 위해 조사관은 다음과 같은 몇 가지 간단한 질문과 함께 기준선 및 치료 종료 시 특정 설문지를 제출했습니다. 참가자는 지속적이고 규칙적인 방식으로 스포츠를 하고 있거나 해본 적이 있습니까(지난 2년 동안)? 참가자가 지난 6개월 동안 일상적인 신체 활동을 변경했습니까? 1: 아니오, 2: 예; 예인 경우 신체 활동이 향상되었거나 악화되었습니까? 알코올 소비는 치료 시작과 끝에서 평가되었습니다. 2017년 1월에서 10월 사이에 캄파니아 대학의 간위장병학 부서 "Luigi Vanvitelli"에 이어 NAFLD의 조직학적 진단을 받은 102명의 환자가 PNPLA3 rs738409, TM6SF2 rs58542926 및 MBOAT7 rs641738 유전적 변이에 대해 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 선별되었습니다. 32명이 연구의 포함 기준을 충족했으며 PNPLA3 I148I/M, I148M/M, TM6SF2 167E/K, 167K/K 및 MBOAT7 TMC4C/T 또는 TMC4T/T 유전자 변이 중 적어도 하나를 보여 60명과 함께 등록되었습니다. 돌연변이가 없는 환자. 간경화 및/또는 간세포 암종(HCC)과 같은 여러 동반 질환 및/또는 진행 단계 간 질환의 공존으로 인해 10명의 환자가 등록에서 제외되었습니다.

비알코올 지방간질환의 유무와 병기의 정의는 간생검, 혈청학적 검사, 임상자료 수집을 통해 평가하였다. 병력, 알코올 소비(AUDIT-C), 약물, 약물 남용, 흡연 습관도 조사했습니다. 혈압, 체중, 키를 직접 측정하여 WHtR을 계산하였다. BMI도 체중(kg)을 키(m)의 제곱으로 나누어 계산했습니다. 일부 생화학적 매개변수를 평가하고 유전자 분석을 수행하기 위해 환자는 12시간 금식 후 말초 정맥 혈액 샘플 수집을 받았습니다.

인슐린, GGT, CRP, 시판 키트, AST, ALT 및 비색 분석 키트(Amplite 13801/13803 및 Thermo Fisher Scientific EIAGLUC)를 사용하여 포도당을 사용하여 효소로 수치를 측정했습니다. HOMA-IR은 공복 인슐린(μU/mL) × 혈장 포도당(mmol/L)/22.5 공식을 사용하여 계산했습니다.

FibroScan® 일시적인 엘라스토그래피(TE)는 표준 프로브(M 및 XL 프로브)와 함께 FibroScan® 버전 502(Echosens, Paris, France)를 사용하여 수행되었습니다. 엑스트라 라지(XL) 프로브는 초음파로 평가한 피부에서 간 캡슐까지의 거리가 2.5cm를 초과하거나 BMI가 >30일 때 사용되었습니다. FibroScan®은 성공적인 간 강성(LS) 측정으로 정의되는 10개의 허용 가능한 측정값을 얻기 위해 전문 의사가 수행했으며 최대 시도 횟수는 20회로 설정되었습니다. Boursier 등이 제안한 기준. "매우 신뢰할 수 있음"(IQR/M ≤ 0:1), "신뢰할 수 있음"(0:1 < IQR/M ≤ 0:3 또는 IQR/M > 0:3, LS 중앙값 < 7:1)을 고려하는 데 사용되었습니다. kPa) 또는 "신뢰도가 낮음"(IQR/M > 0:3, LS 중앙값 ≥ 7:1 kPa). CAP 점수를 기준으로 조사관은 등록된 환자를 S0, 지방증 없음(0%-10% 지방; 0-237 dB/m); S1, 가벼운 지방증(지방 11%-33%; 238-259dB/m); S2, 중등도 지방증(34%-66% 지방; 260-292dB/m); 및 S3, TE에 사용되는 초음파 신호의 감쇠 계산에 따른 중증 지방증(>67% 지방; ≥293dB/m).

TBARS 분석은 10 μl의 혈청을 사용하여 수행되었습니다. 크로모젠 TBARS는 1,1,3,3-테트라메톡시프로판을 표준으로 하여 532nm의 파장에서 분광광도계를 사용하여 정량하였다. TBARS의 양은 단백질의 nmol/μg으로 표현하였다. 제시된 데이터는 세 번의 독립적인 실험 결과 평균 ± 표준 편차입니다.

말초 혈액 샘플로부터 게놈 DNA 추출은 추출 키트 PureLink Genomic DNA Kit(Invitrogen by Life Technologies, USA)를 사용하여 수행하였다. 각 샘플의 DNA 양은 260nm의 파장을 사용하여 분광광도계(NanoDrop Thermo Fisher Scientific)로 평가했습니다. 샘플 오염 여부는 280 nm 파장 평가를 사용하여 평가했으며 모든 샘플은 260/280 비율이 1.8과 2 사이였기 때문에 순도가 양호했습니다. 다형성 분석.

단일 염기 다형성(SNP) 분석은 데이터 뱅크 TM6SF2 rs58542926(SNP 1), MBOAT7 rs641738(SNP2), PNPLA3 rs738409(SNP3)에 대한 액세스 코드를 사용하여 TaqMan(Applied Biosystem)을 사용한 DNA 유전자형 RealTime PCR을 사용하여 수행되었습니다. SNP 1의 경우 c_89463510_10, SNP 2의 경우 c_8716820_10, SNP 3 프로브의 경우 c_7241_10. 모든 평가는 DNA PCR 증폭, 대립유전자 식별 및 융해 곡선을 사용한 종점 분석의 세 단계로 수행되었습니다.

첫 번째 단계는 SNP Genotyping Assay 40X에 포함된 특정 프라이머로 표적 서열을 증폭하는 TaqMan Universal PCR Master Mix에 포함된 AmpliTaq Gold® DNA 중합효소를 TaqMan® MGB 프로브와 함께 사용하여 수행되었습니다. 대립유전자 1의 서열 및 대립유전자 2의 서열을 인식하는 형광색소 FAM™으로 표시된 또 다른 프로브. 각 실험을 위해 48웰 플레이트를 사용했으며, 여기서 SNP 분석을 위한 알려지지 않은 유전자형의 생물학적 샘플의 일부, 샘플 오염으로 인한 가능한 오류를 피하기 위해 세 가지 다른 음성 대조군을 분석했습니다. 각 실험은 세 번 수행되었습니다. 증폭은 StepOne™ Real Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었습니다. 유전형 분석 평가는 5'에 다른 형광색소로 표시된 두 개의 MGB TaqMan® 프로브를 사용하여 특정 유전자 프라이머의 다른 형광으로 인한 대립형질 식별을 기반으로 합니다: VIC®의 역 G에서 SNP1 및 FAM™에서 A VIC®의 정방향 C 및 FAM™의 T의 SNIP2; FAM™의 VIC® e G에서 정방향 C의 SNIP3. 결과 분석을 위해 소프트웨어 StepOne™2.0 사용되었습니다. 프로브에서 만들어진 형광을 각 웰에서 백그라운드로 구별한 후 대립유전자 판별 플롯에 결과를 투사하는 정규화된 신호 강도(Rn)를 측정합니다. 소프트웨어는 형광 신호 위치에 따라 샘플에 특정 유전자형을 부여합니다: 수평축(대립유전자 1), 수직축(대립유전자 2) 대각선 축(대립유전자 1 및 2 모두). 다른 하나에 대한 특정 형광의 유병률은 동형 접합 유전자형을 확인했으며 반대로 두 이형 접합의 존재를 확인했습니다.

통계 분석 환자 수(NAFLD 야생형 대조군 30명, NAFLD 처리 야생형 30명, NAFLD 처리 돌연변이 32명)는 Mac용 STATA-14®의 검정력 및 표본 크기 계산 기능을 사용하여 계산되었습니다. OS, 치료에 대한 HOMA-IR의 반응에서 연구 그룹 간에 예상되는 차이를 기반으로, 돌연변이 그룹과 비교하여 야생형 그룹에서 치료에 대한 환자 반응자의 두 배 양을 가정합니다. 구체적으로, 연구자들은 다음 기준 중 적어도 하나가 언급된 경우 환자 반응자를 고려했습니다: HOMA-IR의 정상화(

통계 분석은 SPSS®(Statistical Program for Social Sciences) vs.18.0을 사용하여 수행되었습니다.