重症好酸球性喘息に対するメポリズマブの効果 (EMESEA)

仮説

Hº1。 好酸球上の特定の表面分子のレベル、またはメポリズマブ治療前のこの白血球サブセットのプロテオームにおける特定のタンパク質の存在または非存在は、この生物に対する応答の予測/予後マーカーとして使用できます。

Hº2。メポリズマブは、活性化状態、移動能力、調節/エフェクター機能、またはサブセット構成の変化に関連する結果として、好酸球のいくつかの表面または細胞内タンパク質の存在量を変化させます。

Hº3。遅発性の重度の好酸球性喘息患者は、IGF ファミリーのさまざまなメンバー (IGF-1、IGF-BP3、IGF-ALS) の血清濃度が上昇しており、メポリズマブ治療はこれらのレベルを低下させ、好酸球および臨床的増悪。

目的または研究課題

OB (Aspirational Objective): フローサイトメトリー、トランスクリプトーム、およびプロテオミクス技術を使用した、メポリズマブに対する応答の予測/予後バイオマーカーの発見。

• OB1.- フローサイトメトリー技術を使用して、メポリズマブによる治療に応答した好酸球および好酸球亜集団の表面マーカーの変化を特定すること。 この目的は、次の成果物 (DE) で配布されます。

  • DE1.1: 15 人の健康なコントロールの選択
  • DE1.2: 遅発性好酸球性重症喘息患者の診断と、基準を満たし、メポリズマブの投与が予定され、インフォームド コンセントに署名する 15 人の患者の選択。
  • DE1.3: 人口統計学的、臨床的、血液学的、および生化学的情報を含む健常対照者および喘息患者の初期データベースの生成。
  • DE1.4: 健康なドナー (T0) およびメポリズマブ治療を受けた患者 (T0、T4、T16、T32) からの血清 (SST チューブ 1 本) および全血サンプル (チューブ 1 ～ 2 本) の収集と処理。
  • DE1.5: マルチマーカー パネル 1 (規制)、2 (活性化)、および 3 (好酸球サブセット) を使用したフローサイトメトリー アッセイ (下記参照)。
  • DE1.6: T4、T16、および T32 で生成された臨床、血液学、生化学、およびフローサイトメトリー データでデータベースを完成させます。 最終的な単変量および多変量の統計分析。
  • DE1.7: 結果の公開。

• OB2.- メポリズマブによる治療に応答して増加または減少したレベルを示す好酸球トランスクリプトーム内の mRNA を特定するためのトランスクリプトーム解析。 この目的は、次の成果物 (DE) で配布されます。

  • DE2.1: 好酸球分離プロトコルを設定し、フローサイトメトリーで細胞の純度を確認します。
  • DE2.2: 15 人の健康なドナー (T0) と 15 人の患者 (T0、T4、T16、T32) からの好酸球の精製。
  • DE2.3: 好酸球ライセートからのトータル RNA 抽出、RNA の質と量のアッセイ、および -80ºC での保存。
  • DE2.4: 発見ベース/仮説生成アプローチ。 nCounter® NanoString と名付けられた直接多重化分子測定プラットフォームと既製の「nCounter® Human Myeloid自然免疫パネル (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ）。 経済的コストが高いため、研究のこの部分は、健康なドナー (T = 0) と患者の 2 つの時点 (T = 0 および T = 16) からの好酸球サンプルでのみ実行されます。
  • DE2.5: 得られたデータの処理と初期の統計分析。
  • DE2.6: nCounter® データの検証と、確立された定量的手法による仮説駆動型アプローチ。 nCounter® 研究によると、メポリズマブ治療に応答して最大量の変化を示す好酸球の mRNA の逆転写および qPCR 分析を実行します。 さらに、FOXP3 (調節機能)、CRLF2、ST2、または IL-7R (サイトカイン受容体; 活性化) など、「nanoString Myeloid Innate Immunity」パネルに含まれていないいくつかの追加の mRNA が分析されます。 HPRT1 遺伝子は、RTqPCR 実験のこのセットでハウスキーピング遺伝子として使用されます。
  • DE2.7: 単変量および多変量の統計分析。
  • DE2.8: トランスクリプトーム結果の公開。

• OB3.- メポリズマブによる治療に応答して、好酸球内で存在量が異なるタンパク質を特定するためのプロテオミクス プロファイリング。 この目的は、次の成果物 (DE) で配布されます。

  • DE3.1: 好酸球の溶解、遠心分離による不溶性物質の除去、タンパク質の定量化 (BCA)、および細胞上清の -80°C での保存。
  • DE3.2: 液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS 技術 (Triple TOF 6600) を使用した Data Dependent Acquisition (DDA) 法による全プロテオーム解析プロトコルの開発
  • DE3.3: 生物学的変動性 (生物学的複製) と技術 (技術的レプリカ) をチェックして、テストの再現性をチェックします。
  • DE3.4: LC-MS/MS (TripleTOF) の標準化された条件を維持し、できるだけ多くの好酸球タンパク質を含む SWATH (すべての理論質量スペクトルの逐次ウィンドウ取得) 用のライブラリを作成します。
  • DE3.5: 15 人の健康なドナーと 15 人の患者 (T0、T4、T16、T32) からのサンプルで SWATH-MS 分析を実行します (「情報依存取得」法または IDA;「ターゲット ラベル フリー プロテオミクス」)。
  • DE3.6: 得られたデータの処理と初期の統計分析。
  • DE3.7: 異なる技術 (選択反応モニタリング / SRM、ELISA など) で得られたバイオマーカーのパネルを確認します。
  • DE3.8: 最終的な単変量および多変量統計分析。 グループ間の有意差 (P < 0.05) と少なくとも 1.5​​ 倍の変化を持つタンパク質を識別します。
  • DE3.9: プロテオミクス結果の公開

• OB4。メポリズマブの反応がこのマーカーのレベルに依存する場合、遅発性の好酸球性重度喘息患者が血清サンプル中の IGF-1、IGF-BP3、IGF-ALS のレベルの上昇を示すかどうか、およびこの生物学的製剤による治療が血中の濃度を低下させるかどうかを確認します。これらのIGFファミリーメンバーの血清。 この目的は、次の成果物 (DE) で配布されます。

  • DE4.1: ELISA による IGF-1、IGF-BP3、および IGF-ALS の分析
  • DE4.2: 実験データの単変量および多変量統計分析
  • DE4.3: 結果の公開

結果の公表:

スペイン呼吸器会議（SEPAR）およびメポリズマブ投与前後の患者の臨床データの研究から得られた欧州呼吸器会議（ERS）で、研究の最初の年にコミュニケーションを提示するよう努めます。 . さらに、第 1 四半期のジャーナルに 3 つの出版物を掲載する予定であり、実験研究から得られたその他の 2 つまたは 3 つの議会通信も掲載する予定です。

研究対象集団 研究対象集団には、健常対照者 (すなわち、喘息、アレルギー、全身疾患のない被験者、または軽度の手術が予定されている被験者) と、ガリシアのさまざまな地域 (Santiago de Compostela, Aコルーニャ、ルーゴ、ビーゴ、オウレンセ)、スペイン。 スクリーニング時の重度の好酸球性喘息患者の診断は、以下に説明するいくつかの選択基準と除外基準に基づいて行われます [12]。

包含基準:

• ERS/ATS 基準による重度の制御不能喘息の診断 [52]。
• -血中の持続的な好酸球増多（> 300細胞/μL）が2回以上（各測定の間に4週間以上）。
• 頻繁な増悪 (年に 2 回以上)、全身性コルチコステロイドによる治療および/または救急科 (ED) の訪問および/または入院を必要とする 3 日以上の喘息コントロールの欠如の期間として定義されます。
• インフォームドコンセントに署名し、研究のすべての訪問とこれに伴うすべての手順に従うことに同意します。

除外基準:

• 喫煙歴：喫煙歴が10パック年以上の現喫煙者または元喫煙者（パック年数＝（1日あたりの本数/20）×喫煙年数）。 元喫煙者は、Visit 1 の少なくとも 6 か月前に禁煙した参加者と定義されます。
• -喘息以外の臨床的に重要な肺疾患（例： 活動性肺感染症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、気管支拡張症、肺線維症、嚢胞性線維症、肥満に関連する低換気症候群、肺がん、アルファ 1 抗トリプシン欠乏症、原発性毛様体ジスキネジー)、または肺疾患または全身疾患と診断されたことがある喘息以外で、末梢好酸球数の上昇に関連するもの（例： アレルギー性気管支肺アスペルギルス症/真菌症、チャーグ・シュトラウス症候群、好酸球増加症候群)。
• -心臓血管、胃腸、肝臓、腎臓、神経、筋骨格、感染、内分泌、代謝、血液、精神、または研究者の意見では安定していない主要な身体障害を含むがこれらに限定されない任意の障害。
• 悪性腫瘍：現在の悪性腫瘍または寛解中のがんの既往歴。
• -抗生物質または抗ウイルス薬を必要とする急性上気道または下気道感染症 訪問1の30日前。
• Xolair：以前にオマリズマブ（Xolair）または別のモノクローナル抗体を投与された参加者。
• 訪問1の前30日以内に全身性コルチコステロイドを投与された参加者[53]。
• 妊娠中：妊娠中または授乳中の方。
• 肥満クラス2以上（BMI≧35kg/m2）（https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/）。

サンプルサイズ

• T = 0 での分析のみの健康なコントロール (n = 15) のコホート。

• 現在処方されている薬を変更せずにメポリズマブ療法を開始した、重度の好酸球性喘息の n=15 被験者のコホート。 最初の研究訪問（T = 0）から4週間（T4）、16週間（T16）、および32週間（T32）でのフォローアップ研究訪問。

  • サンプルサイズの根拠は、統計セクションで説明されています。

予想される登録率 これは多施設試験であるため、各病院でメポリズマブ療法を開始して 1 か月 (4 週間) に少なくとも 2 人の重度の好酸球性喘息患者の登録率に達すると予想されます (合計 = 1 か月あたり 8 人)。 これは、15 人の被験者がこの研究の最初の 36 週間にわたってメポリズマブを投与されるようにスケジュールされるべきであり、72 週間 (1.5 年) で研究を完了するのに十分な時間があることを意味します。 また、少なくとも 90% の被験者がこの研究を完了することを期待しています。

研究開始予定日: 2020 年 12 月 研究完了予定日: 1.5 年 (72 週間)

研究のデザインと方法

図 2.研究デザイン。 この図は、研究の臨床部分と実験部分の両方を模式的に表しています。

これは、重度の好酸球性喘息患者におけるメポリズマブ療法に対する早期反応 (4 週間) と後期反応 (16 および 32 週間) の両方を評価するための観察的、縦断的、前向き、多施設研究です。 この研究は、Francisco Javier González Barcala 博士 (CHUS の肺科サービス) が主導します。 Barcala 博士は、1 件の臨床試験で国内コーディネーターを務め、それぞれ 41 件と 19 件の臨床試験で主治医と副治験責任医師を務めました。 さらに、Barcala 博士は 7 つの研究プロジェクトの主任研究者であり、他の 7 つのプロジェクトの共同研究者であり、主に喘息の呼吸器疾患の分野で 120 を超える関連出版物 (査読済みおよび JCR インデックス付き) を発行しています。

この研究には、集学的喘息ユニットの他のメンバーも参加しています (Dr. フランシスコ・ハビエル・サルガド・カストロ、フアン・ホセ・ニエト・フォンタリゴ博士）。 特に、プロジェクト マネージャーのサルガド博士は 11 の研究プロジェクトに関与しており、免疫学、生化学、プロテオミクス、呼吸器疾患の分野に属する影響力の大きいジャーナルに 28 の研究論文を掲載しています。 さらに、このプロジェクトの他の参加者は、基礎研究とトランスレーショナル研究の両方で、それぞれの分野で幅広い経験を持っています。 彼らはドラです。 ア・コルーニャ大学病院コンプレックス (CHUAC) の喘息ユニットを担当するマリーナ・ブランコ・アパリシオ、フェロル大学病院コンプレックス (CHUF) のウクシオ・カルボ博士、オウレンセ大学病院コンプレックス (CHUO) のコーラル・ゴンザレス、ビーゴのアルバロ・クンケイロ病院のマル・モステイロ。 Povisa-Vigo 病院の Dolores Corbacho さん。 RTqPCR、フローサイトメトリー、ELISA アッセイだけでなく、トランスクリプトームおよびプロテオーム研究のサンプル調製を行うには、12 か月間、博士前段階の研究者を雇う必要があります。 この研究者は、Francisco Javier Salgado Castro 博士と Juan José Nieto-Fontarigo 博士 (集学的喘息ユニット、CHUS) の監督下に置かれます。 プロテオミクス実験はDraによって行われます。 サンティアゴ・デ・コンポステーラ衛生研究財団 (FIDIS) のプロテオミクス・プラットフォームで働く Susana Belén Bravo López と Maria García Vence。 nCounter® 分析は、GENVIP グループ (小児科における遺伝学、ワクチンおよび感染症のグループ; https://nanostringenvip.com/)、FIDIS が提供するサービスを通じて実行されます。

研究プロジェクトは最小限の侵襲性 (例えば、気管支鏡検査なし) になりますが、プロトコルは、スペインのガリシアの臨床研究の倫理委員会によって審査および承認される必要があります。 遅発性重度喘息の診断基準を満たし、メポリズマブの投与が予定され、インフォームドコンセントに署名した15人の患者のみがこの研究に登録されます。 異なる臨床チームが同じプロトコルに従います。 人口学的、臨床的、血液学的、および生化学的変数がデータベースに含まれます。 一般的なアレルゲンに対する皮膚プリック テストと、アレルゲン特異的 IgE (ImmunoCAP、Thermo Fisher) の存在を使用して、アレルギー感作をチェックします。 肺機能パラメーター (1 秒の努力呼気量 (FEV1)、努力肺活量 (FVC)、および FEV1/FVC 比) も分析されます。 気管支拡張薬の使用前後にスパイロメトリーを行います。 喘息コントロールテスト（ACT）および喘息の生活の質に関するアンケート（AQLQ）アンケートが実施されます。 喘息患者は、疾患の安定期にある必要があります (つまり、 サンプル収集前に少なくとも 4 週間増悪がない場合)。 増悪は、標準的な臨床ガイドラインに従って管理されます。 患者 (n=15) はメポリズマブの 100 mg 皮下注射を 4 週間間隔で受け、血液および血清サンプル (EDTA チューブ 2 ～ 3 本、SST チューブ 1 本) を T=0、4、16、および 32 週に採取します。治療に対する早期反応 (4 週間) と後期反応 (16 および 32 週間) の両方を評価するため。

メソッド

• チューブ: EDTA (全血) および SST (血清)

• 好酸球の精製

  • 好酸球は、Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (カタログ番号 130-104-466) または EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (カタログ番号 17956) を使用して全血 (ヘパリンチューブ) から分離できます。これらの白血球。 少なくとも 1.0 ～ 4.0 程度が予想されます 約 20 ml の血液から x 106 個の細胞が得られますが、高い生存率と純度 (>95%) も得られます。

• ELISA研究。

  • 血清サンプル収集: IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 well)、IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA、R&D Systems、カタログ #DY291)、および IGF-BP3 (Human IGFBP-3) の測定ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ６７５）、ＥＬＩＳＡによる。

• 好酸球からのトータル RNA 精製および nCounter nanoString 分析 (発見ベース/仮説生成アプローチ):

  • 健康なコントロール (T=0) および患者 (T=0、4、16、および 32 週) から精製された好酸球は、-80ºC で RNAlater 溶液 (Ambion、ペイズリー、英国) で保存されます。 総 RNA は RNeasy Mini キット (Qiagen) によって分離され、RNA の品質と濃度 (Nanodrop) を確認した後、-80ºC で保存されます。
  • nCounter® プラットフォーム (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) は、最大 800 の RNA、DNA、またはタンパク質ターゲットの定量化を可能にするマルチプレックス手法です。 mRNA分子に関して、この技術は、すべてのmRNAの2つの相補的オリゴヌクレオチドへの溶液内ハイブリダイゼーションに基づいています。ビオチン化mRNA特異的プローブと、蛍光を作り出す6つの蛍光色素(4つの異なる色)の連続した組み合わせを含むmRNA特異的オリゴヌクレオチドです。検出されている特定の mRNA を識別するバーコード。 両方のプローブの過剰分が除去されると、ハイブリダイズした複合体がビオチン-ストレプトアビジン相互作用によって捕捉され、nCounter 機器がそれらの「バーコード」を読み取ることができるようにカートリッジ上で整列されます。 これらの手順を実行するために、nCounter プラットフォームは、ハイブリダイズした複合体の精製とカートリッジの表面への固定化を行う Prep Station と、複合体を識別してカウントするスキャナーであるデジタル アナライザー (DA) の 2 つの機器で構成されています。サンプルごとにキャプチャされたバーコード。 この定量分析 したがって、mRNA-cDNA 変換 (RT) や DNA 増幅 (qPCR) などの他の要件を必要とせずに、困難なサンプル (好酸球など) から各 miRNA を個別に定量 (絶対定量; カウント) することができます。データのばらつきが少ない (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt)。 さらに、入力材料の量は少なく (25 ng ～ 300 ng の mRNA)、FFPE 由来の RNA、全 RNA、断片化された RNA、細胞ライセート、および選別された細胞に由来する可能性があります。 その後、nCounter データは正規化され、バックグラウンド ノイズが差し引かれ、抽出の効率を考慮してさらに補正が実行されます (miRNA 抽出前に定義された量でサンプルに追加されるスパイクイン miRNA の発現に基づいて計算されます)。 ）。 正規化は、R NanoStringNorm パッケージを使用して行われます。 正規化後、データの log2 変換が行われ、続いて LIMMA Bioconductor パッケージを使用して分析され、メポリズマブ処理時に異なる存在量を示す mRNA が特定されます。 この分析には 24 時間以上かかりません。

• RTqPCR 研究 (仮説駆動型アプローチ):

  • アラーミンを介した好酸球の活性化 (CRLF2、ST2、IL-7Rα/CD127) および好酸球の調節機能 (FOXP3) に関連するタンパク質をコードする mRNA のレベルをメポリズマブで治療された患者から分析するために、全 RNA が cDNA に転写されます。 (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) -80ºC で保存。 qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) は、LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) で実行され、FOXP3、CRLF2、ST2、IL-7R、および HPRT1 遺伝子 (内因性コントロール) の発現を分析するために使用されます。

• フローサイトメトリー研究 (仮説駆動型アプローチ):

  • 健康なコントロール (n = 15; T0) およびメポリズマブ治療患者 (n = 15; T0、T4、T16、T32) からの EDTA 治療末梢血サンプル。

  • 全末梢血 (EDTA) の 100 μL/チューブに、特定のコントロール抗体とアイソタイプが一致したコントロール抗体 (BD) の両方をラベル付けします。 FACSlyse (BD) による赤血球溶解。 FACSCalibur フローサイトメーター (BD) による分析。 FSC/SSC を使用して顆粒球を選択します。次に、好中球から好酸球を分離するための SSC 対 CCR3 (FITC)。 ゲート好酸球:

    • マルチマーカーパネル 1 (好酸球の調節タンパク質): CD16 およびガレクチン-1/10 の測定 [41-44]。
    • マルチマーカー パネル 2 (好酸球の活性化受容体): CD48 (健常対照者 (HC) と比較して中等度から重度の喘息の総好酸球が減少 [我々の研究、54])、CD44、および CD11b の測定。
    • マルチマーカーパネル 3 (好酸球サブセット): Siglec-8、CD62L(L-セレクチン)、および IL-5Rα の発現に基づくサブセットの分析 [40]。

• 好酸球プロテオームの解析 (発見ベース/仮説生成アプローチ):

  • プロテオミクスアッセイを行うには、50 x 103 もの細胞が必要です。 約 1 mL の血液から約 50 ～ 400 x 103 細胞が得られると予想されます。
  • 分離された好酸球 (50 x 103 細胞) は、遠心分離によって収集され、洗浄され、プロテイナーゼ阻害剤を含む溶解バッファーに再懸濁されます。 その後、不溶性物質を遠心分離によって除去し、細胞上清を-80°Cで保存します。
  • 好酸球については、トリプシン消化後に、LC-MSMS システムで DDA 法を使用して総プロテオームの特徴付けを行います。 このアプローチでは、15 人の健康なドナーと 15 人の患者 (T0、T4、T16、T32) からのサンプルを使用します。 選択されたタンパク質は、1% のグローバル偽発見率 (FDR) またはそれ以上を報告したもののみになります [55、56]。
  • 研究の 5 つのグループ (健康なドナーと治療後の時間 T0、T4、T16、および T32 の患者) からのタンパク質「プール」を使用し、それら (1-DE) を 5-6 バンドに分割し、それぞれからタンパク質を抽出します。バンド、対応するペプチドを生成し、MS / MSによってそれらを分析して、多数のタンパク質を含むSWATHのライブラリを生成し、その後定量化が実行されます。 ライブラリが作成され、LC-MS/MS (TripleTOF) の標準化された条件が維持されると、サンプルの SWATH-MS 分析 (「情報依存取得」法または IDA; 「ターゲット ラベルフリー プロテオミクス」) が実行されます。 15 人の健康なドナーと 15 人の患者 (T0、T4、T16、T32)。 このアッセイにより、研究グループ間で有意差のあるタンパク質を特定できます。 選択されたタンパク質は、P < 0.05 および倍数変化 ≥1.5 [56-59] を持つもののみになります。

研究のエンドポイント:

研究に登録されたすべての個人の人口統計データは、基礎で取得されます。 さらに、喘息の病歴、肺機能パラメータ、皮膚プリック テスト、アレルゲン特異的 IgE、AQLQ スコア、ACT スコア、増悪回数、プレドニゾンの消費量など、いくつかのデータが収集されます。 T0、4、16、および 32 での次の呼吸器科サービスへの訪問中に、メポリズマブで治療された患者がフォローアップされます。 これには、肺機能 (FEV1、FEV1/FVC)、生化学的および血液学的パラメータの測定が含まれます。

末梢血および血清サンプルが収集され、T0、T4、T16、および T32 で好酸球が磁気的に精製され、フローサイトメトリー、RTqPCR、およびプロテオミクス分析、ならびにイムノアッセイが実行されます。 これらの変数の関連性を評価するために、すべての実験変数 (例、プロテオミクスアッセイにおける好酸球タンパク質の存在量、好酸球活性化マーカーなど) を臨床パラメータ (例、肺機能、喘息のコントロール、増悪の数) と相関させます。治療への反応とともに。 以下の基準のいずれかが満たされている場合、メポリズマブに対する良好な反応を考慮します。

• 適切な喘息コントロールを取得するには、ACT ≥20 [60]、または/最小限の重要な差を表す ≥3 ポイントの変化。
• 年間増悪率を 48% 削減すること。 増悪は、メポリズマブの臨床試験で反映されたものと同様に、全身性コルチコステロイドによる治療を 3 回以上必要とする症状の増加、または予定外の医療相談と定義される [20, 61]。
• 臨床試験で反映されているのと同様に、喘息増悪による年間入院率を 50% 削減します [62]。
• 全身性コルチコステロイドの年間用量の中央値を 50% 削減すること [63]。

• 研究の主要評価項目:

  • 血清中のIGF-1、IGF-BP3およびIGF-ALSレベル
  • トランスクリプトーム (nanoString)/mRNA 発現データ: FOXP3、CRLF2、ST2、IL-7R
  • プロテオームデータ
  • フローサイトメトリー データ: CD16、galectins-1/10、CD48、CD44、CD11b、Siglec-8、CD62L、および IL-5Rα の発現

• 副次評価項目の研究:

  • 肺機能パラメータ (FEV1、FEV1/FVC)
  • 血液学的パラメーター (例えば、好酸球数)。
  • その他の臨床的および生化学的変数 (IgE またはその他の免疫グロブリンなど)。
  • 増悪回数、プレドニゾン消費量、ACTスコア、AQLQスコア。

統計計画またはデータ分析:

Graph Pad Prism を使用してグラフィックを作成します。 統計調査には、IBM SPSS、Statistics 22.0、または R が使用されます。 分析中は、USC 統計および運用研究エリア (Dr. ロサ・マリア・クルジェイラス・カサイス）。

サンプル サイズ サンプル サイズ (N) の計算は、G*Power 3.1.9.4 [64] を使用して実行されました。 これらの分析中に、α (0.05)、検出力 (1-β、0.95)、測定数 (T0、T4、T16 およびT32)、および効果サイズ (f = 0.4; 大きな効果サイズ、より臨床的に関連のある結果を与える)。 出力 N は 15 で、クリティカル F= 2.82705 でした。

臨床、フローサイトメトリー、およびトランスクリプトーム データ用。 HC と T0 (治療前) の患者との断面比較は、t 検定を使用して、正規分布に従い、分散の均一性を持ちます。 非正規分布変数については、マンホイットニーの U 検定を使用します。 メポリズマブによる治療に応じたさまざまな研究変数の変化 (縦断研究; T0、T4、T16、および T32) は、RM-ANOVA を使用してテストされます。 多変量解析 (PCA、教師なしクラスタリングなど) および機能的濃縮解析は、フローサイトメトリー、とりわけトランスクリプトーム データを使用して実行されます。

全プロテオームの特徴付けおよび定量的ＳＷＡＴＨ分析のために、データベース検索のためのアルゴリズムＰａｒａｇｏｎＴＭおよびデータグループ化のためのＰｒｏｇｒｏｕｐＴＭを有するＡＢＳｃｉｅｘからのＰｒ​​ｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔＴＭ ５．０．１ソフトウェアを使用する。 データは、ヒト固有の Uniprot データベースを使用して検索されます。 誤検出率は、1% 以上のグローバル誤検出率を報告した結果のみを表示する非線形フィッティング法を使用して実行されます [65]。

機能解析は、さまざまなオープン アクセス ソフトウェアによって実行されます。 機能強化と相互作用ネットワーク分析のための FunRich (機能強化分析ツール) (http://funrich.org/index.html)。 統計のために、FunRich は超幾何検定、BH および Bonferroni [66, 67] を使用します。 遺伝子オントロジー濃縮およびタンパク質間相互作用、ネットワークには、DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) または GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) を使用します。構築とクラスタリングには、文字列 (https://string-db.org/) を使用します。 または Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68]。

SWATH データの場合、MarkerView ソフトウェアは、主成分分析 (PCA) を使用して多変量統計分析を行い、サンプル全体のデータを比較します。 各タンパク質の平均 MS ピーク面積は、各サンプルの SWATH-MS の複製から導出され、続いて MarkerView ソフトウェアを使用してスチューデントの t 検定分析を行い、導出されたすべてのトランジションの平均面積合計に基づいてサンプル間の比較を行います。それぞれのタンパク質。 t 検定は、各変数が 2 つのグループをどの程度区別しているかを示し、P 値として報告されます。 ライブラリの場合、1.5 のアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたタンパク質を含む、豊富な量の異なるタンパク質 (p 値 <0.05) のセットが選択されます。

制限事項

• 以前にコメントしたように、15 人の被験者が試験の前半 (36 週間) にメポリズマブを投与される予定です。 少なくとも 90% の被験者がこの研究を完了することを期待しています。 ただし、患者のドロップアウトと不遵守 (またはコンプライアンス違反) は、臨床研究では一般的なイベントです。 そのような場合、サンプルサイズは比例して膨らみます。
• 現在のプロジェクトは、メポリズマブに応答する分子バイオマーカーの発見の研究として提案されています。 この種の研究は、対象を絞った/仮説主導型またはより広範な/対象を絞っていない (「オミクス」技術) アプローチを通じて搭乗することができます。 この小規模な前向き/概念実証研究で予測マーカーを見つけるのは難しいかもしれないことを認識しています. 現在のプロジェクトでは、このリスクを最小限に抑えるために二重のアプローチを提案します。 一方では、現代的でターゲットを絞っていない方法論が機能し、少量のタンパク質を高感度で検出する (SWATH MS)、または困難なサンプルを扱うための簡素化されたプロトコル (豊富なタンパク質が存在するため、好酸球からの高品質の RNA の生成は常に困難です) RNase ファミリーのメンバーである EDN のように)、サンプル サイズを短縮するために技術的な分散 (nCounter nanoString など) を減らします。 一方、仮説主導のアプローチ (フローサイトメトリー、RT-qPCR、ELISA など) は、信憑性が高く、タイプ I (偽発見) および II エラーのリスクが少なく、将来の複製が容易であるという利点があります。結果の。 これらのターゲットを絞った方法論は、非ターゲットのトランスクリプトーム/プロテオミクス アプローチで得られた臨床的に関連する (高い効果サイズ) および有意な (p 値 < 0.05) 違いのみを確認するためにも使用されます。
• 別の潜在的な制限は好酸球の数であり、メポリズマブによる治療後、一部の患者では好酸球数が潜在的に低くなる可能性があります (50 x 103 以下)。 したがって、プロテオミクスおよびトランスクリプトミクス実験を実行するのに十分な細胞を得るために、これらの患者の血液を 1 mL または 2 mL 以上精製する必要がある場合があります。 この問題は、研究プロトコルとプロジェクトの予算で考慮されています。
• 最後に、TripleTOF は好酸球プロテオームのような複雑なサンプルをより深く掘り下げるように設計された高感度質量分析計です。 nanoLC の二次元スキームと組み合わせた現在の質量分析計の高感度により、多数のタンパク質 (> 1000) とアトモル範囲 (10-18) の濃度の分析物を検出でき、ケモカインやサイトカインなどの少量の細胞内タンパク質を検出するのに十分です。 したがって、TGFα、TGFβ1、CCL5、CCL23、CSF1、CCL18、CCL24、CXCL12、および IL-18 は nanoLC-MS/MS (Q-TOF) によって検出されていますが、IL-5 や IL-13 などの他のものは検出されていません [69 ]。 この予想される制限は、LC-MS/MS アプリケーションで少量のタンパク質からのペプチドのイオン化を抑制する、大量のタンパク質 (好酸球顆粒タンパク質など) からのペプチドの存在によるものです。 これは、Charcot-Leyden 結晶タンパク質 (CLC、ガレクチン-10) などの豊富な種の検出されたタンパク質のリストで過剰に表現されることにつながります。 ただし、サンプルの複雑さを軽減し、存在量の少ないタンパク質の検出を改善するために、検出を得るために使用できるさまざまな除去 (ACN 除去、限外濾過、1-DE など) および濃縮方法 (CPLL など) があります。感度。 必要に応じて、高多重イムノアッセイなどのターゲットを絞ったアプローチ (例: Olink Immune Response、Olink Inflammation、または Olink Immuno-Oncology パネル; https://www.olink.com/) 一度に 92 のタンパク質バイオマーカーしか測定できないにもかかわらず、少量の生物学的サンプル (細胞ライセートなど) で検出感度が高いという利点があります。