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美泊利单抗对严重嗜酸性粒细胞性哮喘的影响 (EMESEA)

2023年9月21日 更新者:Francisco Javier González Barcala、Hospital Clinico Universitario de Santiago

美泊利单抗对严重嗜酸性哮喘患者嗜酸性粒细胞表型/蛋白质组/转录组的影响

两部分: A:病例对照研究,包括 15 名健康成人供体和 15 名严重成人嗜酸性粒细胞性哮喘患者,他们选择接受美泊利单抗治疗。 B:一项纵向队列研究,其中随时间(0、4、16 和 32 周)跟踪曾接受过美泊利单抗治疗的相同患者。 范围:严重成人嗜酸性粒细胞性哮喘对美泊利单抗的反应。

纳入标准:男性或女性,18-75 岁,患有严重的嗜酸性粒细胞性哮喘。 排除标准:吸烟史、近期病情加重、其他肺部或全身性疾病伴嗜酸性粒细胞增多、恶性肿瘤、妊娠、肥胖(BMI >35)。 目标:总体目标:使用流式细胞术、转录组学和蛋白质组学技术发现对美泊利单抗反应的预测/预后生物标志物。 其他目标: 1.-使用流式细胞仪技术鉴定嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群的表面标志物响应美泊利单抗治疗的变化。 2.-转录组学分析以鉴定嗜酸性粒细胞转录组内的 mRNA,显示响应美泊利单抗治疗的增强或降低水平。3.-蛋白质组学 分析以鉴定嗜酸性粒细胞内对美泊利单抗治疗有不同丰度的蛋白质。4.-检查迟发性严重嗜酸性粒细胞性哮喘患者是否显示血清样本中 IGF-1、IGF-BP3、IGF-ALS 水平升高,如果反应美泊利单抗的作用取决于该标记物的水平,如果用这种生物制剂治疗会降低这些 IGF 家族成员的血清浓度。

测量:使用多标记组 1(调节)、2(激活)和 3 个嗜酸性粒细胞亚群的流式细胞术分析。 在时间 T4、T16 和 T32 生成的临床、血液学、生化和流式细胞术数据。 从嗜酸性粒细胞裂解物中提取总 RNA,分析 RNA 的质量和数量,并在 -80ºC 下储存。 通过名为 nCounter® NanoString 的直接多重分子测量平台结合预制的 "nCounter® Human Myeloid先天免疫面板 (v2)”。 根据 nCounter® 研究,对嗜酸性粒细胞中的那些 mRNA 进行逆转录和 qPCR 分析,这些 mRNA 显示响应美泊利单抗治疗的最大丰度变化。 此外,还将分析一些未包含在“nanoString Myeloid Innate Immunity”面板中的其他 mRNA,例如 FOXP3(调节功能)、CRLF2、ST2 或 IL-7R(细胞因子受体;激活)。 HPRT1基因将作为本组RTqPCR实验的看家基因。 对来自 15 名健康捐赠者和 15 名患者(T0、T4、T16、T32)的样本进行 SWATH-MS 分析(“信息依赖采集”方法或 IDA;“目标无标签蛋白质组学”)。

研究概览

地位

招聘中

详细说明

假设

Hº1。 美泊利单抗治疗前嗜酸性粒细胞上某些表面分子的水平或该白细胞亚群的蛋白质组中某些蛋白质的存在或不存在可用作对该生物反应的预测/预后标志物。

Hº2。 Mepolizumab 改变嗜酸性粒细胞中几种表面或细胞内蛋白质的丰度,作为与其激活状态、迁移能力、调节/效应器功能或子集组成变化相关的结果。

H°3。迟发性重度嗜酸性粒细胞性哮喘患者 IGF 家族不同成员(IGF-1、IGF-BP3、IGF-ALS)的血清浓度升高,美泊利单抗治疗可降低这些水平,并作为反应生物标志物与嗜酸性粒细胞和临床恶化。

目标或研究问题

OB(理想目标):使用流式细胞术、转录组学和蛋白质组学技术发现对美泊利单抗反应的预测/预后生物标志物。

  • OB1.- 使用流式细胞仪技术鉴定嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群的表面标志物响应美泊利单抗治疗的变化。 此目标分布在以下可交付成果 (DE) 中:

    • DE1.1:选择 15 个健康对照
    • DE1.2:诊断为迟发性重度嗜酸性粒细胞性哮喘患者,选择符合标准的15例患者,预定接受美泊利单抗治疗,并签署知情同意书。
    • DE1.3:为健康对照者和哮喘患者生成具有人口统计学、临床、血液学和生化信息的初始数据库。
    • DE1.4:收集和处理来自健康供体 (T0) 和美泊利单抗治疗患者(T0、T4、T16、T32)的血清(1 个 SST 管)和全血样本(1-2 个管)。
    • DE1.5:使用多标记组 1(监管)、2(激活)和 3(嗜酸性粒细胞亚群)的流式细胞术分析(见下文)。
    • DE1.6:用在时间 T4、T16 和 T32 生成的临床、血液学、生化和流式细胞术数据完成数据库。 最终单变量和多变量统计分析。
    • DE1.7:公布结果。
  • OB2.- 转录组学分析,用于鉴定嗜酸性粒细胞转录组内的 mRNA,显示响应于美泊利单抗治疗的增强或降低水平。 此目标分布在以下可交付成果 (DE) 中:

    • DE2.1:建立嗜酸性粒细胞分离方案并通过流式细胞术检查细胞纯度。
    • DE2.2:从 15 名健康供体 (T0) 和 15 名患者 (T0、T4、T16、T32) 中纯化嗜酸性粒细胞。
    • DE2.3:从嗜酸性粒细胞裂解物中提取总 RNA,分析 RNA 的质量和数量,并在 -80ºC 下储存。
    • DE2.4:基于发现/假设生成的方法。 通过名为 nCounter® NanoString 的直接多重分子测量平台结合预制的 "nCounter® Human Myeloid先天免疫面板(v2)”(www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). 由于经济成本高,这部分研究将仅使用来自健康供体 (T = 0) 和患者两个时间点 (T = 0 和 T = 16) 的嗜酸性粒细胞样本进行。
    • DE2.5:获得数据的处理和初始统计分析。
    • DE2.6:使用既定的定量技术验证 nCounter® 数据和假设驱动方法。 根据 nCounter® 研究,对嗜酸性粒细胞中的那些 mRNA 进行逆转录和 qPCR 分析,这些 mRNA 显示响应美泊利单抗治疗的最大丰度变化。 此外,还将分析一些未包含在“nanoString Myeloid Innate Immunity”面板中的其他 mRNA,例如 FOXP3(调节功能)、CRLF2、ST2 或 IL-7R(细胞因子受体;激活)。 HPRT1基因将作为本组RTqPCR实验的看家基因。
    • DE2.7:单变量和多变量统计分析。
    • DE2.8:转录组学结果的发布。
  • OB3.- 蛋白质组学分析,以识别嗜酸性粒细胞内对美泊利单抗治疗有不同丰度的蛋白质。 此目标分布在以下可交付成果 (DE) 中:

    • DE3.1:嗜酸性粒细胞裂解、通过离心去除不溶性物质、蛋白质定量 (BCA) 以及在 -80°C 下储存细胞上清液。
    • DE3.2:使用液相色谱 (LC)-MS / MS 技术 (Triple TOF 6600),通过数据相关采集 (DDA) 方法开发总蛋白质组分析方案
    • DE3.3:检查生物变异性(biological replications)和技术(technical replicas)以检查测试的可重复性。
    • DE3.4:保持 LC-MS/MS (TripleTOF) 的标准化条件,为 SWATH(所有理论质谱的顺序窗口采集)创建一个库,其中包含尽可能多的嗜酸性粒细胞蛋白。
    • DE3.5:对来自 15 名健康供体和 15 名患者(T0、T4、T16、T32)的样本进行 SWATH-MS 分析(“信息依赖采集”方法或 IDA;“靶向无标签蛋白质组学”)。
    • DE3.6:获得数据的处理和初始统计分析。
    • DE3.7:检查使用不同技术(例如,选择反应监测/SRM、ELISA)获得的生物标志物组。
    • DE3.8:最终单变量和多变量统计分析。 识别组间具有显着差异(P < 0.05)且至少倍数变化 ≥ 1.5 的蛋白质。
    • DE3.9:发表蛋白质组学结果
  • OB4。检查迟发性严重嗜酸性粒细胞性哮喘患者是否显示血清样本中 IGF-1、IGF-BP3、IGF-ALS 水平升高,美泊利单抗的反应是否取决于这些标志物的水平,以及用这种生物制剂治疗是否降低了这些 IGF 家族成员的血清。 此目标分布在以下可交付成果 (DE) 中:

    • DE4.1:通过 ELISA 分析 IGF-1、IGF-BP3 和 IGF-ALS
    • DE4.2:实验数据的单变量和多变量统计分析
    • DE4.3:公布结果

结果公布:

我们将努力在研究的第一年在西班牙呼吸大会 (SEPAR) 和欧洲呼吸大会 (ERS) 上发表一份交流会,该交流会是对美泊利单抗给药前后患者临床数据的研究结果. 此外,我们预计将在 Q1 期刊上发表 3 篇文章,以及其他 2 或 3 篇来自实验研究的大会通讯。

研究人群 研究人群将包括健康对照(即没有哮喘、过敏、全身性疾病或计划进行小手术的受试者)和迟发性严重嗜酸性粒细胞哮喘患者,他们将从加利西亚的不同地区招募(圣地亚哥德孔波斯特拉,A Coruña、Lugo、Vigo 和 Ourense),西班牙。 筛选时严重嗜酸性粒细胞性哮喘患者的诊断将基于我们在下文描述的几项纳入标准和排除标准 [12]。

纳入标准:

  • 根据 ERS/ATS 标准 [52] 诊断严重未控制的哮喘。
  • 血液中持续嗜酸性粒细胞增多(>300 个细胞/μL)≥ 两次(每次测量之间超过 4 周)。
  • 频繁加重(每年≥两次),定义为哮喘无法控制的时间≥3 天,需要全身性皮质类固醇治疗和/或急诊科 (ED) 就诊和/或住院治疗。
  • 签署知情同意书并同意遵守研究的所有访问以及由此产生的所有程序。

排除标准:

  • 吸烟史:吸烟史≥10包年(包年数=(每天支烟支数/20)×吸烟年数)的当前吸烟者或既往吸烟者。 前吸烟者定义为在访问 1 前至少 6 个月戒烟的参与者。
  • 临床上重要的除哮喘以外的肺部疾病(例如 活动性肺部感染、慢性阻塞性肺病 (COPD)、支气管扩张、肺纤维化、囊性纤维化、与肥胖相关的通气不足综合征、肺癌、α1 抗胰蛋白酶缺乏症和原发性纤毛运动障碍)或曾经被诊断患有肺部或全身性疾病,除哮喘外,与外周嗜酸性粒细胞计数升高有关(例如 过敏性支气管肺曲霉菌病/真菌病、Churg-Strauss 综合征、嗜酸性粒细胞增多症)。
  • 任何疾病,包括但不限于心血管、胃肠道、肝、肾、神经、肌肉骨骼、感染、内分泌、代谢、血液、精神或研究者认为不稳定的主要身体损伤。
  • 恶性肿瘤:当前恶性肿瘤或既往癌症缓解期病史。
  • 就诊 1 前 30 天内出现需要抗生素或抗病毒药物的急性上呼吸道或下呼吸道感染。
  • Xolair:之前接受过奥马珠单抗(Xolair)或其他单克隆抗体的参与者。
  • 在第 1 次就诊前 30 天内接受过全身性皮质类固醇治疗的参与者 [53]。
  • 怀孕:怀孕或哺乳的参与者。
  • 肥胖等级 2 或更高(BMI≥ 35 kg/m2)(https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/)。

样本量

  • 仅在 T = 0 时进行分析的健康对照队列 (n=15)。
  • n=15 名患有严重嗜酸性粒细胞性哮喘的受试者的队列,他们从美泊利单抗治疗开始,没有改变他们目前的处方药。 在初始研究访问后的第 4 (T4)、16 (T16) 和 32 (T32) 周进行随访研究访问 (T=0)。

    • 统计部分解释了样本大小的基本原理。

预期入组率 由于这将是一项多中心研究,我们预计每家医院每月(4 周)至少有 2 名开始接受美泊利单抗治疗的重度嗜酸性粒细胞哮喘患者入组率(总计 = 每月 8 名)。 这意味着应安排 15 名受试者在本研究的前 36 周内接受美泊利单抗治疗,以便有足够的时间在 72 周(1.5 年)内完成研究。 我们还期望至少 90% 的受试者完成这项研究。

预计研究开始日期:2020 年 12 月预计研究完成日期:1.5 年(72 周)

研究设计和方法

图 2. 研究设计。 该图以示意图的方式表示了研究的临床和实验部分。

这是一项观察性、纵向、前瞻性和多中心研究,旨在评估严重嗜酸性粒细胞性哮喘患者对美泊利单抗治疗的早期反应(4 周)和晚期反应(16 周和 32 周)。 该研究将由 Francisco Javier González Barcala 博士(CHUS 的呼吸科)领导。 Barcala 博士是一项临床试验的国家协调员,并分别在 41 项和 19 项临床试验中担任首席研究员和副研究员。 此外,Barcala 博士还是 7 个研究项目的首席研究员,其他 7 个项目的合作者,并在呼吸系统疾病(主要是哮喘)领域发表了 120 多篇相关出版物(同行评审和 JCR 索引)。

该研究还涉及多学科哮喘科的其他成员(Dr. Francisco Javier Salgado Castro、Juan José Nieto Fontarigo 博士)。 特别是,项目经理Salgado博士参与了11个研究项目,在免疫学、生物化学、蛋白质组学和呼吸系统疾病领域的高影响期刊上发表了28篇研究论文。 此外,该项目的其他参与者在各自领域(基础研究和转化研究)都拥有广泛的经验。 他们是德拉。 Marina Blanco Aparicio 负责拉科鲁尼亚大学综合医院 (CHUAC) 的哮喘科,Uxío Calvo 博士负责费罗尔大学综合医院 (CHUF) 和 Coral González 奥伦塞大学综合医院 (CHUO) , Mar Mosteiro 在 Vigo 的 Alvaro Cunqueiro 医院; Povisa-Vigo 医院的 Dolores Corbacho。 有必要在博士前阶段聘请一名研究人员 12 个月,以进行转录组学和蛋白质组学研究以及 RTqPCR、流式细胞术和 ELISA 检测中的样品制备。 该研究人员将在 Francisco Javier Salgado Castro 博士和 Juan José Nieto-Fontarigo 博士(CHUS 多学科哮喘科)的监督下进行。 蛋白质组学实验将由 Dra 进行。 Susana Belén Bravo López 和 María García Vence,在圣地亚哥德孔波斯特拉卫生研究基金会 (FIDIS) 的蛋白质组学平台工作。 nCounter® 分析将通过 GENVIP 组(儿科遗传学、疫苗和感染组;https://nanostringenvip.com/)、FIDIS 提供的服务进行。

该研究项目将是微创的(例如,没有支气管镜检查),但该方案需要由西班牙加利西亚临床研究伦理委员会审查和批准。 只有十五名符合迟发性严重哮喘诊断标准、计划接受美泊利单抗治疗并签署知情同意书的患者将被纳入本研究。 不同的临床团队将遵循相同的协议。 人口统计学以及临床、血液学和生化变量将包含在数据库中。 对常见过敏原的皮肤点刺试验和过敏原特异性 IgE(ImmunoCAP,Thermo Fisher)的存在将用于检查过敏性致敏。 还将分析肺功能参数(第一秒用力呼气容积 (FEV1)、用力肺活量 (FVC) 和 FEV1/FVC 比率)。 将在使用支气管扩张剂之前和之后进行肺活量测定。 将进行哮喘控制测试 (ACT) 和哮喘生活质量问卷 (AQLQ) 问卷。 哮喘患者必须处于疾病稳定期(即 样本采集前至少 4 周没有恶化)。 恶化将根据标准临床指南进行管理。 患者 (n=15) 将接受 100 mg 美泊利单抗皮下注射,间隔 4 周,血液和血清样本(2-3 个 EDTA 管;1 个 SST 管)将在 T=0、4、16 和 32 周时抽取,为了评估对治疗的早期反应(4 周)和晚期反应(16 周和 32 周)。

方法

  • 试管:EDTA(全血)和 SST(血清)
  • 嗜酸性粒细胞纯化

    • 可使用 Miltenyi 人嗜酸性粒细胞分离试剂盒(产品号 #130-104-466)或 EasySep™ 人嗜酸性粒细胞分离试剂盒(产品号 #17956)从全血(肝素试管)中分离嗜酸性粒细胞,两种阴性选择程序均产生未接触的嗜酸性粒细胞亚群这些白细胞。 我们预计至少在 1.0-4.0 左右 x 106 个细胞,来自 ∼20 ml 血液,而且具有高活力和纯度 (>95%)。
  • ELISA 研究。

    • 血清样本采集:IGF-ALS(GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 孔)、IGF-1(Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA,R&D Systems,目录#DY291)和 IGF-BP3(Human IGFBP-3 DuoSet ELISA,R&D Systems,目录#DY675) 通过 ELISA。
  • 从嗜酸性粒细胞中纯化总 RNA 和 nCounter nanoString 分析(基于发现/假设生成的方法):

    • 来自健康对照(T=0)和患者(T=0、4、16 和 32 周)的纯化嗜酸性粒细胞将在 -80ºC 下储存在 RNAlater 溶液(Ambion,Paisley,UK)中。 总 RNA 将通过 RNeasy Mini 试剂盒 (Qiagen) 分离,并在检查 RNA 质量和浓度 (Nanodrop) 后储存在 -80ºC。
    • nCounter® 平台(nanoString;https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology)是一种多重方法,可对多达 800 个 RNA、DNA 或蛋白质靶标进行定量。 关于 mRNA 分子,该技术基于每个 mRNA 与两个互补寡核苷酸的溶液内杂交:一个生物素化的 mRNA 特异性探针和一个包含六种荧光染料(四种不同颜色)的顺序组合的 mRNA 特异性寡核苷酸,可产生荧光识别被检测的特定 mRNA 的条形码。 一旦两个探针的过量被去除,杂交的复合物通过生物素-链霉亲和素相互作用被捕获并排列在墨盒上,以便 nCounter 仪器可以读取那些“条形码”。 为了执行这些步骤,nCounter 平台由两个仪器组成,一个是准备站,它执行杂交复合物的纯化并将它们固定到墨盒表面,另一个是数字分析仪 (DA),它是一种扫描仪,用于识别和计数为每个样本捕获的条形码。 这种定量分析因此,每个 miRNA 都可以从困难的样本(例如嗜酸性粒细胞)中单独定量(绝对定量;计数),而无需其他要求,例如 mRNA-cDNA 转化 (RT) 或 DNA 扩增 (qPCR),从而导致更少的数据可变性 (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt)。 此外,输入材料的量很低(25 ng-300 ng mRNA),可以从 FFPE 衍生的 RNA、总 RNA、片段 RNA、细胞裂解物和分选的细胞中提取。 之后,nCounter 数据将被归一化,减去背景噪声,并进行进一步校正以说明提取效率(根据在提取 miRNA 之前以规定量添加到样品中的尖峰 miRNA 的表达计算) ). 规范化将使用 R NanoStringNorm 包完成。 归一化后,将对数据进行 log2 转换,随后通过 LIMMA Bioconductor 软件包进行分析,以识别那些在美泊利单抗治疗后显示不同丰度的 mRNA。 此分析不会超过 24 小时。
  • RTqPCR 研究(假设驱动方法):

    • 分析 alarmin 介导的嗜酸性粒细胞激活相关蛋白(CRLF2、ST2、IL-7Rα/CD127)和美泊利单抗治疗患者嗜酸性粒细胞调节功能(FOXP3)的 mRNA 水平,将总 RNA 转录成 cDNA (QuantiTect Rev. 转录试剂盒;Qiagen)并储存在 -80ºC。 qPCR(QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒;Qiagen)将在 LightCycler® 96 仪器(Roche Life Science)中进行,用于分析 FOXP3、CRLF2、ST2、IL-7R 和 HPRT1 基因(内源对照)的表达。
  • 流式细胞术研究(假设驱动方法):

    • 来自健康对照(n=15;T0)和美泊利单抗治疗患者(n=15;T0、T4、T16、T32)的 EDTA 处理外周血样本。
    • 用特异性和同型匹配的对照抗体 (BD) 标记 100 μL/管全外周血 (EDTA)。 使用 FACSlyse (BD) 裂解红细胞。 使用 FACSCalibur 流式细胞仪 (BD) 进行分析。 使用FSC/SSC选择粒细胞;然后 SSC vs CCR3 (FITC) 将嗜酸性粒细胞与嗜中性粒细胞分离。 门嗜酸性粒细胞:

      • 多标记组 1(嗜酸性粒细胞中的调节蛋白):CD16 和半乳糖凝集素-1/10 的测量 [41-44]。
      • 多标记物面板 2(嗜酸性粒细胞中的激活受体):CD48(与健康对照 (HC) [我们的研究,54] 相比,患有中度至重度哮喘的总嗜酸性粒细胞减少)、CD44 和 CD11b 的测量。
      • 多标记组 3(嗜酸性粒细胞亚群):基于 Siglec-8、CD62L(L-选择素)和 IL-5Rα 表达的亚群分析 [40]。
  • 嗜酸性粒细胞蛋白质组分析(基于发现/假设生成的方法):

    • 进行蛋白质组学分析需要多达 50 x 103 个细胞。 我们预计大约 50-400 x 103 个细胞来自 ∼1 mL 的血液。
    • 分离的嗜酸性粒细胞(50 x 103 个细胞)将通过离心收集、洗涤并重悬于含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。 之后,通过离心去除不溶性物质,并将细胞上清液储存在-80°C。
    • 对于嗜酸性粒细胞,将在 LC-MSMS 系统中使用 DDA 方法在胰蛋白酶消化后进行总蛋白质组表征。 对于这种方法,我们将使用来自 15 名健康捐赠者和 15 名患者(T0、T4、T16、T32)的样本。 选择的蛋白质将仅是那些报告了 1% 全球错误发现率 (FDR) 或更高的蛋白质 [55, 56]。
    • 将使用来自 5 组研究(健康供体和治疗后时间 T0、T4、T16 和 T32 的患者)的蛋白质“库”,将它们 (1-DE) 分成 5-6 个条带,从每个条带中提取蛋白质band,生成相应的肽段,并通过MS / MS分析,为SWATH生成一个包含大量蛋白质的库,然后对其进行量化。 一旦文库建立并保持 LC-MS/MS (TripleTOF) 的标准化条件,我们将对来自15 名健康供体和 15 名患者(T0、T4、T16、T32)。 该测定将使我们能够识别研究组之间具有显着差异的蛋白质。 选择的蛋白质将仅是那些 P<0.05 且倍数变化≥1.5 的蛋白质 [56-59]。

研究终点:

所有参与研究的个体的人口统计数据将在基础上获得。 此外,还将收集多项数据,包括哮喘病史、肺功能参数、皮肤点刺试验、过敏原特异性 IgE、AQLQ 评分、ACT 评分、急性发作次数和泼尼松用量。 在 T0、4、16 和 32 的以下呼吸科就诊期间,将对接受美泊利单抗治疗的患者进行随访。 这包括肺功能(FEV1、FEV1/FVC)、生化和血液学参数的测量。

将收集外周血和血清样本,并在 T0、T4、T16 和 T32 对嗜酸性粒细胞进行磁纯化,并进行流式细胞术、RTqPCR 和蛋白质组学分析以及免疫测定。 所有实验变量(例如,蛋白质组学测定中嗜酸性粒细胞蛋白的丰度、嗜酸性粒细胞活化标记物……)都将与临床参数(例如,肺功能、哮喘控制、加重次数)相关联,以评估这些变量之间的关联与对治疗的反应。 如果满足以下标准之一,我们将考虑对美泊利单抗的有利反应:

  • 获得足够的哮喘控制 ACT ≥ 20 [60],或/变化 ≥ 3 分代表最小重要差异。
  • 实现年恶化率降低 48%。 恶化定义为症状增加需要全身性皮质类固醇治疗 ≥ 3,或计划外的医疗咨询,类似于美泊利单抗临床试验中反映的情况 [20, 61]。
  • 将每年因哮喘恶化而入院的比率降低 50%,这与临床试验中反映的结果相似 [62]。
  • 使全身性皮质类固醇的年中位剂量减少 50% [63]。
  • 研究主要终点:

    • 血清中的 IGF-1、IGF-BP3 和 IGF-ALS 水平
    • 转录组学 (nanoString)/mRNA 表达数据:FOXP3、CRLF2、ST2、IL-7R
    • 蛋白质组数据
    • 流式细胞术数据:CD16、半乳糖凝集素-1/10、CD48、CD44、CD11b、Siglec-8、CD62L 和 IL-5Rα 的表达
  • 研究次要终点:

    • 肺功能参数(FEV1、FEV1/FVC)
    • 血液学参数(例如,嗜酸性粒细胞数)。
    • 其他临床和生化变量(例如 IgE 或其他免疫球蛋白)。
    • 急性加重次数、泼尼松用量、ACT 评分、AQLQ 评分。

统计方案或数据分析:

Graph Pad Prism 将用于创建图形。 IBM SPSS、Statistics 22.0 或 R. 将用于统计研究。 在分析过程中,我们将得到南加州大学统计和运筹学领域(Dr. Rosa María Crujeiras Caais)。

样本量 样本量 (N) 的计算已使用 G*Power 3.1.9.4 [64] 进行。 在这些分析中,我们计算 N 必要在 F 检验中获得统计显着性(方差分析:重复测量,在因素内),给定 α (0.05)、功效 (1-β, 0.95)、测量次数(T0、T4、T16 和T32) 和效应量(f = 0.4;较大的效应量,给出了更具临床相关性的结果)。 输出 N 为 15,临界 F= 2.82705。

用于临床、流式细胞术和转录组学数据。 HC 和 T0(治疗前)患者之间的横截面比较遵循正态分布并具有方差同质性,将通过使用 t 检验进行。 对于非正态分布的变量,我们将使用 Mann-Whitney U 检验。 将使用 RM-ANOVA 测试不同研究变量响应美泊利单抗治疗的变化(纵向研究;T0、T4、T16 和 T32)。 多变量分析(例如 PCA、无监督聚类)以及功能富集分析将使用流式细胞仪进行,最重要的是转录组数据。

对于总蛋白质组表征和定量 SWATH 分析,我们将使用来自 ABSciex 的 ProteinPilotTM 5.0.1 软件,该软件具有用于数据库搜索的算法 ParagonTM 和用于数据分组的 ProgroupTM。 将使用人类特定的 Uniprot 数据库搜索数据。 将使用非线性拟合方法执行错误发现率,仅显示报告 1% 或更高的全局错误发现率的结果 [65]。

功能分析将由不同的开放获取软件执行。 FunRich(功能丰富分析工具),用于功能丰富和交互网络分析(http://funrich.org/index.html)。 对于统计,FunRich 使用超几何检验、BH 和 Bonferroni [66、67]。 我们将使用 DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) 或 GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) 进行基因本体富集和蛋白质-蛋白质相互作用,网络构建和聚类,我们将使用 String (https://string-db.org/) 或 Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68]。

对于 SWATH 数据,MarkerView 软件将使用主成分分析 (PCA) 为我们提供多变量统计分析,以比较样本中的数据。 每种蛋白质的平均 MS 峰面积将来自每个样品的 SWATH-MS 重复,然后使用 MarkerView 软件进行学生 t 检验分析,以根据为每一种蛋白质。 t 检验将表明每个变量区分两组的程度,报告为 P 值。 对于文库,将选择具有 1.5 上调或下调蛋白质的一组差异丰富的蛋白质(p 值 <0.05)。

限制

  • 如前所述,将安排 15 名受试者在研究的前半部分(36 周)接受美泊利单抗治疗。 我们期望至少 90% 的受试者完成这项研究。 然而,患者退出和不依从(或不依从)是临床研究中的常见事件。 在这种情况下,样本量将按比例膨胀。
  • 本项目已被提议作为发现响应美泊利单抗的分子生物标志物的研究。 这种研究可以通过有针对性/假设驱动或更广泛/无针对性(“组学”技术)方法进行。 我们知道,在这个小型的前瞻性/概念验证研究中找到预测标记可能具有挑战性。 在本项目中,我们提出了一种双重方法来最小化这种风险。 一方面,现代和非靶向方法可用于检测低丰度蛋白质 (SWATH MS) 或简化方案以处理困难样品(由于存在丰富的蛋白质,从嗜酸性粒细胞生成优质 RNA 总是具有挑战性)像 EDN,RNase 家族的成员)并减少技术差异(例如,nCounter nanoString)以缩短样本量。 另一方面,假设驱动的方法(例如,流式细胞术、RT-​​qPCR、ELISA)具有可信度更高、I 型(即错误发现)和 II 型错误风险更小以及未来易于复制的优点结果。 这些靶向方法也将用于确认仅具有临床相关性(高效应量)和显着(p 值 < 0.05)的差异,这些差异是通过非靶向转录组学/蛋白质组学方法获得的。
  • 另一个潜在的限制是嗜酸性粒细胞的数量,在接受美泊利单抗治疗后,某些患者的嗜酸性粒细胞数量可能较低(50 x 103 或更低)。 因此,可能有必要在这些患者中纯化超过 1 或 2 mL 的血液,以获得足够的细胞来进行蛋白质组学和转录组学实验。 我们已经在研究方案和项目预算中考虑了这个问题。
  • 最后,TripleTOF 是一款高度灵敏的质谱仪,旨在更深入地研究嗜酸性粒细胞蛋白质组等复杂样品。 当前质谱仪的高灵敏度与 nanoLC 的二维方案相结合,允许检测更多数量的蛋白质 (>1000) 和浓度在阿托摩尔范围 (10-18) 的分析物,足以检测低丰度的细胞内蛋白质,如趋化因子或细胞因子。 因此,纳米 LC-MS/MS (Q-TOF) 已检测到 TGFα、TGFβ1、CCL5、CCL23、CSF1、CCL18、CCL24、CXCL12 和 IL-18,但未检测到其他如 IL-5 或 IL-13 [69 ]. 这种预期的限制是由于来自高丰度蛋白质(例如,嗜酸性粒细胞蛋白)的肽的存在抑制了 LC-MS/MS 应用中来自低丰度蛋白质的肽的电离。 这导致检测到的丰富物种蛋白质列表中的比例过高,例如 Charcot-Leyden 晶体蛋白(CLC,galectin-10),这对于本项目来说仍然很有趣,因为它可以识别具有调节能力的嗜酸性粒细胞。 然而,为了降低样品复杂性和提高低丰度蛋白质的检测,我们可以使用不同的去除方法(例如 ACN 去除、超滤、1-DE)和富集方法(例如 CPLL)来获得检测灵敏度。 可选地,有针对性的方法,例如高多重免疫测定(例如,Olink 免疫反应、Olink 炎症或 Olink 免疫肿瘤学面板;https://www.olink.com/) 具有低体积生物样品(例如细胞裂解物)的高检测灵敏度的优势,即使一次只允许测量 92 种蛋白质生物标志物。

研究类型

观察性的

注册 (估计的)

30

联系人和位置

本节提供了进行研究的人员的详细联系信息,以及有关进行该研究的地点的信息。

学习联系方式

研究联系人备份

学习地点

      • A Coruña、西班牙、15006
      • Ourense、西班牙、32005
    • A Coruña
      • Ferrol、A Coruña、西班牙、15405
      • Santiago De Compostela、A Coruña、西班牙、15706
    • Pontevedra
      • Vigo、Pontevedra、西班牙、36211
        • 尚未招聘
        • Hospital Povisa - Grupo Ribera Salud
        • 接触:

参与标准

研究人员寻找符合特定描述的人,称为资格标准。这些标准的一些例子是一个人的一般健康状况或先前的治疗。

资格标准

适合学习的年龄

18年 至 75年 (成人、年长者)

接受健康志愿者

是的

取样方法

非概率样本

研究人群

根据 ERS/ATS 标准严重未控制的哮喘 血液中持续嗜酸性粒细胞增多(>300 个细胞/μL)

描述

纳入标准:

  • 根据 ERS/ATS 标准诊断严重未控制的哮喘
  • 血液中持续嗜酸性粒细胞增多(>300 个细胞/μL)
  • 频繁加重(每年≥两次)
  • 签署知情同意书并同意遵守研究的所有访问以及由此产生的所有程序。

排除标准:

  • 吸烟史:吸烟史≥10 包年的当前吸烟者或既往吸烟者
  • 临床上重要的除哮喘以外的肺部疾病(例如 活动性肺部感染、慢性阻塞性肺病、支气管扩张、肺纤维化、囊性纤维化、与肥胖相关的通气不足综合征、肺癌、α1 抗胰蛋白酶缺乏症和原发性纤毛运动障碍)或曾经被诊断患有除哮喘以外的肺部或全身性疾病,与外周嗜酸性粒细胞计数升高有关
  • • 任何疾病,包括但不限于心血管、胃肠道、肝、肾、神经、肌肉骨骼、感染、内分泌、代谢、血液、精神或研究者认为不稳定的主要身体损伤。
  • 恶性肿瘤:当前恶性肿瘤或既往癌症缓解期病史。
  • 就诊 1 前 30 天内出现需要抗生素或抗病毒药物的急性上呼吸道或下呼吸道感染。
  • Xolair:之前接受过奥马珠单抗(Xolair)或其他单克隆抗体的参与者。
  • 在第 1 次就诊前 30 天内接受过全身性皮质类固醇治疗的参与者 [53]。
  • 怀孕:怀孕或哺乳的参与者。
  • 肥胖等级 2 级或更高(BMI≥ 35 kg/m2)

学习计划

本节提供研究计划的详细信息,包括研究的设计方式和研究的衡量标准。

研究是如何设计的?

设计细节

  • 观测模型:病例对照
  • 时间观点:预期

队列和干预

团体/队列
干预/治疗
控制
健康成人
严重嗜酸性哮喘
根据 ERS/ATS 标准的严重未控制哮喘和血液中持续的嗜酸性粒细胞增多(>300 个细胞/μL)
使用流式细胞术、转录组学和蛋白质组学技术发现对美泊利单抗反应的预测/预后生物标志物。

研究衡量的是什么?

主要结果指标

结果测量
措施说明
大体时间
使用流式细胞仪技术测量嗜酸性粒细胞和嗜酸性粒细胞亚群表面标志物响应美泊利单抗治疗的变化
大体时间:32周
流式细胞术检测与多标记面板 1(监管)、2(激活)和 3(嗜酸性粒细胞亚群)
32周
使用 LC-MS/MS 测量美泊利单抗治疗后中低丰度血清蛋白的变化
大体时间:32周
患者低丰度血清蛋白质组中多种蛋白质水平的变化,测量为第 4 周和第 32 周 (SWATH-MS) 时与基线 (T=0) 的比率,以及患者与健康对照 (T=0) 的比率在 T=0 时。
32周

次要结果测量

结果测量
措施说明
大体时间
转录组学分析,用于鉴定嗜酸性粒细胞转录组内的 mRNA,显示响应于美泊利单抗治疗的增强或降低水平。
大体时间:32周
通过名为 nCounter® NanoString 的直接多重分子测量平台结合预制的 "nCounter® Human Myeloid先天免疫面板 (v2)"
32周

合作者和调查者

在这里您可以找到参与这项研究的人员和组织。

合作者

调查人员

  • 首席研究员:FRANCISCO-JAVIER GONZALEZ-BARCALA, MD, PHD、CLINIC UNIVERSITY HOSPITAL

出版物和有用的链接

负责输入研究信息的人员自愿提供这些出版物。这些可能与研究有关。

一般刊物

研究记录日期

这些日期跟踪向 ClinicalTrials.gov 提交研究记录和摘要结果的进度。研究记录和报告的结果由国家医学图书馆 (NLM) 审查,以确保它们在发布到公共网站之前符合特定的质量控制标准。

研究主要日期

学习开始 (实际的)

2021年4月1日

初级完成 (估计的)

2023年12月31日

研究完成 (估计的)

2025年3月1日

研究注册日期

首次提交

2020年11月18日

首先提交符合 QC 标准的

2020年11月18日

首次发布 (实际的)

2020年11月24日

研究记录更新

最后更新发布 (实际的)

2023年9月25日

上次提交的符合 QC 标准的更新

2023年9月21日

最后验证

2023年9月1日

更多信息

与本研究相关的术语

计划个人参与者数据 (IPD)

计划共享个人参与者数据 (IPD)?

IPD 计划说明

个人资料保密

研究数据/文件

  1. 研究协议
    信息标识符:FGBMEP202001
    信息评论:研究方案已添加到 clinicaltrials.gov

药物和器械信息、研究文件

研究美国 FDA 监管的药品

是的

研究美国 FDA 监管的设备产品

在美国制造并从美国出口的产品

此信息直接从 clinicaltrials.gov 网站检索,没有任何更改。如果您有任何更改、删除或更新研究详细信息的请求,请联系 register@clinicaltrials.gov. clinicaltrials.gov 上实施更改,我们的网站上也会自动更新.

美泊利单抗 100 毫克的临床试验

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