Účinek mepolizumabu na těžké eozinofilní astma (EMESEA)

Hypotézy

Hº1. Hladiny určitých povrchových molekul na eozinofilech nebo přítomnost či nepřítomnost určitých proteinů v proteomu této podskupiny leukocytů před léčbou mepolizumabem lze použít jako prediktivní/prognostické markery odpovědi na tuto biologickou látku.

Hº2. Mepolizumab mění hojnost několika povrchových nebo intracelulárních proteinů v eozinofilech jako výsledek související se změnami jejich aktivačního stavu, migrační schopnosti, regulační/efektorové funkce nebo složení podskupiny.

Hº3. Závažní eozinofilní astmatici s pozdním nástupem mají zvýšení sérové ​​koncentrace různých členů rodiny IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) a léčba mepolizumabem tyto hladiny snižuje a chová se jako biomarker odpovědi spolu s počtem eozinofily a klinické exacerbace.

Cíle nebo výzkumné otázky

OB (Aspirační cíl): Objev prediktivních/prognostických biomarkerů odpovědi na mepolizumab pomocí průtokové cytometrie, transkriptomických a proteomických technologií.

• OB1.- Identifikovat změny povrchových markerů eozinofilů a eozinofilních subpopulací v reakci na léčbu mepolizumabem pomocí technik průtokové cytometrie. Tento cíl je distribuován v následujících výstupech (DE):

  • DE1.1: Výběr 15 zdravých kontrol
  • DE1.2: Diagnostika pacientů s pozdním nástupem těžkého eozinofilního astmatu a výběr 15 pacientů, kteří splňují kritéria, mají dostávat mepolizumab a podepisují informovaný souhlas.
  • DE1.3: Vytváření počáteční databáze pro zdravé kontrolní skupiny a pacienty s astmatem s demografickými, klinickými, hematologickými a biochemickými informacemi.
  • DE1.4: Odběr a zpracování vzorků séra (1 zkumavka SST) a plné krve (1–2 zkumavky) od zdravých dárců (T0) a pacientů léčených mepolizumabem (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Testy průtokové cytometrie s multimarkerovými panely 1 (regulační), 2 (aktivace) a 3 (podskupiny eozinofilů) (viz níže).
  • DE1.6: Doplňte databázi o klinická, hematologická, biochemická a průtoková cytometrická data generovaná v časech T4, T16 a T32. Finální uni- a multivariantní statistická analýza.
  • DE1.7: Zveřejnění výsledků.

• OB2.- Transkriptomická analýza k identifikaci mRNA v eosinofilním transkriptomu vykazující zvýšené nebo snížené hladiny v reakci na léčbu mepolizumabem. Tento cíl je distribuován v následujících výstupech (DE):

  • DE2.1: Nastavte protokol pro izolaci eozinofilů a zkontrolujte čistotu buněk průtokovou cytometrií.
  • DE2.2: Purifikace eozinofilů od 15 zdravých dárců (T0) a 15 pacientů (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Celková extrakce RNA z eozinofilních lyzátů, test kvality a kvantity RNA a skladování při -80ºC.
  • DE2.4: Přístup založený na objevech/hypotézách. Hodnocení hladin 770 lidských proteinů kódujících mRNA spojených s náborem, aktivací a efektorovými funkcemi myeloidních buněk pomocí platformy pro přímé multiplexní molekulární měření nazvané nCounter® NanoString) v kombinaci s předem připraveným „nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)“ (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Vzhledem k vysokým ekonomickým nákladům bude tato část studie prováděna pouze se vzorky eozinofilů od zdravých dárců (T = 0) a dvěma časovými body u pacientů (T = 0 a T = 16).
  • DE2.5: Zpracování získaných dat a vstupní statistická analýza.
  • DE2.6: Validace dat nCounter® a přístup řízený hypotézami se zavedenou kvantitativní technikou. Proveďte retrotranskripční a qPCR analýzy těch mRNA v eozinofilech, které vykazují největší změny v četnosti v reakci na léčbu mepolizumabem podle studie nCounter®. Kromě toho budou analyzovány některé další mRNA nezahrnuté v panelu "nanoString Myeloid Innate Immunity", jako je FOXP3 (regulační funkce), CRLF2, ST2 nebo IL-7R (cytokinové receptory; aktivace). Gen HPRT1 bude použit jako provozní gen v této sadě experimentů RTqPCR.
  • DE2.7: Uni- a multivariantní statistické analýzy.
  • DE2.8: Publikování výsledků transkriptomie.

• OB3.- Proteomické profilování k identifikaci proteinů s rozdílným výskytem v eozinofilech v reakci na léčbu mepolizumabem. Tento cíl je distribuován v následujících výstupech (DE):

  • DE3.1: Lýza eozinofilů, odstranění nerozpustného materiálu centrifugací, kvantifikace proteinu (BCA) a skladování buněčných supernatantů při -80 °C.
  • DE3.2: Vyvinout protokol analýzy celkového proteomu s metodou Data Dependent Acquisition (DDA) pomocí technologie kapalinové chromatografie (LC)-MS / MS (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Zkontrolujte biologickou variabilitu (biologické replikace) a techniku ​​(technické repliky) pro kontrolu reprodukovatelnosti testů.
  • DE3.4: Zachování standardizovaných podmínek LC-MS / MS (TripleTOF), vytvoření knihovny pro SWATH (sekvenční okno získávání všech teoretických hmotnostních spekter) s co největším počtem eozinofilních proteinů.
  • DE3.5: Proveďte analýzu SWATH-MS ve vzorcích od 15 zdravých dárců a 15 pacientů (T0, T4, T16, T32) (metoda "informace závislá akvizice" nebo IDA; "Targeted label-free proteomics").
  • DE3.6: Zpracování získaných dat a vstupní statistická analýza.
  • DE3.7: Kontrola panelu biomarkerů získaných jinou technologií (např. monitorování vybrané reakce / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Finální uni- a multivariantní statistická analýza. Identifikujte proteiny s významnými rozdíly mezi skupinami (P < 0,05) a alespoň násobnou změnou ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publikování proteomických výsledků

• OB4. Zkontrolujte, zda těžcí eozinofilní astmatici s pozdním nástupem vykazují zvýšené hladiny IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS ve vzorcích séra, zda odpověď na mepolizumab závisí na hladinách těchto markerů a zda léčba tímto biologickým prostředkem snižuje koncentraci v sérum těchto členů rodiny IGF. Tento cíl je distribuován v následujících výstupech (DE):

  • DE4.1: Analýza IGF-1, IGF-BP3 a IGF-ALS pomocí ELISA
  • DE4.2: Uni- a multivariantní statistická analýza experimentálních dat
  • DE4.3: Zveřejnění výsledků

Zveřejnění výsledků:

Budeme se snažit prezentovat během prvního roku studie na Španělském respiračním kongresu (SEPAR) i na Evropském respiračním kongresu (ERS) sdělení vyplývající ze studia klinických dat pacientů před a po podání mepolizumabu. . Kromě toho počítáme s publikováním 3 publikací v časopisech za 1. čtvrtletí a dalších 2 nebo 3 kongresových sdělení vyplývajících z experimentálních studií.

Populace ve studii Populace ve studii bude zahrnovat zdravé kontrolní skupiny (tj. subjekty bez astmatu, alergie, systémových onemocnění nebo plánované na menší chirurgické zákroky) a pacienty s pozdním nástupem těžkého eozinofilního astmatu, kteří se budou rekrutovat z různých oblastí Galicie (Santiago de Compostela, A Coruña, Lugo, Vigo a Ourense), Španělsko. Diagnóza pacientů s těžkým eozinofilním astmatem při screeningu bude založena na několika kritériích zařazení a vylučovacích kritériích, která popisujeme níže [12].

Kritéria pro zařazení:

• Diagnóza těžkého nekontrolovaného astmatu podle kritérií ERS/ATS [52].
• Přetrvávající eozinofilie v krvi (>300 buněk/μl) při ≥ dvou případech (více než 4 týdny mezi každým měřením).
• Časté exacerbace (≥ dvě za rok), definované jako období ≥ 3 dnů bez kontroly astmatu vyžadující léčbu systémovými kortikosteroidy a/nebo návštěvu pohotovostního oddělení (ED) a/nebo hospitalizaci.
• Podpis informovaného souhlasu a souhlas s dodržováním všech návštěv studie a všech postupů, které to obnáší.

Kritéria vyloučení:

• Kouření v anamnéze: Současní kuřáci nebo bývalí kuřáci s kuřáckou historií ≥ 10 let v balení (počet let v balení = (počet cigaret za den/20) x počet vykouřených let). Bývalý kuřák je definován jako účastník, který přestal kouřit alespoň 6 měsíců před návštěvou 1.
• Klinicky závažné plicní onemocnění jiné než astma (např. aktivní plicní infekce, chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN), bronchiektázie, plicní fibróza, cystická fibróza, hypoventilační syndrom spojený s obezitou, rakovina plic, deficit alfa 1 antitrypsinu a primární ciliární dyskineze) nebo kdy byla diagnostikována plicní nebo systémová choroba jiné než astma, které jsou spojeny se zvýšeným počtem periferních eozinofilů (např. alergická bronchopulmonální aspergilóza/mykóza, Churg-Straussův syndrom, hypereozinofilní syndrom).
• Jakákoli porucha, včetně mimo jiné kardiovaskulárního, gastrointestinálního, jaterního, renálního, neurologického, muskuloskeletálního, infekčního, endokrinního, metabolického, hematologického, psychiatrického nebo závažného fyzického postižení, které není podle názoru zkoušejícího stabilní.
• Malignita: Současná malignita nebo předchozí anamnéza rakoviny v remisi.
• Akutní infekce horních nebo dolních cest dýchacích vyžadující antibiotika nebo antivirovou léčbu během 30 dnů před návštěvou 1.
• Xolair: Účastníci, kteří dříve dostávali omalizumab (Xolair) nebo jinou monoklonální protilátku.
• Účastníci, kteří dostali systémové kortikosteroidy během 30 dnů před návštěvou 1 [53].
• Těhotenství: Účastnice, které jsou těhotné nebo kojící.
• Třída obezity 2 nebo vyšší (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Velikost vzorku

• Kohorta zdravých kontrol (n=15) pouze pro analýzu při T = 0.

• Kohorta n=15 subjektů s těžkým eozinofilním astmatem, kteří zahajují léčbu mepolizumabem bez úpravy jejich aktuálně předepisovaných léků. Následné studijní návštěvy ve 4 (T4), 16 (T16) a 32 (T32) týdnech po původní studijní návštěvě (T=0).

  • Zdůvodnění velikosti vzorku je vysvětleno ve statistické části.

Předpokládaná míra náboru Vzhledem k tomu, že se bude jednat o multicentrickou studii, očekáváme, že dosáhneme míry náboru alespoň 2 těžkých eozinofilních astmatiků počínaje léčbou mepolizumabem za měsíc (4 týdny) v každé nemocnici (celkem = 8 měsíčně). To znamená, že 15 subjektům by mělo být naplánováno, že budou dostávat mepolizumab během prvních 36 týdnů této studie, aby měli dostatek času na dokončení studie za 72 týdnů (1,5 roku). Očekáváme také, že tuto studii dokončí alespoň 90 % subjektů.

Předpokládané datum zahájení studia: prosinec 2020 Předpokládané datum ukončení studia: 1,5 roku (72 týdnů)

Návrh a metody studie

Obrázek 2. Návrh studie. Tento obrázek představuje schematickým způsobem jak klinickou, tak experimentální část studie.

Jedná se o observační, longitudinální, prospektivní a multicentrickou studii hodnotící jak časnou odpověď (4 týdny), tak pozdní odpověď (16 a 32 týdnů) na léčbu mepolizumabem u těžkých eozinofilních astmatiků. Studii povede Dr. Francisco Javier González Barcala (pneumologická služba na CHUS). Dr. Barcala byl národním koordinátorem v jednom klinickém hodnocení a také hlavním zkoušejícím a subřešitelem ve 41, respektive 19 klinických studiích. Kromě toho byl Dr. Barcala hlavním řešitelem 7 výzkumných projektů, spolupracoval na dalších 7 projektech a publikoval více než 120 relevantních publikací (recenzovaných a indexovaných podle JCR) v oblasti respiračních onemocnění, zejména astmatu.

Studie zahrnuje také další členy Multidisciplinární astmatické jednotky (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Zejména projektový manažer Dr. Salgado se podílel na 11 výzkumných projektech, má 28 výzkumných prací v impaktovaných časopisech z oblastí imunologie, biochemie, proteomiky a respiračních onemocnění. Kromě toho mají ostatní účastníci tohoto projektu rozsáhlé zkušenosti ve svých příslušných oborech, a to jak v základním, tak v translačním výzkumu. Jsou to Dra. Marina Blanco Aparicio, odpovědná za oddělení astmatu v komplexu univerzitní nemocnice v A Coruña (CHUAC), Dr. Uxío Calvo v komplexu univerzitní nemocnice Ferrol (CHUF) a Coral González v komplexu univerzitní nemocnice v Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro v nemocnici Alvaro Cunqueiro ve Vigu; Dolores Corbacho v nemocnici Povisa-Vigo. Bude nutné najmout výzkumníka v preddoktorské fázi na 12 měsíců, aby provedl přípravu vzorků v transkriptomických a proteomických studiích a dále v RTqPCR, průtokové cytometrii a ELISA testech. Tento výzkumník bude pod dohledem Dr. Francisco Javier Salgado Castro a Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplinární astmatická jednotka, CHUS). Proteomické experimenty provede Dr. Susana Belén Bravo López a María García Vence, které pracují na Proteomické platformě v Sanitary Research Foundation of Santiago de Compostela (FIDIS). Analýza nCounter® bude provedena prostřednictvím služby nabízené skupinou GENVIP (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Výzkumný projekt bude minimálně invazivní (např. žádná bronchoskopická vyšetření), ale protokol musí být přezkoumán a schválen Etickou komisí klinického výzkumu v Galicii, Španělsko. Do této studie bude zařazeno pouze patnáct pacientů, kteří splňují kritéria pro diagnózu těžkého astmatu s pozdním nástupem, mají dostávat mepolizumab a podepíší informovaný souhlas. Stejný protokol budou následovat různé klinické týmy. Demografické, stejně jako klinické, hematologické a biochemické proměnné budou zahrnuty do databáze. Pro kontrolu alergické senzibilizace bude použit kožní prick test na běžné alergeny a na přítomnost alergen-specifických IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher). Budou také analyzovány parametry plicních funkcí (objem usilovně vydechovaného v 1. sekundě (FEV1), usilovná vitální kapacita (FVC) a poměr FEV1/FVC). Spirometrie bude provedena před a po použití bronchodilatátoru. Bude proveden Asthma Control Test (ACT) a dotazník Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ). Astmatici musí být ve stabilní fázi onemocnění (tj. nepřítomnost exacerbací alespoň 4 týdny před odběrem vzorku). Exacerbace budou řízeny v souladu se standardními klinickými doporučeními. Pacienti (n=15) dostanou 100 mg subkutánní injekce mepolizumabu ve 4týdenních intervalech a vzorky krve a séra (2–3 zkumavky EDTA; 1 zkumavka SST) budou odebírány v T=0, 4, 16 a 32 týdnech, s cílem vyhodnotit jak časnou odpověď (4 týdny), tak pozdní odpověď (16 a 32 týdnů) na léčbu.

Metody

• Zkumavky: EDTA (kompletní krev) a SST (sérum)

• Čištění eozinofilů

  • Eozinofily lze izolovat z plné krve (heparinové zkumavky) pomocí sady Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (katalogové č. 130-104-466) nebo EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (katalogové č. 17956), oba postupy negativní selekce, které poskytují nedotčené podskupiny tyto leukocyty. Očekáváme kolem minimálně 1,0-4,0 x 106 buněk z ~20 ml krve, ale také vysoká životaschopnost a čistota (>95 %).

• Studie ELISA.

  • Sběr vzorků séra: Měření IGF-ALS (96 jamek GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalogové č. DY291) a IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalogové č. DY675) pomocí ELISA.

• Celková purifikace RNA z eozinofilů a analýza nCounter nanoString (přístup založený na objevech/hypotézách):

  • Purifikované eozinofily od zdravých kontrol (T=0) a pacientů (T=0, 4, 16 a 32 týdnů) budou skladovány při -80ºC v roztoku RNAlater (Ambion, Paisley, UK). Celková RNA bude izolována pomocí soupravy RNeasy Mini kit (Qiagen) a po kontrole kvality a koncentrace RNA (Nanodrop) uložena při -80ºC.
  • Platforma nCounter® (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) je multiplexní metodika, která umožňuje kvantifikaci až 800 RNA, DNA nebo proteinových cílů. Pokud jde o molekuly mRNA, tato technologie je založena na hybridizaci každé mRNA v roztoku se dvěma komplementárními oligonukleotidy: biotinylovanou mRNA specifickou sondou a mRNA specifickým oligonukleotidem obsahujícím sekvenční kombinaci šesti fluorochromů (čtyř různých barev), které vytvářejí fluorescenční čárový kód, který identifikuje specifickou detekovanou mRNA. Jakmile je přebytek obou sond odstraněn, hybridizované komplexy jsou zachyceny prostřednictvím interakce biotin-streptavidin a zarovnány na kazetě, aby přístroj nCounter mohl číst tyto "čárové kódy". K provedení těchto kroků se platforma nCounter skládá ze dvou nástrojů: Prep Station, která provádí čištění hybridizovaných komplexů a jejich imobilizaci na povrchu kazety, a Digital Analyzer (DA), skeneru, který identifikuje a počítá čárové kódy zachycené pro každý vzorek. Tato kvantitativní analýza Proto lze každou miRNA kvantifikovat individuálně (absolutní kvantifikace; počty) z obtížných vzorků (např. eozinofilů) bez potřeby dalších požadavků, jako je konverze mRNA-cDNA (RT) nebo amplifikace DNA (qPCR), což vede k menší variabilita dat (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Kromě toho je množství vstupního materiálu nízké (25 ng-300 ng mRNA) a může být odvozeno z FFPE odvozené RNA, celkové RNA, fragmentované RNA, buněčných lyzátů a tříděných buněk. Poté budou data nCounter normalizována, odečten šum pozadí a provedena další korekce, aby se zohlednila účinnost extrakce (vypočteno na základě exprese spike-in miRNA, které budou přidány do vzorku v definovaném množství před extrakcí miRNA ). Normalizace budou provedeny pomocí balíčku R NanoStringNorm. Po normalizaci bude provedena log2 transformace dat a následně analyzována pomocí balíčku LIMMA Bioconductor, aby se identifikovaly ty mRNA vykazující rozdílné množství po léčbě mepolizumabem. Tato analýza nebude trvat déle než 24 hodin.

• Studie RTqPCR (přístup řízený hypotézami):

  • Pro analýzu hladin mRNA kódujících proteiny související s aktivací eozinofilů zprostředkovanou alarminem (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) a s regulační funkcí eozinofilů (FOXP3) od pacientů léčených mepolizumabem bude celková RNA přepsána do cDNA (QuantiTect Rev. Transscription Kit; Qiagen) a skladujte při -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) bude provedena v přístroji LightCycler® 96 (Roche Life Science) a bude použita k analýze exprese FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R a genu HPRT1 (endogenní kontrola).

• Studie průtokové cytometrie (přístup řízený hypotézami):

  • Vzorky periferní krve ošetřené EDTA od zdravých kontrol (n=15; T0) a pacientů léčených mepolizumabem (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Označte 100 μl/zkumavku plné periferní krve (EDTA) jak specifickými, tak isotypově shodnými kontrolními protilátkami (BD). Lyze červených krvinek pomocí FACSlyse (BD). Analýza průtokovým cytometrem FACSCalibur (BD). Použijte FSC/SSC k výběru granulocytů; pak SSC vs CCR3 (FITC) k oddělení eozinofilů od neutrofilů. Brána eozinofilů:

    • Multimarkerový panel 1 (Regulační proteiny v eozinofilech): Měření CD16 a galektinů-1/10 [41-44].
    • Multimarkerový panel 2 (Aktivační receptory v eozinofilech): Měření CD48 (snížení celkového počtu eozinofilů se středně těžkým až těžkým astmatem ve srovnání se zdravými kontrolami (HC) [naše studie, 54]), CD44 a CD11b.
    • Multimarkerový panel 3 (podskupiny eosinofilů): Analýza podskupin na základě exprese Siglec-8, CD62L (L-selektin) a IL-5Rα [40].

• Analýza eozinofilního proteomu (přístup založený na objevu/hypotéze):

  • K provedení proteomických testů bude zapotřebí až 50 x 103 buněk. Očekáváme přibližně 50-400 x 103 buněk z ~ 1 ml krve.
  • Izolované eozinofily (50 x 103 buněk) budou odebrány centrifugací, promyty a resuspendovány v lyzačním pufru s inhibitory proteinázy. Poté se nerozpustný materiál odstraní centrifugací a buněčné supernatanty se skladují při -80 °C.
  • U eozinofilů bude celková charakterizace proteomu provedena po štěpení trypsinem pomocí metody DDA v systému LC-MSMS. K tomuto přístupu použijeme vzorky od 15 zdravých dárců a 15 pacientů (T0, T4, T16, T32). Vybrané proteiny budou pouze ty, které vykazovaly 1% Global false discovery rate (FDR) nebo lepší [55, 56].
  • Budou použity proteinové "pooly" z 5 skupin studie (zdraví dárci a pacienti v čase T0, T4, T16 a T32 po léčbě), které se rozdělí (1-DE) do 5-6 pásů, přičemž se z každé extrahují proteiny. generováním odpovídajících peptidů a jejich analýzou pomocí MS/MS za účelem vytvoření knihovny pro SWATH s vysokým počtem proteinů, na kterých bude následně provedena kvantifikace. Jakmile bude knihovna vytvořena a zachováme standardizované podmínky LC-MS / MS (TripleTOF), provedeme analýzu SWATH-MS (metoda "informace závislá akvizice" nebo IDA; "Targeted label-free proteomics") ve vzorcích z 15 zdravých dárců a 15 pacientů (T0, T4, T16, T32). Tento test nám umožní identifikovat proteiny s významnými rozdíly mezi skupinami studie. Vybrané proteiny budou pouze ty s P<0,05 a násobnou změnou ≥1,5 [56-59].

Cíle studie:

Demografické údaje pro všechny jednotlivce zařazené do studie budou získány jako bazální. Kromě toho bude shromážděno několik údajů, včetně anamnézy astmatu, parametrů plicních funkcí, kožního prick testu, alergen-specifického IgE, skóre AQLQ, skóre ACT, počtu exacerbací a spotřeby prednisonu. Během následujících návštěv pneumologické služby v T0, 4, 16 a 32 budou pacienti léčení mepolizumabem sledováni. To zahrnuje měření funkce plic (FEV1, FEV1/FVC), biochemických a hematologických parametrů.

Budou odebrány vzorky periferní krve a séra a magneticky purifikovány eozinofily v T0, T4, T16 a T32 a bude provedena průtoková cytometrie, RTqPCR a proteomické analýzy, stejně jako imunotesty. Všechny experimentální proměnné (např. hojnost eozinofilních proteinů v proteomických testech, markery eozinofilní aktivace, …) budou korelovány s klinickými parametry (např. plicní funkce, kontrola astmatu, počet exacerbací), aby bylo možné posoudit asociaci těchto proměnných. s reakcí na léčbu. Budeme zvažovat příznivou odpověď na mepolizumab, pokud je splněno jedno z následujících kritérií:

• K dosažení adekvátní kontroly astmatu ACT ≥ 20 [60] nebo/ změna o ≥ 3 body představující minimálně významný rozdíl.
• Dosáhnout snížení roční míry exacerbací o 48 %. Exacerbace je definována jako nárůst příznaků vyžadujících léčbu systémovými kortikosteroidy po dobu ≥3 nebo neplánovanou lékařskou konzultaci, podobně jako v klinických studiích s mepolizumabem [20, 61].
• Získejte 50% snížení ročního počtu hospitalizací v důsledku exacerbace astmatu, podobně jako v klinických studiích [62].
• Dosáhnout snížení střední roční dávky systémových kortikosteroidů o 50 % [63].

• Primární cílové parametry studie:

  • Hladiny IGF-1, IGF-BP3 a IGF-ALS v séru
  • Data exprese transkriptomické (nanoString)/mRNA: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomická data
  • Údaje z průtokové cytometrie: Exprese CD16, galektinů-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L a IL-5Ra

• Sekundární koncové body studie:

  • Parametry funkce plic (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hematologické parametry (např. počet eozinofilů).
  • Jiné klinické a biochemické proměnné (např. IgE nebo jiné imunoglobuliny).
  • Počet exacerbací, spotřeba prednisonu, ACT skóre, AQLQ skóre.

Statistický plán nebo analýza dat:

Pro tvorbu grafiky poslouží Graph Pad Prism. Pro statistickou studii bude použit IBM SPSS, Statistics 22.0 nebo R. Během analýz nám bude pomáhat oblast statistiky a operačního výzkumu USC (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Velikost vzorku Výpočet velikosti vzorku (N) byl proveden pomocí G*Power 3.1.9.4 [64]. Během těchto analýz vypočítáme N nezbytné získat statistickou významnost v F testu (ANOVA: Opakovaná měření, v rámci faktorů), za předpokladu α ​​(0,05), síly (1-β, 0,95), počtu měření (T0, T4, T16 a T32) a velikost účinku (f = 0,4; velká velikost účinku, která dává klinicky relevantnější výsledky). Výstup N byl 15 s kritickým F= 2,82705.

Pro klinická data, průtoková cytometrie a transkriptomická data. Průřezová srovnání mezi HC a pacienty v TO (před léčbou) po normální distribuci a majících homogenitu rozptylů budou provedena pomocí t-testu. Pro nenormálně distribuované proměnné použijeme Mann-Whitney U test. Změny v různých proměnných studie v reakci na léčbu mepolizumabem (longitudinální studie; T0, T4, T16 a T32) budou testovány pomocí RM-ANOVA. Multivariační analýza (např. PCA, shlukování bez dozoru) stejně jako analýza funkčního obohacení budou prováděny průtokovou cytometrií a především transkriptomickými daty.

Pro celkovou charakterizaci proteomu a kvantitativní analýzu SWATH použijeme software ProteinPilotTM 5.0.1 od ABSciex, který má algoritmus ParagonTM pro vyhledávání v databázi a ProgroupTM pro seskupování dat. Data budou prohledávána pomocí databáze Uniprot specifické pro člověka. Míra falešných objevů bude provedena pomocí metody nelineárního přizpůsobení zobrazující pouze ty výsledky, které vykazovaly 1% globální míru falešných objevů nebo lepší [65].

Funkční analýza bude provedena pomocí různého softwaru s otevřeným přístupem. FunRich (nástroj pro analýzu funkčního obohacení) pro síťovou analýzu funkčního obohacení a interakce (http://funrich.org/index.html). Pro statistiku využívá FunRich hypergeometrický test, BH a Bonferroni [66, 67]. Použijeme DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) nebo GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) pro obohacení genové ontologie a pro interakci protein-protein, síť konstrukce a shlukování, použijeme String (https://string-db.org/) nebo Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

Pro data SWATH nám software MarkerView poskytne vícerozměrnou statistickou analýzu pomocí analýzy hlavních komponent (PCA) k porovnání dat napříč vzorky. Průměrná plocha MS píku každého proteinu bude odvozena z replikátů SWATH-MS každého vzorku následovaného Studentovou t-testovou analýzou pomocí softwaru MarkerView pro srovnání mezi vzorky na základě součtů průměrných ploch všech přechodů odvozených pro každý protein. T-test bude indikovat, jak dobře každá proměnná rozlišuje dvě skupiny, uváděné jako P-hodnota. Pro knihovnu bude vybrána její sada různě hojných proteinů (p-hodnota <0,05) s 1,5 up-regulovanými nebo down-regulovanými proteiny.

Omezení

• Jak již bylo uvedeno výše, 15 subjektům bude naplánováno dostávat mepolizumab během první poloviny studie (36 týdnů). Očekáváme, že tuto studii dokončí alespoň 90 % subjektů. Častým jevem v klinických studiích jsou však výpadky pacientů a non-adherence (nebo non-compliance). V takovém případě bude velikost vzorku úměrně nafouknuta.
• Tento projekt byl navržen jako studie objevu molekulárních biomarkerů v reakci na mepolizumab. Tento druh studií lze realizovat prostřednictvím cílených/hypotézou řízených nebo širších/necílených ("-omické" technologie) přístupů. Jsme si vědomi toho, že může být náročné najít prediktivní markery v této malé a prospektivní studii. V tomto projektu navrhujeme dvojí přístup k minimalizaci tohoto rizika. Na jedné straně fungují moderní a necílené metodiky, které jsou vysoce citlivé k detekci nízkoabundantních proteinů (SWATH MS) nebo zjednodušené protokoly pro práci s obtížnými vzorky (generování kvalitní RNA z eozinofilů je vždy náročné kvůli přítomnosti hojných proteinů). jako EDN, člen rodiny RNase) a snížit technické odchylky (např. nCounter nanoString), aby se zkrátila velikost vzorků. Na druhé straně přístupy řízené hypotézami (např. průtoková cytometrie, RT-qPCR, ELISA), s výhodami větší důvěryhodnosti, menšího rizika chyb typu I (tj. falešné zjištění) a II a snadné budoucí replikace výsledků. Tyto cílené metodologie budou také použity k potvrzení pouze klinicky relevantních (vysoká velikost účinku) a významných (p-hodnota < 0,05) rozdílů získaných necílenými transkriptomickými/proteomickými přístupy.
• Dalším potenciálním omezením je počet eozinofilů, který může být u některých pacientů po léčbě mepolizumabem potenciálně nízký (50 x 103 nebo nižší). Proto by mohlo být nutné vyčistit více než 1 nebo 2 ml krve u těchto pacientů, aby se dosáhlo dostatečného množství buněk pro provádění proteomických a transkriptomických experimentů. Tuto otázku jsme zohlednili v protokolu studie a v rozpočtu projektu.
• A konečně, TripleTOF je vysoce citlivý hmotnostní spektrometr navržený tak, aby se dostal hlouběji do komplexních vzorků, jako je proteom eozinofilů. Vysoká citlivost současných hmotnostních spektrometrů v kombinaci s dvourozměrnými schématy nanoLC umožňuje detekci vyšších počtů proteinů (>1000) a analytů v koncentracích v attomolárním rozsahu (10-18), což je dostatečné pro detekci málo hojných intracelulárních proteinů, jako jsou chemokiny nebo cytokiny. TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 a IL-18 tedy byly detekovány pomocí nanoLC-MS/MS (Q-TOF), ale ne jinými, jako je IL-5 nebo IL-13 [69 ]. Toto očekávané omezení je způsobeno přítomností peptidů z vysoce hojných proteinů (např. eosinofilních granulovaných proteinů), které potlačují ionizaci peptidů z málo zastoupených proteinů v aplikacích LC-MS/MS. To vede k nadměrnému zastoupení v seznamu detekovaných proteinů hojných druhů, jako je Charcot-Leydenův krystalový protein (CLC, galektin-10), který je pro tento projekt stále zajímavý, protože identifikuje eozinofily s regulačními schopnostmi. Aby se však snížila složitost vzorku a zlepšila se detekce proteinů s nízkým výskytem, ​​existují různé metody deplece (např. deplece ACN, ultrafiltrace, 1-DE) a obohacení (např. CPLL), které bychom mohli použít k získání detekce. citlivost. Volitelně cílené přístupy, jako jsou vysoce multiplexní imunotesty (např. panely Olink Immune Response, Olink Inflammation nebo Olink Immuno-Oncology; https://www.olink.com/) mají výhodu vysoké citlivosti detekce s malým objemem biologických vzorků (např. buněčných lyzátů), i když umožňují měření pouze 92 proteinových biomarkerů najednou.