Effet du mépolizumab sur l'asthme éosinophile sévère (EMESEA)

Hypothèses

Hº1. Les niveaux de certaines molécules de surface sur les éosinophiles ou la présence ou l'absence de certaines protéines dans le protéome de ce sous-ensemble de leucocytes avant le traitement par le mépolizumab peuvent être utilisés comme marqueurs prédictifs/pronostiques de la réponse à ce biologique.

Hº2. Le mépolizumab modifie l'abondance de plusieurs protéines de surface ou intracellulaires chez les éosinophiles en raison de changements dans leur statut d'activation, leur capacité migratoire, leur fonction régulatrice/effectrice ou leur composition de sous-ensembles.

Hº3. Les asthmatiques éosinophiles sévères d'apparition tardive présentent des élévations de la concentration sérique de différents membres de la famille des IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) et le traitement par le mépolizumab réduit ces niveaux et se comporte comme un biomarqueur de réponse avec le nombre de éosinophiles et exacerbations cliniques.

Objectifs ou questions de recherche

OB (Objectif ambitieux) : Découverte de biomarqueurs prédictifs/pronostiques de la réponse au mépolizumab à l'aide de technologies de cytométrie en flux, de transcriptomique et de protéomique.

• OB1.- Identifier les modifications des marqueurs de surface des éosinophiles et des sous-populations d'éosinophiles en réponse au traitement par le mépolizumab à l'aide de techniques de cytométrie en flux. Cet objectif est réparti dans les livrables suivants (DE) :

  • DE1.1 : Sélection de 15 témoins sains
  • DE1.2 : Diagnostic des patients asthmatiques à éosinophiles sévères d'apparition tardive et sélection de 15 patients répondant aux critères, devant recevoir du mépolizumab et signant le consentement éclairé.
  • DE1.3 : Génération de la base de données initiale pour les témoins sains et les patients asthmatiques avec des informations démographiques, cliniques, hématologiques et biochimiques.
  • DE1.4 : Collecte et traitement d'échantillons de sérum (1 tube SST) et de sang total (1-2 tubes) de donneurs sains (T0) et de patients traités par mépolizumab (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5 : Tests de cytométrie en flux avec panels multimarqueurs 1 (régulation), 2 (activation) et 3 (sous-ensembles d'éosinophiles) (voir ci-dessous).
  • DE1.6 : Compléter la base de données avec les données cliniques, hématologiques, biochimiques et de cytométrie en flux générées aux instants T4, T16 et T32. Analyse statistique finale uni- et multivariée.
  • DE1.7 : Publication des résultats.

• OB2.- Analyse transcriptomique pour identifier les ARNm dans le transcriptome des éosinophiles présentant des niveaux accrus ou réduits en réponse au traitement par le mépolizumab. Cet objectif est réparti dans les livrables suivants (DE) :

  • DE2.1 : Mettre en place un protocole d'isolement des éosinophiles et vérifier la pureté cellulaire par cytométrie en flux.
  • DE2.2 : Purification des éosinophiles de 15 donneurs sains (T0) et 15 patients (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3 : Extraction d'ARN total à partir de lysats d'éosinophiles, dosage de la qualité et de la quantité d'ARN et conservation à -80°C.
  • DE2.4 : Approche basée sur la découverte/génératrice d'hypothèses. Évaluation des niveaux de 770 ARNm codant pour des protéines humaines liés au recrutement, à l'activation et aux fonctions effectrices des cellules myéloïdes au moyen d'une plateforme de mesure moléculaire multiplexée directe nommée nCounter® NanoString) en combinaison avec un "nCounter® Human Myeloid Panel d'immunité innée (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). En raison du coût économique élevé, cette partie de l'étude ne sera réalisée qu'avec des échantillons d'éosinophiles provenant de donneurs sains (T = 0) et à deux moments chez des patients (T = 0 et T = 16).
  • DE2.5 : Traitement des données obtenues et analyse statistique initiale.
  • DE2.6 : Validation des données nCounter® et approche basée sur des hypothèses avec une technique quantitative établie. Effectuez des analyses de rétrotranscription et de qPCR des ARNm des éosinophiles présentant les plus grands changements d'abondance en réponse au traitement par le mépolizumab selon l'étude nCounter®. De plus, certains ARNm supplémentaires non inclus dans le panel "nanoString Myeloid Innate Immunity", tels que FOXP3 (fonction de régulation), CRLF2, ST2 ou IL-7R (récepteurs de cytokines ; activation), seront analysés. Le gène HPRT1 sera utilisé comme gène domestique dans cet ensemble d'expériences de RTqPCR.
  • DE2.7 : Analyses statistiques uni- et multivariées.
  • DE2.8 : Publication des résultats transcriptomiques.

• OB3.- Profilage protéomique pour identifier les protéines d'abondance différentielle au sein des éosinophiles en réponse au traitement par mépolizumab. Cet objectif est réparti dans les livrables suivants (DE) :

  • DE3.1 : Lyse des éosinophiles, élimination des insolubles par centrifugation, quantification des protéines (BCA) et conservation des surnageants cellulaires à -80°C.
  • DE3.2 : Développer un protocole d'analyse du protéome total avec une méthode Data Dependent Acquisition (DDA) utilisant une technologie de chromatographie liquide (LC)-MS/MS (Triple TOF 6600)
  • DE3.3 : Vérifier la variabilité biologique (réplications biologiques) et technique (répliques techniques) pour vérifier la reproductibilité des tests.
  • DE3.4 : En maintenant les conditions standardisées de LC-MS/MS (TripleTOF), créer une bibliothèque pour SWATH (acquisition séquentielle de fenêtre de tous les spectres de masse théoriques) avec un maximum de protéines éosinophiles.
  • DE3.5 : Effectuez une analyse SWATH-MS dans des échantillons provenant de 15 donneurs sains et de 15 patients (T0, T4, T16, T32) (méthode d'"acquisition dépendante de l'information" ou IDA ; "Protéomique sans étiquette ciblée").
  • DE3.6 : Traitement des données obtenues et analyse statistique initiale.
  • DE3.7 : Vérification du panel de biomarqueurs obtenus avec une technologie différente (ex., Selected reaction monitoring / SRM, ELISA).
  • DE3.8 : Analyse statistique finale uni- et multivariée. Identifier les protéines avec des différences significatives entre les groupes (P < 0,05) et au moins un changement de pli ≥ 1,5.
  • DE3.9 : Publication des résultats protéomiques

• OB4. Vérifier si les asthmatiques éosinophiles sévères d'apparition tardive présentent des niveaux élevés d'IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS dans les échantillons de sérum, si la réponse du mépolizumab dépend des niveaux de ces marqueurs, et si le traitement avec ce biologique réduit la concentration dans sérum de ces membres de la famille IGF. Cet objectif est réparti dans les livrables suivants (DE) :

  • DE4.1 : Analyse des IGF-1, IGF-BP3 et IGF-ALS par ELISA
  • DE4.2 : Analyse statistique uni- et multivariée de données expérimentales
  • DE4.3 : Publication des résultats

Publication des résultats :

Nous nous efforcerons de présenter une communication au cours de la première année de l'étude dans un Congrès Respiratoire Espagnol (SEPAR) ainsi qu'au Congrès Respiratoire Européen (ERS) résultant de l'étude des données cliniques des patients avant et après l'administration du mépolizumab . De plus, nous prévoyons de publier 3 publications dans des revues Q1 ainsi que 2 ou 3 autres communications de congrès issues d'études expérimentales.

Population d'étude La population d'étude comprendra des témoins sains (c'est-à-dire des sujets sans asthme, allergie, maladies systémiques ou programmés pour des interventions chirurgicales mineures) et des patients atteints d'asthme éosinophile sévère d'apparition tardive, qui seront recrutés dans différentes régions de Galice (Santiago de Compostela, A La Corogne, Lugo, Vigo et Ourense), Espagne. Le diagnostic des patients asthmatiques éosinophiles sévères lors du dépistage sera basé sur plusieurs critères d'inclusion et critères d'exclusion que nous décrivons ci-dessous [12].

Critère d'intégration:

• Diagnostic d'asthme sévère non contrôlé selon les critères ERS/ATS [52].
• Éosinophilie persistante dans le sang (> 300 cellules/μL) à ≥ 2 occasions (plus de 4 semaines entre chaque mesure).
• Exacerbations fréquentes (≥ 2 par an), définies comme une période de ≥ 3 jours d'absence de contrôle de l'asthme nécessitant un traitement par des corticostéroïdes systémiques et/ou une visite aux urgences et/ou une hospitalisation.
• Signature du consentement éclairé et s'engage à se conformer à toutes les visites de l'étude et à toutes les procédures que cela implique.

Critère d'exclusion:

• Antécédents de tabagisme : Fumeurs actuels ou anciens fumeurs ayant un historique de tabagisme de ≥ 10 paquets-années (nombre de paquets-années = (nombre de cigarettes par jour/20) x nombre d'années de tabagisme). Un ancien fumeur est défini comme un participant qui a arrêté de fumer au moins 6 mois avant la visite 1.
• Maladie pulmonaire cliniquement importante autre que l'asthme (par ex. infection pulmonaire active, maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), bronchectasie, fibrose pulmonaire, fibrose kystique, syndrome d'hypoventilation associé à l'obésité, cancer du poumon, déficit en alpha 1 anti-trypsine et dyskinésie ciliaire primitive) ou ayant déjà reçu un diagnostic de maladie pulmonaire ou systémique , autres que l'asthme, qui sont associés à un nombre élevé d'éosinophiles périphériques (par ex. aspergillose/mycose broncho-pulmonaire allergique, syndrome de Churg-Strauss, syndrome hyperéosinophile).
• Tout trouble, y compris, mais sans s'y limiter, cardiovasculaire, gastro-intestinal, hépatique, rénal, neurologique, musculo-squelettique, infectieux, endocrinien, métabolique, hématologique, psychiatrique ou physique majeur qui n'est pas stable de l'avis de l'investigateur.
• Malignité : une malignité actuelle ou des antécédents de cancer en rémission.
• Infections aiguës des voies respiratoires supérieures ou inférieures nécessitant des antibiotiques ou des médicaments antiviraux dans les 30 jours précédant la visite 1.
• Xolair : participants ayant déjà reçu de l'omalizumab (Xolair) ou un autre anticorps monoclonal.
• Participants ayant reçu des corticostéroïdes systémiques dans les 30 jours précédant la visite 1 [53].
• Grossesse : Participants qui sont enceintes ou qui allaitent.
• Obésité de classe 2 ou supérieure (IMC≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Taille de l'échantillon

• Cohorte de témoins sains (n ​​= 15) uniquement pour analyse à T = 0.

• Cohorte de n = 15 sujets atteints d'asthme éosinophile sévère qui commencent un traitement par le mépolizumab sans modification de leurs médicaments actuellement prescrits. Visites d'étude de suivi à 4 (T4), 16 (T16) et 32 ​​(T32) semaines après la visite d'étude initiale (T = 0).

  • La justification de la taille de l'échantillon est expliquée dans la section statistique.

Taux de recrutement prévu Puisqu'il s'agira d'une étude multicentrique, nous prévoyons d'atteindre un taux de recrutement d'au moins 2 asthmatiques éosinophiles sévères commençant par le mépolizumab par mois (4 semaines) dans chaque hôpital (Total = 8 par mois). Cela signifie que les 15 sujets doivent être programmés pour recevoir le mépolizumab au cours des 36 premières semaines de cette étude, ayant suffisamment de temps pour terminer l'étude en 72 semaines (1,5 an). Nous nous attendons également à ce qu'au moins 90 % des sujets terminent cette étude.

Date estimée de début de l'étude : décembre 2020 Date estimée de fin de l'étude : 1,5 an (72 semaines)

Conception et méthodes de l'étude

Figure 2. Conception de l'étude. Cette figure représente de manière schématique à la fois la partie clinique et la partie expérimentale de l'étude.

Il s'agit d'une étude observationnelle, longitudinale, prospective et multicentrique visant à évaluer à la fois la réponse précoce (4 semaines) et la réponse tardive (16 et 32 ​​semaines) au traitement par mépolizumab chez les asthmatiques éosinophiles sévères. L'étude sera dirigée par le Dr Francisco Javier González Barcala (Service de pneumologie du CHUS). Le Dr Barcala a été coordinateur national dans un essai clinique ainsi que chercheur principal et sous-chercheur dans 41 et 19 essais cliniques, respectivement. De plus, le Dr Barcala a été chercheur principal de 7 projets de recherche, collaborateur dans 7 autres projets et a publié plus de 120 publications pertinentes (évaluées par des pairs et indexées JCR) dans le domaine des maladies respiratoires, principalement l'asthme.

L'étude implique également d'autres membres de l'Unité multidisciplinaire de l'asthme (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr Juan José Nieto Fontarigo). En particulier, le chef de projet, le Dr Salgado, a été impliqué dans 11 projets de recherche, a publié 28 articles de recherche dans des revues à fort impact appartenant aux domaines de l'immunologie, de la biochimie, de la protéomique et des maladies respiratoires. De plus, les autres participants à ce projet ont une vaste expérience dans leurs domaines respectifs, tant en recherche fondamentale qu'en recherche translationnelle. Ce sont Dr. Marina Blanco Aparicio, responsable de l'Unité Asthme du Complexe Hospitalier Universitaire de La Corogne (CHUAC), Dr. Uxío Calvo, du Complexe Hospitalier Universitaire de Ferrol (CHUF), et Coral González du Complexe Hospitalier Universitaire d'Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro à l'Hôpital Alvaro Cunqueiro de Vigo; Dolores Corbacho à l'hôpital Povisa-Vigo . Il sera nécessaire d'embaucher un chercheur en phase prédoctorale pendant 12 mois pour effectuer la préparation des échantillons dans les études transcriptomiques et protéomiques ainsi que les tests RTqPCR, cytométrie en flux et ELISA. Ce chercheur sera sous la supervision du Dr Francisco Javier Salgado Castro et du Dr Juan José Nieto-Fontarigo (Unité multidisciplinaire de l'asthme, CHUS). Des expériences de protéomique seront menées par Dra. Susana Belén Bravo López et María García Vence, qui travaillent à la plate-forme protéomique de la Fondation de recherche sanitaire de Saint-Jacques-de-Compostelle (FIDIS). L'analyse nCounter® sera réalisée via un service proposé par le groupe GENVIP (Groupe de Génétique, Vaccins et Infections en Pédiatrie ; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Le projet de recherche sera peu invasif (par exemple, pas d'examens bronchoscopiques), mais le protocole doit être examiné et approuvé par le comité d'éthique de la recherche clinique de Galice, en Espagne. Seuls quinze patients répondant aux critères de diagnostic d'asthme sévère d'apparition tardive, devant recevoir du mépolizumab et signant le consentement éclairé seront inclus dans cette étude. Le même protocole sera suivi par les différentes équipes cliniques. Les variables démographiques, cliniques, hématologiques et biochimiques seront incluses dans une base de données. Un test cutané aux allergènes courants et la présence d'IgE spécifiques à l'allergène (ImmunoCAP, Thermo Fisher) seront utilisés pour vérifier la sensibilisation allergique. Les paramètres de la fonction pulmonaire (volume expiratoire forcé dans la 1ère seconde (FEV1), capacité vitale forcée (FVC) et rapport FEV1/FVC) seront également analysés. La spirométrie sera effectuée avant et après l'utilisation d'un bronchodilatateur. Le test de contrôle de l'asthme (ACT) et le questionnaire Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) seront effectués. Les asthmatiques doivent être dans une phase stable de la maladie (c'est-à-dire absence d'exacerbations pendant au moins 4 semaines avant le prélèvement). Les exacerbations seront gérées conformément aux directives cliniques standard. Les patients (n=15) recevront une injection sous-cutanée de 100 mg de mépolizumab à 4 semaines d'intervalle, et des échantillons de sang et de sérum (2-3 tubes EDTA ; 1 tube SST) seront prélevés à T=0, 4, 16 et 32 semaines, afin d'évaluer à la fois la réponse précoce (4 semaines) et la réponse tardive (16 et 32 ​​semaines) au traitement.

Méthodes

• Tubes : EDTA (sang complet) et SST (sérum)

• Purification des éosinophiles

  • Les éosinophiles peuvent être isolés du sang total (tubes d'héparine) à l'aide du kit d'isolement des éosinophiles humains Miltenyi (n° de catalogue 130-104-466) ou du kit d'isolement des éosinophiles humains EasySep™ (n° de catalogue 17956), deux procédures de sélection négative qui produisent des sous-ensembles intacts de ces leucocytes. Nous nous attendons à environ au moins 1,0-4,0 x 106 cellules de ∼20 ml de sang, mais également une viabilité et une pureté élevées (>95%).

• Etudes ELISA.

  • Prélèvement d'échantillons de sérum : mesure de l'IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 puits), de l'IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, catalogue #DY291) et de l'IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, catalogue #DY675) au moyen d'ELISA.

• Purification de l'ARN total à partir d'éosinophiles et analyse nCounter nanoString (approche basée sur la découverte/génératrice d'hypothèses) :

  • Les éosinophiles purifiés provenant de témoins sains (T = 0) et de patients (T = 0, 4, 16 et 32 ​​semaines) seront stockés à -80 ° C dans une solution RNAlater (Ambion, Paisley, Royaume-Uni). L'ARN total sera isolé au moyen d'un kit RNeasy Mini (Qiagen) et stocké à -80°C après vérification de la qualité et de la concentration de l'ARN (Nanodrop).
  • La plateforme nCounter® (nanoString ; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) est une méthodologie multiplex qui permet la quantification de jusqu'à 800 cibles d'ARN, d'ADN ou de protéines. Concernant les molécules d'ARNm, cette technologie est basée sur l'hybridation en solution de chaque ARNm à deux oligonucléotides complémentaires : une sonde spécifique d'ARNm biotinylée et un oligonucléotide spécifique d'ARNm contenant une combinaison séquentielle de six fluorochromes (quatre couleurs différentes) qui créent un effet fluorescent code à barres qui identifie l'ARNm spécifique détecté. Une fois l'excès des deux sondes éliminé, les complexes hybrides sont capturés par une interaction biotine-streptavidine et alignés sur la cartouche afin que l'instrument nCounter puisse lire ces "codes-barres". Pour mener à bien ces étapes, la plateforme nCounter est constituée de deux instruments la Prep Station, qui effectue la purification des complexes hybridés et leur immobilisation sur la surface d'une cartouche, et le Digital Analyzer (DA), un scanner qui identifie et compte les codes-barres capturés pour chaque échantillon. Cette analyse quantitative Par conséquent, chaque miARN peut être quantifié individuellement (quantification absolue ; comptes) à partir d'échantillons difficiles (par exemple, éosinophiles) sans avoir besoin d'autres exigences telles que la conversion ARNm-ADNc (RT) ou l'amplification de l'ADN (qPCR), conduisant à moins de variabilité des données (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). De plus, la quantité de matériel d'entrée est faible (25 ng-300 ng d'ARNm) et peut être dérivée d'ARN dérivé de FFPE, d'ARN total, d'ARN fragmenté, de lysats cellulaires et de cellules triées. Ensuite, les données nCounter seront normalisées, le bruit de fond soustrait et une correction supplémentaire effectuée pour tenir compte de l'efficacité de l'extraction (calculée sur la base de l'expression des miARN de pointe qui seront ajoutés à l'échantillon en quantité définie avant l'extraction des miARN ). Les normalisations seront effectuées à l'aide du package R NanoStringNorm. Après normalisation, une transformation log2 des données sera effectuée puis analysée au moyen du package LIMMA Bioconductor pour identifier les ARNm présentant une abondance différentielle lors du traitement au mépolizumab. Cette analyse ne prendra pas plus de 24 heures.

• Études RTqPCR (approche basée sur des hypothèses) :

  • Pour analyser les niveaux d'ARNm codant pour des protéines liées à l'activation médiée par l'alarmine des éosinophiles (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) et à la fonction régulatrice des éosinophiles (FOXP3) chez les patients traités par le mépolizumab, l'ARN total sera transcrit en ADNc (Kit de transcription QuantiTect Rev. ; Qiagen) et conservé à -80 °C. La qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit ; Qiagen) sera réalisée dans un instrument LightCycler® 96 (Roche Life Science) et utilisée pour analyser l'expression de FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R et le gène HPRT1 (contrôle endogène).

• Études de cytométrie en flux (approche basée sur des hypothèses) :

  • Échantillons de sang périphérique traités à l'EDTA provenant de témoins sains (n ​​= 15 ; T0) et de patients traités par le mépolizumab (n = 15 ; T0, T4, T16, T32).

  • Étiquetez 100 μL/tube de sang périphérique total (EDTA) avec des anticorps de contrôle spécifiques et isotypiques (BD). Lyse des globules rouges avec FACSlyse (BD). Analyse avec un cytomètre en flux FACSCalibur (BD). Utilisez FSC/SSC pour sélectionner les granulocytes ; puis SSC vs CCR3 (FITC) pour séparer les éosinophiles des neutrophiles. Gate éosinophiles :

    • Panel multimarqueurs 1 (Protéines régulatrices chez les éosinophiles) : Mesure du CD16 et des galectines-1/10 [41-44].
    • Panel multimarqueurs 2 (récepteurs d'activation des éosinophiles) : mesure de CD48 (réduction du nombre total d'éosinophiles atteints d'asthme modéré à sévère par rapport aux témoins sains (HC) [nos études, 54]), de CD44 et de CD11b.
    • Panel multimarqueurs 3 (sous-ensembles d'éosinophiles) : analyse de sous-ensembles basée sur l'expression de Siglec-8, CD62L (L-sélectine) et IL-5Rα [40].

• Analyse du protéome des éosinophiles (approche basée sur la découverte/génératrice d'hypothèses) :

  • Pas moins de 50 x 103 cellules seront nécessaires pour effectuer des tests protéomiques. Nous attendons environ 50 à 400 x 103 cellules à partir d'environ 1 ml de sang.
  • Les éosinophiles isolés (50 x 103 cellules) seront collectés par centrifugation, lavés et remis en suspension dans un tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéinase. Après cela, la matière insoluble sera éliminée par centrifugation et les surnageants cellulaires stockés à -80°C.
  • Pour les éosinophiles, la caractérisation du protéome total sera effectuée après digestion à la trypsine en utilisant une méthode DDA dans un système LC-MSMS. Pour cette approche, nous utiliserons des échantillons provenant de 15 donneurs sains et de 15 patients (T0, T4, T16, T32). Les protéines sélectionnées seront uniquement celles qui ont signalé un taux global de fausses découvertes (FDR) de 1 % ou mieux [55, 56].
  • Les "pools" de protéines des 5 groupes d'étude (donneurs sains et patients aux temps T0, T4, T16 et T32 après traitement) seront utilisés, en les divisant (1-DE) en 5-6 bandes, en extrayant les protéines de chacune bande, en générant les peptides correspondants et en les analysant par MS/MS pour produire une bibliothèque pour SWATH avec un nombre élevé de protéines, sur laquelle ensuite la quantification sera effectuée. Une fois la librairie réalisée et en maintenant les conditions standardisées de LC-MS/MS (TripleTOF), nous effectuerons une analyse SWATH-MS (méthode "information-dependent acquisition" ou IDA ; "Targeted label-free proteomics") dans des échantillons provenant de 15 donneurs sains et 15 patients (T0, T4, T16, T32). Ce dosage nous permettra d'identifier des protéines avec des différences significatives entre les groupes d'étude. Les protéines sélectionnées seront uniquement celles ayant un P<0,05 et un fold change ≥1,5 [56-59].

Critères d'évaluation :

Les données démographiques de tous les individus inscrits à l'étude seront obtenues au niveau basal. De plus, plusieurs données seront recueillies, notamment les antécédents d'asthme, les paramètres de la fonction pulmonaire, le test cutané, les IgE spécifiques à l'allergène, le score AQLQ, le score ACT, le nombre d'exacerbations et la consommation de prednisone. Lors des visites suivantes au service de pneumologie aux T0, 4, 16 et 32, les patients traités par mépolizumab seront suivis. Cela comprend des mesures de la fonction pulmonaire (FEV1, FEV1/FVC), des paramètres biochimiques et hématologiques.

Des échantillons de sang périphérique et de sérum seront prélevés, et les éosinophiles seront purifiés magnétiquement, à T0, T4, T16 et T32, et des analyses de cytométrie en flux, RTqPCR et protéomiques, ainsi que des immunoessais, seront effectuées. Toutes les variables expérimentales (par exemple, l'abondance des protéines éosinophiles dans les dosages protéomiques, les marqueurs d'activation des éosinophiles, ...) seront corrélées avec des paramètres cliniques (par exemple, la fonction pulmonaire, le contrôle de l'asthme, le nombre d'exacerbations) afin d'évaluer l'association de ces variables avec la réponse au traitement. Nous considérerons une réponse favorable au mépolizumab si l'un des critères suivants est rempli :

• Pour obtenir un contrôle adéquat de l'asthme ACT ≥20 [60], ou/ un changement de ≥3 points représentant une différence minimalement importante.
• Atteindre une réduction du taux annuel d'exacerbations de 48%. L'exacerbation est définie comme l'augmentation des symptômes nécessitant un traitement par des corticoïdes systémiques pendant ≥3, ou une consultation médicale non programmée, similaire à celle reflétée dans les essais cliniques avec le mépolizumab [20, 61].
• Obtenir une réduction de 50 % du taux annuel d'admissions à l'hôpital en raison d'une exacerbation de l'asthme, similaire à celle reflétée dans les essais cliniques [62].
• Atteindre une réduction de la dose annuelle médiane de corticoïdes systémiques de 50 % [63].

• Critères d'évaluation principaux de l'étude :

  • Taux d'IGF-1, d'IGF-BP3 et d'IGF-ALS dans le sérum
  • Données d'expression transcriptomique (nanoString)/ARNm : FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Données protéomiques
  • Données de cytométrie en flux : expression de CD16, galectines-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L et IL-5Rα

• Critères d'évaluation secondaires de l'étude :

  • Paramètres de la fonction pulmonaire (FEV1, FEV1/FVC)
  • Paramètres hématologiques (par exemple, nombre d'éosinophiles).
  • Autres variables cliniques et biochimiques (par exemple, IgE ou autres immunoglobulines).
  • Nombre d'exacerbations, consommation de prednisone, score ACT, score AQLQ.

Plan statistique ou analyse de données :

Graph Pad Prism sera utilisé pour créer des graphiques. IBM SPSS, Statistics 22.0 ou R. seront utilisés pour l'étude statistique. Au cours des analyses, nous serons assistés par le domaine de la statistique et de la recherche opérationnelle de l'USC (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Taille de l'échantillon Le calcul de la taille de l'échantillon (N) a été effectué en utilisant G*Power 3.1.9.4 [64]. Au cours de ces analyses, nous calculons N nécessaire pour obtenir une signification statistique dans un test F (ANOVA : Mesures répétées, dans les facteurs), compte tenu de α (0,05), de la puissance (1-β, 0,95), du nombre de mesures (T0, T4, T16 et T32), et la taille de l'effet (f = 0,4 ; grande taille de l'effet, ce qui donne des résultats plus pertinents sur le plan clinique). La sortie N était de 15, avec un F critique = 2,82705.

Pour les données cliniques, de cytométrie en flux et de transcriptomique. Des comparaisons transversales entre HC et patients en T0 (avant traitement) suivant une distribution normale et ayant une homogénéité des variances seront faites en utilisant le test t. Pour les variables distribuées non normales, nous utiliserons le test U de Mann-Whitney. Les changements dans les différentes variables de l'étude en réponse au traitement par le mépolizumab (étude longitudinale ; T0, T4, T16 et T32) seront testés à l'aide de RM-ANOVA. L'analyse multivariée (par exemple, PCA, clustering non supervisé) ainsi que l'analyse d'enrichissement fonctionnel seront effectuées avec la cytométrie en flux, et surtout, les données transcriptomiques.

Pour la caractérisation totale du protéome et l'analyse quantitative SWATH, nous utiliserons le logiciel ProteinPilotTM 5.0.1 d'ABSciex qui possède l'algorithme ParagonTM pour la recherche dans la base de données et ProgroupTM pour le regroupement des données. Les données seront recherchées à l'aide d'une base de données Uniprot spécifique à l'homme. Le taux de fausses découvertes sera effectué à l'aide d'une méthode d'ajustement non linéaire affichant uniquement les résultats qui ont signalé un taux global de fausses découvertes de 1 % ou mieux [65].

L'analyse fonctionnelle sera effectuée par différents logiciels en libre accès. FunRich (outil d'analyse d'enrichissement fonctionnel) pour l'enrichissement fonctionnel et l'analyse des réseaux d'interaction (http://funrich.org/index.html). Pour les statistiques, FunRich utilise le test hypergéométrique, BH et Bonferroni [66, 67]. Nous utiliserons DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) ou GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) pour l'enrichissement de l'ontologie des gènes et pour l'interaction protéine-protéine, le réseau construction et clustering, nous utiliserons String (https://string-db.org/) ou Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

Pour les données SWATH, le logiciel MarkerView nous fournira une analyse statistique multivariée utilisant l'analyse en composantes principales (ACP) pour comparer les données entre les échantillons. La surface moyenne du pic MS de chaque protéine sera dérivée des répliques du SWATH-MS de chaque échantillon suivi de l'analyse du test t de Student à l'aide du logiciel MarkerView pour la comparaison entre les échantillons en fonction des sommes moyennes de toutes les transitions dérivées pour chaque protéine. Le test t indiquera dans quelle mesure chaque variable distingue les deux groupes, rapportée sous forme de valeur P. Pour la bibliothèque, son ensemble de protéines différentiellement abondantes (valeur p <0,05) avec 1,5 protéines régulées à la hausse ou à la baisse sera sélectionné.

Limites

• Comme indiqué précédemment, 15 sujets recevront du mépolizumab au cours de la première moitié de l'étude (36 semaines). Nous nous attendons à ce qu'au moins 90 % des sujets terminent cette étude. Cependant, les abandons et la non-observance (ou non-observance) des patients sont des événements courants dans les études cliniques. Dans un tel cas, la taille de l'échantillon sera proportionnellement gonflée.
• Le présent projet a été proposé comme une étude de la découverte de biomarqueurs moléculaires en réponse au mépolizumab. Ce type d'études peut être abordé par le biais d'approches ciblées/axées sur des hypothèses ou plus larges/non ciblées (technologies "-omiques"). Nous sommes conscients qu'il peut être difficile de trouver des marqueurs prédictifs dans cette petite étude prospective/preuve de concept. Dans le présent projet, nous proposons une double approche pour minimiser ce risque. D'une part, des méthodologies modernes et non ciblées pour travailler et très sensibles pour détecter les protéines peu abondantes (SWATH MS) ou des protocoles simplifiés pour travailler avec des échantillons difficiles (la génération d'ARN de bonne qualité à partir d'éosinophiles est toujours difficile en raison de la présence de protéines abondantes comme EDN, un membre de la famille RNase) et réduire la variance technique (par exemple, nCounter nanoString) afin de raccourcir la taille des échantillons. D'autre part, les approches basées sur des hypothèses (par exemple, cytométrie en flux, RT-qPCR, ELISA), avec les avantages d'une plus grande crédibilité, moins de risque d'erreurs de type I (c'est-à-dire, fausse découverte) et II, et une réplication facile à l'avenir de résultats. Ces méthodologies ciblées seront également utilisées pour confirmer uniquement les différences cliniquement pertinentes (taille d'effet élevée) et significatives (valeur de p < 0,05) obtenues avec des approches transcriptomiques/protéomiques non ciblées.
• Une autre limitation potentielle est le nombre d'éosinophiles, qui pourrait être potentiellement faible chez certains patients après un traitement par le mépolizumab (50 x 103 ou moins). Par conséquent, il pourrait être nécessaire de purifier plus de 1 ou 2 ml de sang chez ces patients afin d'obtenir suffisamment de cellules pour effectuer les expériences protéomiques et transcriptomiques. Nous avons pris en compte cette question dans le protocole d'étude et dans le budget du projet.
• Enfin, le TripleTOF est un spectromètre de masse très sensible conçu pour creuser plus profondément dans des échantillons complexes comme le protéome des éosinophiles. La haute sensibilité des spectromètres de masse actuels combinée aux schémas bidimensionnels de nanoLC permet la détection d'un plus grand nombre de protéines (> 1000) et d'analytes à des concentrations dans la gamme attomolaire (10-18), suffisamment pour détecter des protéines intracellulaires peu abondantes comme les chimiokines ou les cytokines. Ainsi, TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 et IL-18 ont été détectés par nanoLC-MS/MS (Q-TOF), mais pas d'autres comme IL-5 ou IL-13 [69 ]. Cette limitation attendue est due à la présence de peptides de protéines très abondantes (par exemple, les protéines de granules d'éosinophiles) qui suppriment l'ionisation des peptides de protéines peu abondantes dans les applications LC-MS/MS. Ceci conduit à la surreprésentation dans la liste des protéines détectées d'espèces abondantes telles que la protéine cristal de Charcot-Leyden (CLC, galectine-10), qui reste intéressante pour le présent projet puisqu'elle identifie des éosinophiles dotés de capacités régulatrices. Cependant, afin de réduire la complexité de l'échantillon et d'améliorer la détection des protéines à faible abondance, il existe différentes méthodes d'épuisement (par exemple, épuisement de l'ACN, ultrafiltration, 1-DE) et d'enrichissement (par exemple, CPLL) que nous pourrions utiliser pour obtenir une détection. sensibilité. Facultativement, des approches ciblées telles que des immunoessais à multiplexage élevé (par exemple, les panels Olink Immune Response, Olink Inflammation ou Olink Immuno-Oncology ; https://www.olink.com/) ont l'avantage d'une sensibilité de détection élevée avec un faible volume d'échantillons biologiques (par exemple, des lysats cellulaires), même s'ils ne permettent que la mesure de 92 biomarqueurs protéiques à la fois.