Efecto de mepolizumab en el asma eosinofílica grave (EMESEA)

Hipótesis

Hº1. Los niveles de ciertas moléculas de superficie en los eosinófilos o la presencia o ausencia de ciertas proteínas en el proteoma de este subconjunto de leucocitos previo al tratamiento con mepolizumab pueden usarse como marcadores predictivos/pronósticos de respuesta a este biológico.

Hº2. Mepolizumab altera la abundancia de varias proteínas de superficie o intracelulares en los eosinófilos como un resultado relacionado con cambios en su estado de activación, capacidad migratoria, función reguladora/efectora o composición de subconjuntos.

Hº3. Los asmáticos eosinofílicos graves de inicio tardío tienen elevaciones en la concentración sérica de diferentes miembros de la familia IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) y el tratamiento con mepolizumab reduce estos niveles y se comporta como un biomarcador de respuesta junto con el número de eosinófilos y exacerbaciones clínicas.

Objetivos o preguntas de investigación.

OB (objetivo aspiracional): Descubrimiento de biomarcadores predictivos/pronósticos de respuesta a mepolizumab utilizando tecnologías de citometría de flujo, transcriptómica y proteómica.

• OB1.- Identificar cambios en marcadores de superficie de eosinófilos y subpoblaciones de eosinófilos en respuesta al tratamiento con mepolizumab mediante técnicas de citometría de flujo. Este objetivo se distribuye en los siguientes entregables (DE):

  • DE1.1: Selección de 15 controles sanos
  • DE1.2: Diagnóstico de pacientes con asma eosinofílica grave de inicio tardío y selección de 15 pacientes que cumplan criterios, estén programados para recibir mepolizumab y firmen el consentimiento informado.
  • DE1.3: Generación de la base de datos inicial para controles sanos y pacientes asmáticos con información demográfica, clínica, hematológica y bioquímica.
  • DE1.4: Recolección y procesamiento de muestras de suero (1 tubo SST) y sangre total (1-2 tubos) de donantes sanos (T0) y pacientes tratados con mepolizumab (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Ensayos de citometría de flujo con paneles de múltiples marcadores 1 (regulador), 2 (activación) y 3 (subconjuntos de eosinófilos) (ver a continuación).
  • DE1.6: Completar la base de datos con datos clínicos, hematológicos, bioquímicos y de citometría de flujo generados en los tiempos T4, T16 y T32. Análisis estadístico final uni y multivariante.
  • DE1.7: Publicación de resultados.

• OB2.- Análisis transcriptómico para identificar ARNm dentro del transcriptoma de eosinófilos que muestren niveles mejorados o reducidos en respuesta al tratamiento con mepolizumab. Este objetivo se distribuye en los siguientes entregables (DE):

  • DE2.1: Configure un protocolo de aislamiento de eosinófilos y verifique la pureza celular mediante citometría de flujo.
  • DE2.2: Purificación de eosinófilos de 15 donantes sanos (T0) y 15 pacientes (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Extracción de ARN total de lisados ​​de eosinófilos, ensayo de calidad y cantidad de ARN y almacenamiento a -80ºC.
  • DE2.4: Enfoque basado en el descubrimiento/generación de hipótesis. Evaluación de los niveles de 770 ARNm codificadores de proteínas humanas vinculados al reclutamiento, la activación y las funciones efectoras de las células mieloides por medio de una plataforma de medición molecular multiplexada directa llamada nCounter® NanoString) en combinación con un "nCounter® Human Myeloid Panel de inmunidad innata (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Debido al alto coste económico, esta parte del estudio solo se realizará con muestras de eosinófilos de donantes sanos (T = 0) y dos puntos temporales en pacientes (T = 0 y T = 16).
  • DE2.5: Tratamiento de los datos obtenidos y análisis estadístico inicial.
  • DE2.6: Validación de datos de nCounter® y enfoque basado en hipótesis con una técnica cuantitativa establecida. Realice análisis de retrotranscripción y qPCR de aquellos ARNm en eosinófilos que muestren los cambios de mayor abundancia en respuesta al tratamiento con mepolizumab según el estudio nCounter®. Además, se analizarán algunos ARNm adicionales no incluidos en el panel "NanoString Myeloid Innate Immunity", como FOXP3 (función reguladora), CRLF2, ST2 o IL-7R (receptores de citoquinas; activación). El gen HPRT1 se utilizará como gen de mantenimiento en este conjunto de experimentos de RTqPCR.
  • DE2.7: Análisis estadísticos uni y multivariante.
  • DE2.8: Publicación de resultados transcriptómicos.

• OB3.- Perfil proteómico para identificar proteínas con abundancia diferencial dentro de los eosinófilos en respuesta al tratamiento con mepolizumab. Este objetivo se distribuye en los siguientes entregables (DE):

  • DE3.1: Lisis de eosinófilos, eliminación de material insoluble por centrifugación, cuantificación de proteínas (BCA) y almacenamiento de sobrenadantes celulares a -80 °C.
  • DE3.2: Desarrollar un protocolo de análisis de proteoma total con un método de Adquisición Dependiente de Datos (DDA) usando una tecnología de cromatografía líquida (LC)-MS/MS (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Comprobar la variabilidad biológica (replicas biológicas) y técnica (replicas técnicas) para comprobar la reproducibilidad de los ensayos.
  • DE3.4: Mantener las condiciones estandarizadas de LC-MS/MS (TripleTOF), crear una biblioteca para SWATH (adquisición de ventana secuencial de todos los espectros de masas teóricos) con tantas proteínas eosinofílicas como sea posible.
  • DE3.5: Realizar análisis SWATH-MS en muestras de 15 donantes sanos y 15 pacientes (T0, T4, T16, T32) (método de "adquisición dependiente de la información" o IDA; "Proteómica sin etiqueta dirigida").
  • DE3.6: Tratamiento de los datos obtenidos y análisis estadístico inicial.
  • DE3.7: Comprobación del panel de biomarcadores obtenidos con una tecnología diferente (p. ej., monitorización de reacciones seleccionadas / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Análisis estadístico final uni y multivariante. Identifique proteínas con diferencias significativas entre grupos (P < 0,05) y al menos un cambio de pliegue ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publicación de resultados proteómicos

• OB4. Comprobar si los asmáticos eosinofílicos severos de inicio tardío presentan niveles elevados de IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS en muestras de suero, si la respuesta de mepolizumab depende de los niveles de estos marcadores, y si el tratamiento con este biológico reduce la concentración en suero de estos miembros de la familia IGF. Este objetivo se distribuye en los siguientes entregables (DE):

  • DE4.1: Análisis de IGF-1, IGF-BP3 e IGF-ALS por ELISA
  • DE4.2: Análisis estadístico uni y multivariante de datos experimentales
  • DE4.3: Publicación de resultados

Publicación de resultados:

Se intentará presentar una comunicación durante el primer año del estudio en un Congreso Español Respiratorio (SEPAR) así como en el Congreso Europeo Respiratorio (ERS) resultante del estudio de los datos clínicos de los pacientes antes y después de la administración de mepolizumab . Además, esperamos publicar 3 publicaciones en revistas Q1, así como otras 2 o 3 comunicaciones de congresos como resultado de estudios experimentales.

Población de estudio La población de estudio incluirá controles sanos (es decir, sujetos sin asma, alergia, enfermedades sistémicas o programados para cirugías menores) y pacientes con asma eosinofílica severa de inicio tardío, que serán reclutados de diferentes áreas de Galicia (Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo y Ourense), España. El diagnóstico de pacientes con asma eosinofílica grave en la selección se basará en varios criterios de inclusión y criterios de exclusión que describimos a continuación [12].

Criterios de inclusión:

• Diagnóstico de asma grave no controlada según los criterios ERS/ATS [52].
• Eosinofilia persistente en sangre (>300 células/μL) en ≥ dos ocasiones (más de 4 semanas entre cada medición).
• Exacerbaciones frecuentes (≥ dos por año), definidas como un período de ≥ 3 días de falta de control del asma que requiere tratamiento con corticosteroides sistémicos y/o una visita al servicio de urgencias (SU) y/u hospitalización.
• Firma de consentimiento informado y acuerdo de cumplir con todas las visitas del estudio y todos los trámites que esto conlleva.

Criterio de exclusión:

• Historial de tabaquismo: Fumadores actuales o exfumadores con un historial de tabaquismo de ≥10 paquetes-año (número de paquetes-año = (número de cigarrillos por día/20) x número de años fumados). Un exfumador se define como un participante que dejó de fumar al menos 6 meses antes de la Visita 1.
• Enfermedad pulmonar clínicamente importante distinta del asma (p. infección pulmonar activa, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), bronquiectasias, fibrosis pulmonar, fibrosis quística, síndrome de hipoventilación asociado con obesidad, cáncer de pulmón, deficiencia de alfa 1 antitripsina y discinesia ciliar primaria) o alguna vez se le ha diagnosticado una enfermedad pulmonar o sistémica , distintos del asma, que están asociados con recuentos elevados de eosinófilos periféricos (p. aspergilosis/micosis broncopulmonar alérgica, síndrome de Churg-Strauss, síndrome hipereosinofílico).
• Cualquier trastorno, incluidos, entre otros, los cardiovasculares, gastrointestinales, hepáticos, renales, neurológicos, musculoesqueléticos, infecciosos, endocrinos, metabólicos, hematológicos, psiquiátricos o impedimentos físicos importantes que no sean estables en opinión del investigador.
• Neoplasia maligna: una neoplasia maligna actual o antecedentes previos de cáncer en remisión.
• Infecciones agudas de las vías respiratorias superiores o inferiores que requieren antibióticos o medicamentos antivirales dentro de los 30 días anteriores a la Visita 1.
• Xolair: participantes que hayan recibido omalizumab (Xolair) u otro anticuerpo monoclonal anteriormente.
• Participantes que hayan recibido corticosteroides sistémicos dentro de los 30 días anteriores a la Visita 1 [53].
• Embarazo: Participantes que están embarazadas o amamantando.
• Obesidad clase 2 o superior (IMC≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Tamaño de la muestra

• Cohorte de controles sanos (n = 15) solo para análisis en T = 0.

• Cohorte de n=15 sujetos con asma eosinofílica severa que comienzan con la terapia con mepolizumab sin modificar sus medicamentos prescritos actualmente. Visitas de seguimiento del estudio a las 4 (T4), 16 (T16) y 32 (T32) semanas después de la visita del estudio original (T=0).

  • La justificación del tamaño de la muestra se explica en la sección estadística.

Tasa de inscripción anticipada Dado que este será un estudio multicéntrico, esperamos alcanzar una tasa de inscripción de al menos 2 asmáticos eosinofílicos graves que comienzan con la terapia con mepolizumab por mes (4 semanas) en cada hospital (Total = 8 por mes). Esto significa que los 15 sujetos deberían programarse para recibir mepolizumab durante las primeras 36 semanas de este estudio, teniendo tiempo suficiente para completar el estudio en 72 semanas (1,5 años). También esperamos que al menos el 90% de los sujetos completen este estudio.

Fecha estimada de inicio del estudio: diciembre de 2020 Fecha estimada de finalización del estudio: 1,5 años (72 semanas)

Diseño y métodos del estudio

Figura 2. Diseño del estudio. Esta figura representa de forma esquemática tanto la parte clínica como la experimental del estudio.

Se trata de un estudio observacional, longitudinal, prospectivo y multicéntrico para evaluar tanto la respuesta temprana (4 semanas) como la respuesta tardía (16 y 32 semanas) al tratamiento con mepolizumab en asmáticos eosinofílicos graves. El estudio estará dirigido por el Dr. Francisco Javier González Barcala (Servicio de Neumología del CHUS). El Dr. Barcala fue coordinador nacional en un ensayo clínico, así como investigador principal y subinvestigador en 41 y 19 ensayos clínicos, respectivamente. Además, el Dr. Barcala ha sido investigador principal de 7 proyectos de investigación, colaborador en otros 7 proyectos y publicado más de 120 publicaciones relevantes (revisadas por pares e indexadas por JCR) en el campo de las enfermedades respiratorias, principalmente el asma.

En el estudio también participan otros miembros de la Unidad Multidisciplinar de Asma (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). En particular, el Project Manager Dr. Salgado ha estado involucrado en 11 proyectos de investigación, tiene 28 artículos de investigación en revistas de alto impacto pertenecientes a los campos de Inmunología, Bioquímica, Proteómica y Enfermedades Respiratorias. Además, el resto de participantes en este proyecto cuentan con una amplia experiencia en sus respectivos campos, tanto en investigación básica como traslacional. ellos son Dra. Marina Blanco Aparicio, responsable de la Unidad de Asma del Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña (CHUAC), el Dr. Uxío Calvo, del Complejo Hospitalario Universitario de Ferrol (CHUF), y Coral González del Complejo Hospitalario Universitario de Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro en el Hospital Álvaro Cunqueiro de Vigo; Dolores Corbacho en el Hospital Povisa-Vigo. Será necesaria la contratación de un investigador en fase predoctoral durante 12 meses para realizar la preparación de muestras en estudios transcriptómicos y proteómicos así como los ensayos RTqPCR, citometría de flujo y ELISA. Este investigador estará bajo la supervisión del Dr. Francisco Javier Salgado Castro y el Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Unidad Multidisciplinar de Asma, CHUS). Los experimentos de proteómica serán realizados por la Dra. Susana Belén Bravo López y María García Vence, que trabajan en la Plataforma de Proteómica de la Fundación de Investigaciones Sanitarias de Santiago de Compostela (FIDIS). El análisis de nCounter® se realizará a través de un servicio ofrecido por el grupo GENVIP (Grupo de Genética, Vacunas e Infecciones en Pediatría; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

El proyecto de investigación será mínimamente invasivo (p. ej., sin exámenes broncoscópicos), pero el protocolo debe ser revisado y aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia, España. Solo se incluirán en este estudio quince pacientes que cumplan con los criterios de diagnóstico de asma grave de inicio tardío, estén programados para recibir mepolizumab y firmen el consentimiento informado. El mismo protocolo será seguido por los diferentes equipos clínicos. Las variables demográficas, clínicas, hematológicas y bioquímicas se incluirán en una base de datos. Se utilizará la prueba de punción cutánea para alérgenos comunes y la presencia de IgE específica para alérgenos (ImmunoCAP, Thermo Fisher) para verificar la sensibilización alérgica. También se analizarán los parámetros de la función pulmonar (volumen espiratorio forzado en el primer segundo (FEV1), capacidad vital forzada (FVC) y relación FEV1/FVC). La espirometría se realizará antes y después del uso de un broncodilatador. Se realizará el cuestionario Asthma Control Test (ACT) y Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ). Los asmáticos deben estar en una fase estable de la enfermedad (es decir, ausencia de exacerbaciones durante al menos 4 semanas antes de la toma de muestras). Las exacerbaciones se manejarán de acuerdo con las pautas clínicas estándar. Los pacientes (n=15) recibirán una inyección subcutánea de 100 mg de mepolizumab a intervalos de 4 semanas, y se extraerán muestras de sangre y suero (2-3 tubos EDTA; 1 tubo SST) en T=0, 4, 16 y 32 semanas. para evaluar tanto la respuesta temprana (4 semanas) como la respuesta tardía (16 y 32 semanas) al tratamiento.

Métodos

• Tubos: EDTA (sangre completa) y SST (suero)

• Purificación de eosinófilos

  • Los eosinófilos se pueden aislar de la sangre completa (tubos de heparina) con el kit de aislamiento de eosinófilos humanos Miltenyi (n.º de catálogo 130-104-466) o el kit de aislamiento de eosinófilos humanos EasySep™ (n.º de catálogo 17956), ambos procedimientos de selección negativa que producen subconjuntos intactos de estos leucocitos. Esperamos alrededor de al menos 1.0-4.0 x 106 células de ∼20 ml de sangre, pero también alta viabilidad y pureza (>95%).

• Estudios ELISA.

  • Recolección de muestras de suero: medición de IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 well), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, catálogo n.° DY291) e IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, catálogo #DY675) mediante ELISA.

• Purificación de ARN total a partir de eosinófilos y análisis nCounter nanoString (enfoque basado en descubrimiento/generación de hipótesis):

  • Los eosinófilos purificados de controles sanos (T=0) y pacientes (T=0, 4, 16 y 32 semanas) se almacenarán a -80 ºC en solución RNAlater (Ambion, Paisley, Reino Unido). El ARN total se aislará mediante un kit RNeasy Mini (Qiagen) y se almacenará a -80ºC tras comprobar la calidad y concentración del ARN (Nanodrop).
  • La plataforma nCounter® (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) es una metodología multiplex que permite la cuantificación de hasta 800 objetivos de ARN, ADN o proteínas. En cuanto a las moléculas de ARNm, esta tecnología se basa en la hibridación en solución de cada ARNm con dos oligonucleótidos complementarios: una sonda específica de ARNm biotinilada y un oligonucleótido específico de ARNm que contiene una combinación secuencial de seis fluorocromos (cuatro colores diferentes) que crean una fluorescencia código de barras que identifica el ARNm específico que se está detectando. Una vez que se elimina el exceso de ambas sondas, los complejos hibridados se capturan a través de una interacción biotina-estreptavidina y se alinean en el cartucho para que el instrumento nCounter pueda leer esos "códigos de barras". Para llevar a cabo estos pasos, la plataforma nCounter consta de dos instrumentos, la Prep Station, que realiza la purificación de los complejos hibridados y su inmovilización en la superficie de un cartucho, y el Digital Analyzer (DA), un escáner que identifica y cuenta los códigos de barras capturados para cada muestra. Este análisis cuantitativo Por lo tanto, cada miARN se puede cuantificar individualmente (cuantificación absoluta; recuentos) a partir de muestras difíciles (p. ej., eosinófilos) sin necesidad de otros requisitos, como la conversión de ARNm-ADNc (RT) o la amplificación de ADN (qPCR), lo que lleva a menos variabilidad de datos (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Además, la cantidad de material de entrada es baja (25 ng-300 ng de ARNm) y puede derivarse de ARN derivado de FFPE, ARN total, ARN fragmentado, lisados ​​celulares y células clasificadas. Posteriormente, los datos de nCounter se normalizarán, se restará el ruido de fondo y se realizará una corrección adicional para tener en cuenta la eficiencia de la extracción (calculada en función de la expresión de los miARN añadidos que se agregarán a la muestra en una cantidad definida antes de la extracción de miARN). ). Las normalizaciones se realizarán utilizando el paquete R NanoStringNorm. Después de la normalización, se realizará una transformación log2 de los datos y posteriormente se analizará mediante el paquete LIMMA Bioconductor para identificar aquellos ARNm que muestren una abundancia diferencial tras el tratamiento con mepolizumab. Este análisis no tomará más de 24 horas.

• Estudios de RTqPCR (enfoque basado en hipótesis):

  • Para analizar los niveles de mRNAs que codifican proteínas relacionadas con la activación de eosinófilos mediada por alarmina (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) y con la función reguladora de eosinófilos (FOXP3) de pacientes tratados con mepolizumab, se transcribirá el RNA total en cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) y almacenado a -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) se realizará en un instrumento LightCycler® 96 (Roche Life Science) y se utilizará para analizar la expresión de FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R y el gen HPRT1 (control endógeno).

• Estudios de citometría de flujo (enfoque basado en hipótesis):

  • Muestras de sangre periférica tratadas con EDTA de controles sanos (n=15; T0) y pacientes tratados con mepolizumab (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Etiquete 100 μL/tubo de sangre periférica completa (EDTA) con anticuerpos de control (BD) específicos y de isotipo coincidente. Lisis de glóbulos rojos con FACSlyse (BD). Análisis con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD). Utilice FSC/SSC para seleccionar granulocitos; luego SSC vs CCR3 (FITC) para separar los eosinófilos de los neutrófilos. Puerta de eosinófilos:

    • Panel multimarcador 1 (Proteínas reguladoras en eosinófilos): Medición de CD16 y galectinas-1/10 [41-44].
    • Panel multimarcador 2 (receptores de activación en eosinófilos): medición de CD48 (reducción en eosinófilos totales con asma moderada-grave en comparación con controles sanos [HC] [nuestros estudios, 54]), CD44 y CD11b.
    • Panel multimarcador 3 (subconjuntos de eosinófilos): análisis de subconjuntos basados ​​en la expresión de Siglec-8, CD62L (L-selectina) e IL-5Rα [40].

• Análisis del proteoma de eosinófilos (enfoque basado en descubrimiento/generación de hipótesis):

  • Se necesitarán hasta 50 x 103 células para realizar ensayos proteómicos. Esperamos alrededor de 50-400 x 103 células de ~1 ml de sangre.
  • Los eosinófilos aislados (50 x 103 células) se recogerán por centrifugación, se lavarán y se resuspenderán en tampón de lisis con inhibidores de proteinasa. Después de eso, el material insoluble se eliminará mediante centrifugación y los sobrenadantes celulares se almacenarán a -80 °C.
  • Para los eosinófilos, la caracterización del proteoma total se realizará después de la digestión con tripsina utilizando un método DDA en un sistema LC-MSMS. Para este enfoque utilizaremos muestras de 15 donantes sanos y 15 pacientes (T0, T4, T16, T32). Las proteínas seleccionadas serán solo aquellas que informaron una tasa global de descubrimiento falso (FDR) del 1% o mejor [55, 56].
  • Se utilizarán "pools" de proteínas de los 5 grupos de estudio (donantes sanos y pacientes en el tiempo T0, T4, T16 y T32 después del tratamiento), dividiéndolos (1-DE) en 5-6 bandas, extrayendo las proteínas de cada banda, generando los péptidos correspondientes y analizándolos por MS/MS para producir una librería para SWATH con un elevado número de proteínas, sobre las que luego se realizará la cuantificación. Una vez realizada la biblioteca y manteniendo las condiciones estandarizadas de LC-MS/MS (TripleTOF), realizaremos un análisis SWATH-MS (método de "adquisición dependiente de la información" o IDA; "Proteómica libre de etiquetas dirigidas") en muestras de 15 donantes sanos y 15 pacientes (T0, T4, T16, T32). Este ensayo nos permitirá identificar proteínas con diferencias significativas entre los grupos de estudio. Las proteínas seleccionadas serán solo aquellas con un P<0,05 y un cambio de pliegue ≥1,5 [56-59].

Puntos finales del estudio:

Los datos demográficos de todas las personas inscritas en el estudio se obtendrán al inicio. Además, se recopilarán varios datos, incluidos el historial de asma, los parámetros de la función pulmonar, la prueba cutánea, la IgE específica de alérgeno, la puntuación AQLQ, la puntuación ACT, el número de exacerbaciones y el consumo de prednisona. En las próximas visitas al servicio de Neumología de las T0, 4, 16 y 32 se realizará el seguimiento de los pacientes tratados con mepolizumab. Esto incluye mediciones de la función pulmonar (FEV1, FEV1/FVC), parámetros bioquímicos y hematológicos.

Se recolectarán muestras de sangre periférica y suero, y se purificarán magnéticamente los eosinófilos, en T0, T4, T16 y T32, y se realizarán análisis de citometría de flujo, RTqPCR y proteómica, así como inmunoensayos. Todas las variables experimentales (p. ej., la abundancia de proteínas de eosinófilos en ensayos proteómicos, marcadores de activación de eosinófilos,…) se correlacionarán con parámetros clínicos (p. ej., función pulmonar, control del asma, número de exacerbaciones) para evaluar la asociación de estas variables. con la respuesta al tratamiento. Consideraremos una respuesta favorable a mepolizumab si se cumple uno de los siguientes criterios:

• Para obtener un control adecuado del asma ACT ≥20 [60], o/ un cambio de ≥3 puntos que representa una diferencia mínimamente importante.
• Conseguir una reducción de la tasa anual de agudizaciones del 48%. La exacerbación se define como el aumento de los síntomas que requieren tratamiento con corticoides sistémicos durante ≥3, o una consulta médica no programada, similar a lo reflejado en los ensayos clínicos con mepolizumab [20, 61].
• Conseguir una reducción del 50% en la tasa anual de ingresos hospitalarios por exacerbación del asma, similar a la reflejada en los ensayos clínicos [62].
• Conseguir una reducción de la mediana de la dosis anual de corticoides sistémicos del 50% [63].

• Estudiar los puntos finales primarios:

  • Niveles de IGF-1, IGF-BP3 e IGF-ALS en suero
  • Datos de expresión transcriptómica (nanoString)/mRNA: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • datos proteómicos
  • Datos de citometría de flujo: expresión de CD16, galectinas-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L e IL-5Rα

• Estudiar criterios de valoración secundarios:

  • Parámetros de función pulmonar (FEV1, FEV1/FVC)
  • Parámetros hematológicos (p. ej., número de eosinófilos).
  • Otras variables clínicas y bioquímicas (p. ej., IgE u otras inmunoglobulinas).
  • Número de exacerbaciones, consumo de prednisona, puntuación ACT, puntuación AQLQ.

Plan estadístico o análisis de datos:

Graph Pad Prism se utilizará para crear gráficos. Para el estudio estadístico se utilizará IBM SPSS, Statistics 22.0 o R. Durante los análisis contaremos con la asistencia del área de Estadística e Investigación Operativa de la USC (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Tamaño de la muestra El cálculo del tamaño de la muestra (N) se ha realizado utilizando G*Power 3.1.9.4 [64]. Durante estos análisis calculamos N necesario para obtener significación estadística en una prueba F (ANOVA: medidas repetidas, dentro de los factores), dado α (0,05), potencia (1-β, 0,95), el número de mediciones (T0, T4, T16 y T32), y el tamaño del efecto (f = 0,4; tamaño del efecto grande, lo que da como resultados clínicamente más relevantes). El N de salida fue 15, con un F crítico= 2.82705.

Para datos clínicos, de citometría de flujo y transcriptómicos. Las comparaciones transversales entre HC y pacientes en T0 (antes del tratamiento) siguiendo una distribución normal y teniendo homogeneidad de varianzas se realizarán mediante el uso de la prueba t. Para variables distribuidas no normales, utilizaremos la prueba U de Mann-Whitney. Los cambios en las diferentes variables del estudio en respuesta al tratamiento con mepolizumab (estudio longitudinal; T0, T4, T16 y T32) se probarán mediante RM-ANOVA. Se realizarán análisis multivariante (por ejemplo, PCA, agrupamiento no supervisado) así como análisis de enriquecimiento funcional con citometría de flujo y, sobre todo, datos transcriptómicos.

Para la caracterización del proteoma total y el análisis SWATH cuantitativo, utilizaremos el software ProteinPilotTM 5.0.1 de ABSciex, que tiene el algoritmo ParagonTM para la búsqueda en la base de datos y ProgroupTM para la agrupación de datos. Los datos se buscarán utilizando una base de datos Uniprot específica para humanos. La tasa de descubrimiento falso se realizará utilizando un método de ajuste no lineal que muestra solo los resultados que informaron una tasa global de descubrimiento falso del 1 % o superior [65].

El análisis funcional se realizará mediante diferentes software de acceso abierto. FunRich (herramienta de análisis de enriquecimiento funcional) para el enriquecimiento funcional y el análisis de redes de interacción (http://funrich.org/index.html). Para las estadísticas, FunRich utiliza la prueba hipergeométrica, BH y Bonferroni [66, 67]. Usaremos DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) o GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) para el enriquecimiento de ontología génica y para la interacción proteína-proteína, red construcción y agrupamiento, usaremos String (https://string-db.org/) o Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

Para los datos SWATH, el software MarkerView nos brindará un análisis estadístico multivariante utilizando el análisis de componentes principales (PCA) para comparar los datos entre las muestras. El área promedio del pico de MS de cada proteína se derivará de las réplicas de SWATH-MS de cada muestra, seguido del análisis de la prueba t de Student usando el software MarkerView para comparar las muestras en función de las sumas de área promedio de todas las transiciones derivadas para cada proteína. La prueba t indicará qué tan bien cada variable distingue los dos grupos, informado como un valor P. Para la biblioteca, se seleccionará su conjunto de proteínas diferencialmente abundantes (valor p <0,05) con 1,5 proteínas reguladas al alza o a la baja.

Limitaciones

• Como se comentó anteriormente, se programará que 15 sujetos reciban mepolizumab durante la primera mitad del estudio (36 semanas). Esperamos que al menos el 90% de los sujetos completen este estudio. Sin embargo, los abandonos de los pacientes y la falta de adherencia (o incumplimiento) son eventos comunes en los estudios clínicos. En tal caso, el tamaño de la muestra se inflará proporcionalmente.
• El presente proyecto se ha planteado como un estudio del descubrimiento de biomarcadores moleculares en respuesta a mepolizumab. Este tipo de estudios se pueden abordar a través de enfoques dirigidos/impulsados ​​por hipótesis o más amplios/no dirigidos (tecnologías "-ómicas"). Somos conscientes de que podría ser difícil encontrar marcadores predictivos en este pequeño estudio prospectivo/de prueba de concepto. En el presente proyecto proponemos un doble enfoque para minimizar este riesgo. Por un lado, metodologías de trabajo modernas y no dirigidas y de alta sensibilidad para detectar proteínas poco abundantes (SWATH MS) o protocolos simplificados para trabajar con muestras difíciles (la generación de ARN de buena calidad a partir de eosinófilos siempre es un reto debido a la presencia de proteínas abundantes). como EDN, un miembro de la familia RNase) y reducir la variación técnica (p. ej., nCounter nanoString) para acortar el tamaño de las muestras. Por otro lado, los enfoques basados ​​en hipótesis (por ejemplo, citometría de flujo, RT-qPCR, ELISA), con las ventajas de una mayor credibilidad, menos riesgo de errores de tipo I (es decir, descubrimiento falso) y II, y fácil replicación futura de resultados Estas metodologías dirigidas también se utilizarán para confirmar solo las diferencias clínicamente relevantes (tamaño del efecto alto) y significativas (valor de p < 0,05) obtenidas con enfoques transcriptómicos/proteómicos no dirigidos.
• Otra posible limitación es el número de eosinófilos, que podría ser potencialmente bajo en algunos pacientes después del tratamiento con mepolizumab (50 x 103 o menos). Por lo tanto, podría ser necesario purificar más de 1 o 2 mL de sangre en esos pacientes para lograr suficientes células para realizar los experimentos proteómicos y transcriptómicos. Hemos considerado este tema en el protocolo de estudio y en el presupuesto del proyecto.
• Finalmente, el TripleTOF es un espectrómetro de masas de alta sensibilidad diseñado para profundizar en muestras complejas como el proteoma de eosinófilos. La alta sensibilidad de los espectrómetros de masas actuales combinada con esquemas bidimensionales de nanoLC permite la detección de un mayor número de proteínas (>1000) y analitos en concentraciones en el rango atomolar (10-18), suficiente para detectar proteínas intracelulares poco abundantes como quimiocinas o citocinas. Por lo tanto, TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 e IL-18 han sido detectados por nanoLC-MS/MS (Q-TOF), pero no otros como IL-5 o IL-13 [69]. ]. Esta limitación esperada se debe a la presencia de péptidos de proteínas muy abundantes (p. ej., proteínas de gránulos de eosinófilos) que suprimen la ionización de péptidos de proteínas poco abundantes en aplicaciones de LC-MS/MS. Esto lleva a la sobrerrepresentación en la lista de proteínas detectadas de especies abundantes como la proteína de cristal de Charcot-Leyden (CLC, galectina-10), que sigue siendo interesante para el presente proyecto ya que identifica eosinófilos con capacidades reguladoras. Sin embargo, para reducir la complejidad de la muestra y mejorar la detección de proteínas de baja abundancia, existen diferentes métodos de agotamiento (p. ej., agotamiento de ACN, ultrafiltración, 1-DE) y enriquecimiento (p. ej., CPLL) que podríamos usar para obtener detección. sensibilidad. Opcionalmente, enfoques específicos como inmunoensayos de alta multiplexación (p. ej., los paneles Olink Immune Response, Olink Inflammation o Olink Immuno-Oncology; https://www.olink.com/) tienen la ventaja de una alta sensibilidad de detección con un bajo volumen de muestras biológicas (por ejemplo, lisados ​​celulares), aunque solo permite la medición de 92 biomarcadores de proteínas a la vez.