Wpływ mepolizumabu na ciężką astmę eozynofilową (EMESEA)

hipotezy

Hº1. Poziomy niektórych cząsteczek powierzchniowych na eozynofilach lub obecność lub brak pewnych białek w proteomie tej podgrupy leukocytów przed leczeniem mepolizumabem można wykorzystać jako predykcyjne/prognostyczne markery odpowiedzi na ten czynnik biologiczny.

Hº2. Mepolizumab zmienia obfitość kilku białek powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych w eozynofilach w wyniku zmian ich statusu aktywacji, zdolności migracyjnych, funkcji regulatorowych/efektorowych lub składu podzbioru.

Hº3. Późna postać ciężkiej astmy eozynofilowej ma zwiększone stężenie różnych członków rodziny IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) w surowicy, a leczenie mepolizumabem zmniejsza te poziomy i zachowuje się jak biomarker odpowiedzi wraz z liczbą eozynofile i zaostrzenia kliniczne.

Cele lub pytania badawcze

OB (Cel aspiracyjny): Odkrycie predykcyjnych/prognostycznych biomarkerów odpowiedzi na mepolizumab przy użyciu cytometrii przepływowej, technologii transkryptomicznych i proteomicznych.

• OB1.- Identyfikacja zmian markerów powierzchniowych eozynofili i subpopulacji eozynofili w odpowiedzi na leczenie mepolizumabem z wykorzystaniem technik cytometrii przepływowej. Cel ten jest rozdzielony na następujące rezultaty (DE):

  • DE1.1: Wybór 15 zdrowych kontroli
  • DE1.2: Rozpoznanie pacjentów z ciężką astmą eozynofilową o późnym początku i wybór 15 pacjentów, którzy spełniają kryteria, mają otrzymać mepolizumab i podpisać świadomą zgodę.
  • DE1.3: Generowanie początkowej bazy danych dla zdrowych osób z grupy kontrolnej i pacjentów z astmą z informacjami demograficznymi, klinicznymi, hematologicznymi i biochemicznymi.
  • DE1.4: Pobieranie i przetwarzanie próbek surowicy (1 probówka SST) i próbek krwi pełnej (1-2 probówki) od zdrowych dawców (T0) i pacjentów leczonych mepolizumabem (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Testy cytometrii przepływowej z panelami multimarkerów 1 (regulatorowe), 2 (aktywacja) i 3 (podzbiory eozynofili) (patrz poniżej).
  • DE1.6: Uzupełnij bazę danych danymi klinicznymi, hematologicznymi, biochemicznymi i cytometrii przepływowej wygenerowanymi w czasach T4, T16 i T32. Końcowa jedno- i wielowariantowa analiza statystyczna.
  • DE1.7: Publikacja wyników.

• OB2.- Analiza transkryptomiczna w celu identyfikacji mRNA w transkryptomie eozynofili wykazujących zwiększone lub zmniejszone poziomy w odpowiedzi na leczenie mepolizumabem. Cel ten jest rozdzielony na następujące rezultaty (DE):

  • DE2.1: Przygotuj protokół izolacji eozynofili i sprawdź czystość komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
  • DE2.2: Oczyszczanie eozynofili od 15 zdrowych dawców (T0) i 15 pacjentów (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Ekstrakcja całkowitego RNA z lizatów eozynofili, oznaczenie jakości i ilości RNA oraz przechowywanie w -80ºC.
  • DE2.4: Podejście oparte na odkryciach/generowaniu hipotez. Ocena poziomów 770 mRNA kodujących ludzkie białka, powiązanych z rekrutacją, aktywacją i funkcjami efektorowymi komórek szpikowych za pomocą bezpośredniej multipleksowanej molekularnej platformy pomiarowej o nazwie nCounter® NanoString) w połączeniu z gotowym „nCounter® Human Myeloid Panel wrodzonej odporności (v2)” (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Ze względu na wysokie koszty ekonomiczne ta część badania zostanie przeprowadzona wyłącznie z próbkami eozynofili od zdrowych dawców (T = 0) i dwoma punktami czasowymi od pacjentów (T = 0 i T = 16).
  • DE2.5: Przetwarzanie uzyskanych danych i wstępna analiza statystyczna.
  • DE2.6: Walidacja danych nCounter® i podejście oparte na hipotezach z ustaloną techniką ilościową. Wykonaj analizy retrotranskrypcyjne i qPCR tych mRNA w eozynofilach, które wykazują największe zmiany liczebności w odpowiedzi na leczenie mepolizumabem zgodnie z badaniem nCounter®. Ponadto analizowane będą niektóre dodatkowe mRNA nieuwzględnione w panelu „nanoString Myeloid Innate Immunity”, takie jak FOXP3 (funkcja regulacyjna), CRLF2, ST2 lub IL-7R (receptory cytokin; aktywacja). W tym zestawie eksperymentów RTqPCR gen HPRT1 będzie używany jako gen utrzymujący porządek.
  • DE2.7: Jedno- i wielowariantowe analizy statystyczne.
  • DE2.8: Publikacja wyników transkryptomicznych.

• OB3.- Profilowanie proteomiczne w celu identyfikacji białek o zróżnicowanej liczebności w eozynofilach w odpowiedzi na leczenie mepolizumabem. Cel ten jest rozdzielony na następujące rezultaty (DE):

  • DE3.1: Liza eozynofili, usuwanie nierozpuszczalnego materiału przez wirowanie, oznaczanie ilościowe białka (BCA) i przechowywanie supernatantów komórkowych w temperaturze -80°C.
  • DE3.2: Opracuj protokół analizy całkowitego proteomu metodą Data Dependent Acquisition (DDA) przy użyciu technologii chromatografii cieczowej (LC)-MS / MS (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Sprawdź zmienność biologiczną (replikacje biologiczne) i technikę (repliki techniczne), aby sprawdzić odtwarzalność testów.
  • DE3.4: Utrzymując wystandaryzowane warunki LC-MS/MS (TripleTOF), utwórz bibliotekę dla SWATH (akwizycja sekwencyjnego okna wszystkich teoretycznych widm masowych) z jak największą liczbą białek eozynofili.
  • DE3.5: Wykonaj analizę SWATH-MS w próbkach od 15 zdrowych dawców i 15 pacjentów (T0, T4, T16, T32) (metoda „pozyskiwanie zależne od informacji” lub IDA; „Ukierunkowana proteomika bez znaczników”).
  • DE3.6: Przetwarzanie uzyskanych danych i wstępna analiza statystyczna.
  • DE3.7: Sprawdzenie panelu biomarkerów uzyskanych inną technologią (np. monitorowanie wybranych reakcji / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Ostateczna jedno- i wielowariantowa analiza statystyczna. Zidentyfikuj białka z istotnymi różnicami między grupami (P < 0,05) i co najmniej krotnością zmiany ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publikacja wyników proteomicznych

• OB4. Należy sprawdzić, czy u chorych na ciężką astmę eozynofilową o późnym początku stwierdza się podwyższone stężenia IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS w próbkach surowicy, czy odpowiedź na mepolizumab zależy od poziomu tych markerów oraz czy leczenie tym lekiem zmniejsza stężenie w surowicy tych członków rodziny IGF. Cel ten jest rozdzielony na następujące rezultaty (DE):

  • DE4.1: Analiza IGF-1, IGF-BP3 i IGF-ALS metodą ELISA
  • DE4.2: Jedno- i wielowariantowa analiza statystyczna danych eksperymentalnych
  • DE4.3: Publikacja wyników

Publikacja wyników:

Postaramy się przedstawić komunikat w pierwszym roku badań na Hiszpańskim Kongresie Chorób Płuc (SEPAR) oraz Europejskim Kongresie Chorób Płuc (ERS) wynikający z badania danych klinicznych pacjentów przed i po podaniu mepolizumabu . Ponadto spodziewamy się opublikowania 3 publikacji w czasopismach I kwartału oraz innych 2 lub 3 komunikatów kongresowych wynikających z badań eksperymentalnych.

Populacja badana Populacja badana będzie obejmowała osoby zdrowe (tj. pacjentów bez astmy, alergii, chorób ogólnoustrojowych lub zakwalifikowanych do mniejszych operacji) oraz pacjentów z ciężką astmą eozynofilową o późnym początku, którzy będą rekrutowani z różnych obszarów Galicji (Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo i Ourense), Hiszpania. Rozpoznanie pacjentów z ciężką astmą eozynofilową podczas badań przesiewowych będzie oparte na kilku kryteriach włączenia i wykluczenia, które opisujemy poniżej [12].

Kryteria przyjęcia:

• Rozpoznanie ciężkiej niekontrolowanej astmy według kryteriów ERS/ATS [52].
• Trwała eozynofilia we krwi (>300 komórek/μl) przy ≥ dwóch okazjach (więcej niż 4 tygodnie między każdym pomiarem).
• Częste zaostrzenia (≥ 2 razy w roku), definiowane jako okres ≥ 3 dni braku kontroli astmy wymagający leczenia ogólnoustrojowymi kortykosteroidami i/lub wizyty na oddziale ratunkowym (SOR) i/lub hospitalizacji.
• Podpisanie świadomej zgody i zgoda na przestrzeganie wszystkich wizyt w ramach badania i wszystkich związanych z tym procedur.

Kryteria wyłączenia:

• Historia palenia: Obecni lub byli palacze z historią palenia ≥10 paczkolat (liczba paczkolat = (liczba papierosów dziennie/20) x liczba wypalanych lat). Za byłego palacza uważa się uczestnika, który rzucił palenie co najmniej 6 miesięcy przed Wizytą 1.
• Klinicznie istotna choroba płuc inna niż astma (np. czynna infekcja płuc, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), rozstrzenie oskrzeli, zwłóknienie płuc, mukowiscydoza, zespół hipowentylacji związany z otyłością, rak płuc, niedobór alfa-1-antytrypsyny i pierwotna dyskineza rzęsek) lub kiedykolwiek zdiagnozowano chorobę płuc lub chorobę ogólnoustrojową inne niż astma, które są związane ze zwiększoną liczbą eozynofili w obwodowych układach nerwowych (np. alergiczna aspergiloza/grzybica oskrzelowo-płucna, zespół Churg-Straussa, zespół hipereozynofilowy).
• Wszelkie zaburzenia, w tym między innymi zaburzenia sercowo-naczyniowe, żołądkowo-jelitowe, wątrobowe, nerkowe, neurologiczne, mięśniowo-szkieletowe, zakaźne, hormonalne, metaboliczne, hematologiczne, psychiatryczne lub poważne upośledzenie fizyczne, które w opinii badacza nie są stabilne.
• Złośliwość: Obecny nowotwór złośliwy lub poprzednia historia raka w okresie remisji.
• Ostre infekcje górnych lub dolnych dróg oddechowych wymagające antybiotyków lub leków przeciwwirusowych w ciągu 30 dni przed Wizytą 1.
• Xolair: Uczestnicy, którzy otrzymali wcześniej omalizumab (Xolair) lub inne przeciwciało monoklonalne.
• Uczestnicy, którzy otrzymywali ogólnoustrojowe kortykosteroidy w ciągu 30 dni przed Wizytą 1 [53].
• Ciąża: Uczestnicy, którzy są w ciąży lub karmią piersią.
• Klasa otyłości 2 lub wyższa (BMI ≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Wielkość próbki

• Kohorta zdrowych kontroli (n=15) tylko do analizy przy T=0.

• Kohorta n = 15 pacjentów z ciężką astmą eozynofilową, którzy rozpoczęli leczenie mepolizumabem bez modyfikacji obecnie przepisywanych leków. Wizyty kontrolne w ramach badania po 4 (T4), 16 (T16) i 32 (T32) tygodniach od pierwotnej wizyty w ramach badania (T=0).

  • Uzasadnienie wielkości próby wyjaśniono w części dotyczącej statystyki.

Przewidywany wskaźnik włączenia Ponieważ będzie to badanie wieloośrodkowe, spodziewamy się, że w każdym szpitalu zostanie wciągniętych co najmniej 2 chorych na ciężką eozynofilową astmę rozpoczynających leczenie mepolizumabem miesięcznie (4 tygodnie) (ogółem = 8 na miesiąc). Oznacza to, że 15 pacjentów powinno otrzymać mepolizumab w ciągu pierwszych 36 tygodni tego badania, mając wystarczająco dużo czasu na ukończenie badania w ciągu 72 tygodni (1,5 roku). Oczekujemy również, że co najmniej 90% osób ukończy to badanie.

Przewidywana data rozpoczęcia badania: grudzień 2020 r. Przewidywana data zakończenia badania: 1,5 roku (72 tygodnie)

Projekt badania i metody

Rysunek 2. Projekt badania. Rysunek ten przedstawia schematycznie zarówno kliniczną, jak i eksperymentalną część badania.

Jest to obserwacyjne, podłużne, prospektywne i wieloośrodkowe badanie oceniające zarówno wczesną odpowiedź (4 tygodnie), jak i późną odpowiedź (16 i 32 tygodnie) na leczenie mepolizumabem u chorych na ciężką astmę eozynofilową. Badaniem będzie kierował dr Francisco Javier González Barcala (służba pulmonologiczna w CHUS). Dr Barcala był koordynatorem krajowym w jednym badaniu klinicznym, a także głównym badaczem i badaczem pomocniczym odpowiednio w 41 i 19 badaniach klinicznych. Ponadto dr Barcala był głównym badaczem 7 projektów badawczych, współpracownikiem w innych 7 projektach i opublikował ponad 120 odpowiednich publikacji (recenzowanych i indeksowanych przez JCR) w dziedzinie chorób układu oddechowego, głównie astmy.

W badaniu biorą udział także inni członkowie Multidyscyplinarnego Oddziału ds. Astmy (dr. Francisco Javier Salgado Castro, dr Juan José Nieto Fontarigo). W szczególności kierownik projektu, dr Salgado, był zaangażowany w 11 projektów badawczych, ma 28 artykułów naukowych w czasopismach o dużym wpływie, należących do dziedzin immunologii, biochemii, proteomiki i chorób układu oddechowego. Ponadto pozostali uczestnicy tego projektu mają szerokie doświadczenie w swoich dziedzinach, zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych. Są Dra. Marina Blanco Aparicio, odpowiedzialna za Oddział Astmy w Zespole Szpitala Uniwersyteckiego A Coruña (CHUAC), dr Uxío Calvo w Zespole Szpitala Uniwersyteckiego w Ferrol (CHUF) i Coral González w Zespole Szpitala Uniwersyteckiego w Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro w szpitalu Alvaro Cunqueiro w Vigo; Dolores Corbacho w szpitalu Povisa-Vigo. Konieczne będzie zatrudnienie naukowca w fazie predoctoral na okres 12 miesięcy do przygotowania próbek do badań transkryptomicznych i proteomicznych oraz testów RTqPCR, cytometrii przepływowej i ELISA. Ten naukowiec będzie pod nadzorem dr Francisco Javiera Salgado Castro i dr Juana José Nieto-Fontarigo (wielodyscyplinarny oddział astmy, CHUS). Eksperymenty proteomiczne przeprowadzi dr. Susana Belén Bravo López i María García Vence, które pracują na Platformie Proteomicznej w Fundacji Badań Sanitarnych w Santiago de Compostela (FIDIS). Analiza nCounter® zostanie przeprowadzona za pośrednictwem usługi oferowanej przez grupę GENVIP (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Projekt badawczy będzie minimalnie inwazyjny (np. bez badań bronchoskopowych), ale protokół musi zostać zweryfikowany i zatwierdzony przez Komisję Etyki Badań Klinicznych Galicji w Hiszpanii. Tylko piętnastu pacjentów, którzy spełniają kryteria rozpoznania ciężkiej astmy o późnym początku, ma otrzymać mepolizumab i podpisze świadomą zgodę, zostanie włączonych do tego badania. Ten sam protokół będzie przestrzegany przez różne zespoły kliniczne. Zmienne demograficzne, a także kliniczne, hematologiczne i biochemiczne zostaną umieszczone w bazie danych. Punktowe testy skórne na typowe alergeny i obecność swoistych dla alergenu IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) zostaną wykorzystane do sprawdzenia uczulenia alergicznego. Analizowane będą również parametry funkcji płuc (natężona objętość wydechowa w pierwszej sekundzie (FEV1), natężona pojemność życiowa (FVC) oraz stosunek FEV1/FVC). Spirometria zostanie przeprowadzona przed i po zastosowaniu leku rozszerzającego oskrzela. Przeprowadzony zostanie Test Kontroli Astmy (ACT) oraz Kwestionariusz Jakości Życia Astmy (AQLQ). Astmatycy muszą znajdować się w stabilnej fazie choroby (tj. brak zaostrzeń przez co najmniej 4 tygodnie przed pobraniem próbki). Zaostrzenia będą leczone zgodnie ze standardowymi wytycznymi klinicznymi. Pacjenci (n=15) otrzymają podskórnie 100 mg mepolizumabu w odstępach 4-tygodniowych, a próbki krwi i surowicy (2-3 probówki z EDTA; 1 probówka SST) zostaną pobrane w T=0, 4, 16 i 32 tygodniu, w celu oceny zarówno wczesnej odpowiedzi (4 tygodnie), jak i późnej odpowiedzi (16 i 32 tygodnie) na leczenie.

Metody

• Probówki: EDTA (krew pełna) i SST (surowica)

• Oczyszczanie eozynofili

  • Eozynofile można izolować z krwi pełnej (probówki z heparyną) przy użyciu zestawu Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (nr kat. 130-104-466) lub EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (nr kat. 17956). Obie procedury selekcji negatywnej dają nietknięte podzbiory te leukocyty. Oczekujemy co najmniej 1,0-4,0 x 106 komórek z ~20 ml krwi, ale także wysoka żywotność i czystość (>95%).

• badania ELISA.

  • Pobieranie próbek surowicy: pomiar IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 studzienek), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY291) i IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY675) za pomocą testu ELISA.

• Oczyszczanie całkowitego RNA z eozynofili i analiza nCounter nanoString (podejście oparte na odkryciach/generowaniu hipotez):

  • Oczyszczone eozynofile pochodzące od zdrowych kontroli (T=0) i pacjentów (T=0, 4, 16 i 32 tygodnie) będą przechowywane w temperaturze -80ºC w roztworze RNAlater (Ambion, Paisley, Wielka Brytania). Całkowity RNA zostanie wyizolowany za pomocą zestawu RNeasy Mini (Qiagen) i przechowywany w -80ºC po sprawdzeniu jakości i stężenia RNA (Nanodrop).
  • Platforma nCounter® (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) to multipleksowa metodologia, która umożliwia ilościową ocenę do 800 celów RNA, DNA lub białek. Jeśli chodzi o cząsteczki mRNA, technologia ta opiera się na hybrydyzacji w roztworze każdego mRNA do dwóch komplementarnych oligonukleotydów: biotynylowanej sondy specyficznej dla mRNA i oligonukleotydu specyficznego dla mRNA zawierającego sekwencyjną kombinację sześciu fluorochromów (cztery różne kolory), które tworzą fluorescencyjny kod kreskowy, który identyfikuje wykrywany specyficzny mRNA. Po usunięciu nadmiaru obu sond, zhybrydyzowane kompleksy są wychwytywane przez interakcję biotyna-streptawidyna i ustawiane na kartridżu, aby instrument nCounter mógł odczytać te „kody kreskowe”. Aby wykonać te kroki, platforma nCounter składa się z dwóch przyrządów: Prep Station, która przeprowadza oczyszczanie zhybrydyzowanych kompleksów i ich unieruchamianie na powierzchni kasety, oraz Digital Analyzer (DA), skaner, który identyfikuje i zlicza kody kreskowe przechwycone dla każdej próbki. Ta analiza ilościowa W związku z tym każdy miRNA można oznaczyć ilościowo indywidualnie (kwantyfikacja bezwzględna; zliczenia) z trudnych próbek (np. mniejsza zmienność danych (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Ponadto ilość materiału wejściowego jest niska (25 ng-300 ng mRNA) i może pochodzić z RNA pochodzącego z FFPE, całkowitego RNA, fragmentowanego RNA, lizatów komórkowych i sortowanych komórek. Następnie dane nCounter zostaną znormalizowane, odjęty szum tła i przeprowadzona dalsza korekcja w celu uwzględnienia wydajności ekstrakcji (obliczona na podstawie ekspresji miRNA w postaci spike-in, które zostaną dodane do próbki w określonej ilości przed ekstrakcją miRNA ). Normalizacje zostaną wykonane przy użyciu pakietu R NanoStringNorm. Po normalizacji dane zostaną poddane transformacji log2, a następnie przeanalizowane za pomocą pakietu LIMMA Bioconductor w celu zidentyfikowania tych mRNA, które wykazują zróżnicowaną obfitość po leczeniu mepolizumabem. Ta analiza nie zajmie więcej niż 24 godziny.

• Badania RTqPCR (podejście oparte na hipotezach):

  • Aby przeanalizować poziomy mRNA kodujących białka związane z aktywacją granulocytów kwasochłonnych za pośrednictwem alarminy (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) oraz z funkcją regulacyjną granulocytów kwasochłonnych (FOXP3) u pacjentów leczonych mepolizumabem, całkowity RNA zostanie przepisany na cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) i przechowywano w -80ºC. qPCR (zestaw QuantiTect SYBR Green PCR; Qiagen) zostanie przeprowadzony w aparacie LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) i wykorzystany do analizy ekspresji genu FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R i HPRT1 (kontrola endogenna).

• Badania metodą cytometrii przepływowej (podejście oparte na hipotezach):

  • Próbki krwi obwodowej traktowane EDTA od zdrowych osób kontrolnych (n=15; T0) i pacjentów leczonych mepolizumabem (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Oznacz 100 μl/probówkę pełnej krwi obwodowej (EDTA) zarówno swoistymi, jak i dopasowanymi izotypowo przeciwciałami kontrolnymi (BD). Liza krwinek czerwonych za pomocą FACSlyse (BD). Analiza za pomocą cytometru przepływowego FACSCalibur (BD). Użyj FSC/SSC, aby wybrać granulocyty; następnie SSC vs CCR3 (FITC) w celu oddzielenia eozynofili od neutrofili. Eozynofile bramkowe:

    • Multimarker panel 1 (Białka regulatorowe w eozynofilach): Pomiar CD16 i galektyn-1/10 [41-44].
    • Panel multimarkerów 2 (Receptory aktywacji w eozynofilach): Pomiar CD48 (zmniejszona liczba eozynofili ogółem z astmą umiarkowaną do ciężkiej w porównaniu ze zdrowymi kontrolami (HC) [nasze badania, 54]), CD44 i CD11b.
    • Panel multimarkerów 3 (podzbiory eozynofili): Analiza podzbiorów oparta na ekspresji Siglec-8, CD62L (L-selektyny) i IL-5Rα [40].

• Analiza proteomu eozynofili (podejście oparte na odkryciach/generowaniu hipotez):

  • Aż 50 x 103 komórek będzie potrzebnych do przeprowadzenia testów proteomicznych. Spodziewamy się około 50-400 x 103 komórek z około 1 ml krwi.
  • Izolowane eozynofile (50 x 103 komórek) zostaną zebrane przez odwirowanie, przemyte i ponownie zawieszone w buforze do lizy z inhibitorami proteinazy. Następnie nierozpuszczalny materiał zostanie usunięty przez odwirowanie, a supernatanty komórkowe będą przechowywane w temperaturze -80°C.
  • W przypadku eozynofili charakteryzacja proteomu całkowitego zostanie przeprowadzona po trawieniu trypsyną metodą DDA w systemie LC-MSMS. W tym podejściu wykorzystamy próbki od 15 zdrowych dawców i 15 pacjentów (T0, T4, T16, T32). Wybrane białka będą tylko tymi, które zgłosiły 1% Globalny współczynnik fałszywych odkryć (FDR) lub lepszy [55, 56].
  • Wykorzystane zostaną „pule” białek z 5 grup badawczych (zdrowi dawcy i pacjenci w czasie T0, T4, T16 i T32 po leczeniu), dzieląc je (1-DE) na 5-6 prążków, ekstrahując białka z każdego prążka, generując odpowiednie peptydy i analizując je za pomocą MS / MS w celu wytworzenia biblioteki dla SWATH z dużą liczbą białek, na których następnie zostanie przeprowadzona ocena ilościowa. Po stworzeniu biblioteki i zachowaniu wystandaryzowanych warunków LC-MS/MS (TripleTOF), przeprowadzimy analizę SWATH-MS (metoda „information-dependent Acquisition” lub IDA; „Targeted label-free proteomics”) w próbkach z 15 zdrowych dawców i 15 pacjentów (T0, T4, T16, T32). Ten test pozwoli nam zidentyfikować białka, które różnią się istotnie między badanymi grupami. Wybrane białka będą tylko tymi, które mają P<0,05 i krotność zmiany ≥1,5 [56-59].

Punkty końcowe badania:

Dane demograficzne dla wszystkich osób włączonych do badania zostaną uzyskane w dawce podstawowej. Ponadto zebranych zostanie kilka danych, w tym historia astmy, parametry czynności płuc, punktowe testy skórne, swoiste dla alergenu IgE, wynik AQLQ, wynik ACT, liczba zaostrzeń i zużycie prednizonu. Podczas kolejnych wizyt w Poradni Pneumologicznej w T0, 4, 16 i 32 pacjenci leczeni mepolizumabem będą objęci obserwacją. Obejmuje to pomiary czynności płuc (FEV1, FEV1/FVC), parametrów biochemicznych i hematologicznych.

Zostaną pobrane próbki krwi obwodowej i surowicy, a eozynofile zostaną oczyszczone magnetycznie w T0, T4, T16 i T32 oraz wykonane cytometria przepływowa, RTqPCR, analizy proteomiczne i testy immunologiczne. Wszystkie zmienne eksperymentalne (np. obfitość białek eozynofili w testach proteomicznych, markery aktywacji eozynofili, …) zostaną skorelowane z parametrami klinicznymi (np. czynność płuc, kontrola astmy, liczba zaostrzeń) w celu oceny związku tych zmiennych z odpowiedzią na leczenie. Rozważymy pozytywną odpowiedź na mepolizumab, jeśli zostanie spełnione jedno z poniższych kryteriów:

• Aby uzyskać odpowiednią kontrolę astmy, ACT ≥20 [60] lub/ zmiana o ≥3 punkty reprezentująca minimalnie istotną różnicę.
• Aby osiągnąć zmniejszenie rocznego wskaźnika zaostrzeń o 48%. Zaostrzenie definiuje się jako nasilenie objawów wymagających leczenia kortykosteroidami ogólnoustrojowymi przez ≥3 lub nieplanowanej konsultacji lekarskiej, podobne do obserwowanego w badaniach klinicznych z mepolizumabem [20, 61].
• Uzyskać 50% redukcję rocznego wskaźnika przyjęć do szpitala z powodu zaostrzenia astmy, podobnie jak w badaniach klinicznych [62].
• Osiągnięcie redukcji mediany rocznej dawki kortykosteroidów ogólnoustrojowych o 50% [63].

• Główne punkty końcowe badania:

  • Poziomy IGF-1, IGF-BP3 i IGF-ALS w surowicy
  • Dane dotyczące ekspresji transkryptomicznej (nanoString)/mRNA: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Dane proteomiczne
  • Dane z cytometrii przepływowej: ekspresja CD16, galektyn-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L i IL-5Rα

• Badanie drugorzędowych punktów końcowych:

  • Parametry czynności płuc (FEV1, FEV1/FVC)
  • Parametry hematologiczne (np. liczba eozynofili).
  • Inne zmienne kliniczne i biochemiczne (np. IgE lub inne immunoglobuliny).
  • Liczba zaostrzeń, zużycie prednizonu, wynik ACT, wynik AQLQ.

Plan statystyczny lub analiza danych:

Graph Pad Prism posłuży do stworzenia grafiki. Do badania statystycznego zostanie użyty IBM SPSS, Statistics 22.0 lub R. Podczas analiz będziemy wspomagani przez obszar Statystyki i Badań Operacyjnych USC (dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Liczebność próby Obliczenie liczebności próby (N) przeprowadzono za pomocą programu G*Power 3.1.9.4 [64]. Podczas tych analiz obliczamy N konieczne uzyskanie istotności statystycznej w teście F (ANOVA: powtarzane pomiary, w ramach czynników), biorąc pod uwagę α (0,05), moc (1-β, 0,95), liczbę pomiarów (T0, T4, T16 i T32) oraz wielkość efektu (f = 0,4; duża wielkość efektu, co daje bardziej klinicznie istotne wyniki). Wyjście N wynosiło 15, z krytycznym F= 2,82705.

Do danych klinicznych, cytometrii przepływowej i danych transkryptomicznych. Porównania przekrojowe między HC a pacjentami w T0 (przed leczeniem) po rozkładzie normalnym i z jednorodnością wariancji zostaną wykonane za pomocą testu t. Dla zmiennych o rozkładzie innym niż normalny użyjemy testu U Manna-Whitneya. Zmiany w różnych zmiennych badania w odpowiedzi na leczenie mepolizumabem (badanie podłużne; T0, T4, T16 i T32) zostaną przetestowane przy użyciu RM-ANOVA. Analiza wielowymiarowa (np. PCA, nienadzorowane grupowanie) oraz analiza wzbogacenia funkcjonalnego zostanie przeprowadzona za pomocą cytometrii przepływowej, a przede wszystkim danych transkryptomicznych.

Do całkowitej charakterystyki proteomu i ilościowej analizy SWATH użyjemy oprogramowania ProteinPilotTM 5.0.1 firmy ABSciex, które posiada algorytm ParagonTM do przeszukiwania bazy danych i ProgroupTM do grupowania danych. Dane będą wyszukiwane przy użyciu specyficznej dla ludzi bazy danych Uniprot. Wskaźnik fałszywych odkryć zostanie przeprowadzony przy użyciu nieliniowej metody dopasowywania, wyświetlając tylko te wyniki, które wykazały 1% Globalny wskaźnik fałszywych odkryć lub lepszy [65].

Analiza funkcjonalna zostanie przeprowadzona za pomocą różnych programów o otwartym dostępie. FunRich (narzędzie do analizy Functional Enrichment) do wzbogacania funkcjonalnego i analizy sieci interakcji (http://funrich.org/index.html). FunRich do celów statystycznych wykorzystuje test hipergeometryczny BH i Bonferroniego [66, 67]. Użyjemy DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) lub GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) do wzbogacenia ontologii genów i interakcji białko-białko, sieci konstrukcja i klastrowanie, użyjemy String (https://string-db.org/) lub Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

W przypadku danych SWATH oprogramowanie MarkerView zapewni nam wielowymiarową analizę statystyczną przy użyciu analizy głównych składowych (PCA) w celu porównania danych w próbkach. Średnia powierzchnia piku MS każdego białka zostanie uzyskana z powtórzeń SWATH-MS każdej próbki, po czym nastąpi analiza testu t-Studenta przy użyciu oprogramowania MarkerView w celu porównania między próbkami na podstawie uśrednionych sum powierzchni wszystkich przejść uzyskanych dla każde białko. Test t wskaże, jak dobrze każda zmienna rozróżnia dwie grupy, przedstawione jako wartość P. W przypadku biblioteki zostanie wybrany jej zestaw białek o różnej obfitości (wartość p <0,05) z białkami regulowanymi w górę lub w dół o 1,5.

Ograniczenia

• Jak wcześniej wspomniano, 15 pacjentów otrzyma mepolizumab w pierwszej połowie badania (36 tygodni). Oczekujemy, że co najmniej 90% osób ukończy to badanie. Jednak wypadki pacjentów i nieprzestrzeganie zaleceń (lub nieprzestrzeganie zaleceń) są częstymi zdarzeniami w badaniach klinicznych. W takim przypadku wielkość próby zostanie proporcjonalnie zawyżona.
• Niniejszy projekt został zaproponowany jako badanie odkrycia biomarkerów molekularnych w odpowiedzi na mepolizumab. Tego rodzaju badania można przeprowadzić za pomocą podejścia ukierunkowanego/opartego na hipotezach lub szerszego/nieukierunkowanego (technologie „-omiki”). Zdajemy sobie sprawę, że znalezienie markerów predykcyjnych w tym małym i prospektywnym/dowodowym badaniu koncepcji może być trudne. W niniejszym projekcie proponujemy podwójne podejście, aby zminimalizować to ryzyko. Z jednej strony nowoczesne i nieukierunkowane metodologie do pracy i bardzo czułe do wykrywania białek o niskiej liczebności (SWATH MS) lub uproszczone protokoły do ​​pracy z trudnymi próbkami (generowanie dobrej jakości RNA z eozynofili jest zawsze wyzwaniem ze względu na obecność obfitych białek jak EDN, członek rodziny RNaz) i zmniejszyć wariancję techniczną (np. nCounter nanoString) w celu skrócenia wielkości próbek. Z drugiej strony, podejścia oparte na hipotezach (np. cytometria przepływowa, RT-qPCR, ELISA), z zaletami większej wiarygodności, mniejszym ryzykiem błędów typu I (tj. fałszywego odkrycia) i II oraz łatwą replikacją w przyszłości wyników. Te ukierunkowane metodologie zostaną również wykorzystane do potwierdzenia jedynie istotnych klinicznie (wysoka wielkość efektu) i znaczących (wartość p < 0,05) różnic uzyskanych przy nieukierunkowanych podejściach transkryptomicznych/proteomicznych.
• Innym potencjalnym ograniczeniem jest liczba eozynofili, która może być potencjalnie niska u niektórych pacjentów po leczeniu mepolizumabem (50 x 103 lub mniej). Dlatego konieczne może być oczyszczenie więcej niż 1 lub 2 ml krwi u tych pacjentów w celu uzyskania wystarczającej liczby komórek do przeprowadzenia eksperymentów proteomicznych i transkryptomicznych. Rozważyliśmy tę kwestię w protokole badania oraz w budżecie projektu.
• Wreszcie, TripleTOF to wysoce czuły spektrometr masowy przeznaczony do głębszej analizy złożonych próbek, takich jak proteom eozynofili. Wysoka czułość obecnych spektrometrów masowych w połączeniu z dwuwymiarowymi schematami nanoLC pozwala na wykrywanie większej liczby białek (>1000) i analitów w stężeniach w zakresie atomolowym (10-18), wystarczających do wykrycia białek wewnątrzkomórkowych, takich jak chemokiny czy cytokiny. Zatem TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 i IL-18 zostały wykryte przez nanoLC-MS/MS (Q-TOF), ale nie inne, takie jak IL-5 lub IL-13 [69] ]. To oczekiwane ograniczenie wynika z obecności peptydów z białek występujących w dużej ilości (np. białek ziarnistych eozynofili), które hamują jonizację peptydów z białek występujących w małej ilości w zastosowaniach LC-MS/MS. Prowadzi to do nadreprezentacji na liście wykrytych białek obfitych gatunków, takich jak białko krystaliczne Charcota-Leydena (CLC, galektyna-10), które jest nadal interesujące dla niniejszego projektu, ponieważ identyfikuje eozynofile ze zdolnościami regulacyjnymi. Jednakże, aby zmniejszyć złożoność próbki i poprawić wykrywanie białek o niskiej liczebności, istnieją różne metody zubożenia (np. Zubożenie ACN, ultrafiltracja, 1-DE) i metody wzbogacania (np. CPLL), których moglibyśmy użyć do uzyskania wykrywania wrażliwość. Opcjonalnie ukierunkowane podejścia, takie jak testy immunologiczne o wysokim stopniu multipleksu (np. panele Olink Immune Response, Olink Inflammation lub Olink Immuno-Oncology; https://www.olink.com/) mają tę zaletę, że charakteryzują się wysoką czułością detekcji przy małej objętości próbek biologicznych (np. lizatów komórkowych), mimo że pozwalają na jednoczesny pomiar tylko 92 biomarkerów białkowych.