Эта страница была переведена автоматически, точность перевода не гарантируется. Пожалуйста, обратитесь к английской версии для исходного текста.

Влияние меполизумаба на тяжелую эозинофильную астму (EMESEA)

21 сентября 2023 г. обновлено: Francisco Javier González Barcala, Hospital Clinico Universitario de Santiago

Влияние меполизумаба на фенотип/протеом/транскриптом эозинофилов при тяжелой эозинофильной астме

Две части: A: исследование случай-контроль, включающее 15 здоровых взрослых доноров и 15 взрослых больных тяжелой эозинофильной астмой, выбранных для лечения меполизумабом. B: Продольное когортное исследование, в котором одни и те же пациенты, однократно получавшие меполизумаб, отслеживаются с течением времени (0, 4, 16 и 32 недели). ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ: ответ на меполизумаб при тяжелой эозинофильной астме у взрослых.

КРИТЕРИИ ВКЛЮЧЕНИЯ: мужчина или женщина, 18-75 лет, с тяжелой эозинофильной астмой. КРИТЕРИИ ИСКЛЮЧЕНИЯ: Курение в анамнезе, недавние обострения, другие легочные или системные заболевания с эозинофилией, злокачественные новообразования, беременность, ожирение (ИМТ>35). ЦЕЛИ: Общая цель: Открытие прогностических/прогностических биомаркеров ответа на меполизумаб с использованием проточной цитометрии, транскриптомных и протеомных технологий. ДРУГИЕ ЦЕЛИ: 1.-Определить изменения поверхностных маркеров эозинофилов и субпопуляций эозинофилов в ответ на лечение меполизумабом с использованием методов проточной цитометрии. 2.-Транскриптомный анализ для выявления мРНК в транскриптоме эозинофилов с повышенным или пониженным уровнем в ответ на лечение меполизумабом.3.-Протеомный профилирование для выявления белков с дифференциальным содержанием в эозинофилах в ответ на лечение меполизумабом. меполизумаба зависит от уровней этих маркеров, и если лечение этим биологическим препаратом снижает концентрацию в сыворотке этих членов семейства IGF.

ИЗМЕРЕНИЯ: Анализы проточной цитометрии с мультимаркерными панелями 1 (регуляторные), 2 (активационные) и 3 подмножества эозинофилов. Клинические, гематологические, биохимические данные и данные проточной цитометрии получены в моменты времени T4, T16 и T32. Выделение тотальной РНК из лизатов эозинофилов, анализ качества и количества РНК и хранение при -80ºC. Оценка уровней 770 мРНК, кодирующих белок человека, связанных с рекрутированием, активацией и эффекторными функциями миелоидных клеток, с помощью платформы прямого мультиплексного молекулярного измерения под названием nCounter® NanoString) в сочетании с готовым тестом nCounter® Human Myeloid. Панель врожденного иммунитета (v2)». Выполните анализ ретротранскрипции и количественной ПЦР тех мРНК в эозинофилах, которые демонстрируют наибольшие изменения численности в ответ на лечение меполизумабом в соответствии с исследованием nCounter®. Кроме того, будут проанализированы некоторые дополнительные мРНК, не включенные в панель «Нанострунный миелоидный врожденный иммунитет», такие как FOXP3 (регуляторная функция), CRLF2, ST2 или IL-7R (цитокиновые рецепторы; активация). Ген HPRT1 будет использоваться в качестве вспомогательного гена в этом наборе экспериментов RTqPCR. Выполните анализ SWATH-MS в образцах от 15 здоровых доноров и 15 пациентов (T0, T4, T16, T32) («метод информационно-зависимого сбора» или IDA; «Целевая протеомика без меток»).

Обзор исследования

Статус

Рекрутинг

Вмешательство/лечение

Подробное описание

Гипотезы

Hº1. Уровни определенных поверхностных молекул на эозинофилах или наличие или отсутствие определенных белков в протеоме этой подгруппы лейкоцитов до лечения меполизумабом можно использовать в качестве прогностических/прогностических маркеров ответа на этот биологический препарат.

Hº2. Меполизумаб изменяет содержание нескольких поверхностных или внутриклеточных белков в эозинофилах в результате изменения их статуса активации, миграционной способности, регуляторной/эффекторной функции или состава субпопуляции.

Hº3. Тяжелая эозинофильная астма с поздним началом характеризуется повышением концентрации в сыворотке различных членов семейства IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS), а лечение меполизумабом снижает эти уровни и действует как биомаркер ответа наряду с количеством эозинофилы и клинические обострения.

Цели или вопросы исследования

OB (желаемая цель): обнаружение прогностических/прогностических биомаркеров ответа на меполизумаб с использованием проточной цитометрии, транскриптомных и протеомных технологий.

  • OB1.- Выявление изменений поверхностных маркеров эозинофилов и субпопуляций эозинофилов в ответ на лечение меполизумабом с использованием методов проточной цитометрии. Эта цель распространяется на следующие результаты (DE):

    • DE1.1: Выбор 15 здоровых контролей
    • DE1.2: Диагностика пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом и выбор 15 пациентов, отвечающих критериям, которым назначено лечение меполизумабом, и которые подписали информированное согласие.
    • DE1.3: Создание исходной базы данных для здоровых людей и пациентов с астмой с демографической, клинической, гематологической и биохимической информацией.
    • DE1.4: Сбор и обработка образцов сыворотки (1 пробирка SST) и цельной крови (1-2 пробирки) здоровых доноров (T0) и пациентов, получавших меполизумаб (T0, T4, T16, T32).
    • DE1.5: анализы проточной цитометрии с мультимаркерными панелями 1 (регуляторные), 2 (активационные) и 3 (подмножества эозинофилов) (см. ниже).
    • DE1.6: Заполните базу данных клиническими, гематологическими, биохимическими данными и данными проточной цитометрии, полученными в моменты времени T4, T16 и T32. Итоговый одно- и многовариантный статистический анализ.
    • DE1.7: Публикация результатов.
  • OB2.- Транскриптомный анализ для выявления мРНК в транскриптоме эозинофилов с повышенным или пониженным уровнем в ответ на лечение меполизумабом. Эта цель распространяется на следующие результаты (DE):

    • DE2.1: Настройте протокол выделения эозинофилов и проверьте чистоту клеток с помощью проточной цитометрии.
    • DE2.2: Очистка эозинофилов от 15 здоровых доноров (T0) и 15 пациентов (T0, T4, T16, T32).
    • DE2.3: Извлечение тотальной РНК из лизатов эозинофилов, анализ качества и количества РНК и хранение при -80ºC.
    • DE2.4: Подход, основанный на открытии/выдвижении гипотез. Оценка уровней 770 мРНК, кодирующих белок человека, связанных с рекрутированием, активацией и эффекторными функциями миелоидных клеток, с помощью платформы прямого мультиплексного молекулярного измерения под названием nCounter® NanoString) в сочетании с готовым тестом nCounter® Human Myeloid. Панель врожденного иммунитета (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Из-за высокой экономической стоимости эта часть исследования будет проводиться только с образцами эозинофилов от здоровых доноров (T = 0) и двумя временными точками у пациентов (T = 0 и T = 16).
    • DE2.5: Обработка полученных данных и первичный статистический анализ.
    • DE2.6: Проверка данных nCounter® и подхода, основанного на гипотезах, с установленным количественным методом. Выполните анализ ретротранскрипции и количественной ПЦР тех мРНК в эозинофилах, которые демонстрируют наибольшие изменения численности в ответ на лечение меполизумабом в соответствии с исследованием nCounter®. Кроме того, будут проанализированы некоторые дополнительные мРНК, не включенные в панель «Нанострунный миелоидный врожденный иммунитет», такие как FOXP3 (регуляторная функция), CRLF2, ST2 или IL-7R (цитокиновые рецепторы; активация). Ген HPRT1 будет использоваться в качестве вспомогательного гена в этом наборе экспериментов RTqPCR.
    • DE2.7: Одно- и многовариантный статистический анализ.
    • DE2.8: Публикация результатов транскриптомии.
  • OB3.- Протеомное профилирование для выявления белков с различным содержанием в эозинофилах в ответ на лечение меполизумабом. Эта цель распространяется на следующие результаты (DE):

    • DE3.1: лизис эозинофилов, удаление нерастворимого материала центрифугированием, количественный анализ белка (BCA) и хранение супернатантов клеток при -80°C.
    • DE3.2: Разработайте протокол общего анализа протеома с помощью метода сбора данных (DDA) с использованием технологии жидкостной хроматографии (ЖХ)-МС/МС (Triple TOF 6600)
    • DE3.3: Проверить биологическую изменчивость (биологические повторения) и технику (технические повторения) для проверки воспроизводимости тестов.
    • DE3.4: Поддерживая стандартизированные условия ЖХ-МС/МС (TripleTOF), создайте библиотеку для SWATH (последовательное получение всех теоретических масс-спектров в окне) с максимально возможным количеством белков эозинофилов.
    • DE3.5: Выполните анализ SWATH-MS в образцах от 15 здоровых доноров и 15 пациентов (T0, T4, T16, T32) (метод "информационно-зависимого сбора" или IDA; "Целевая протеомика без меток").
    • DE3.6: Обработка полученных данных и первичный статистический анализ.
    • DE3.7: Проверка панели биомаркеров, полученных с помощью другой технологии (например, мониторинг избранных реакций/SRM, ELISA).
    • DE3.8: Окончательный одно- и многовариантный статистический анализ. Идентифицируйте белки со значительными различиями между группами (P <0,05) и по крайней мере кратным изменением ≥ 1,5.
    • DE3.9: Публикация результатов протеомики
  • ОБ4. Проверить, проявляются ли у больных тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом повышенные уровни IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS в образцах сыворотки, зависит ли ответ на меполизумаб от уровней этих маркеров, и снижает ли лечение этим биологическим препаратом концентрацию в сыворотке этих членов семейства IGF. Эта цель распространяется на следующие результаты (DE):

    • DE4.1: Анализ IGF-1, IGF-BP3 и IGF-ALS с помощью ELISA
    • DE4.2: Одно- и многовариантный статистический анализ экспериментальных данных
    • DE4.3: Публикация результатов

Публикация результатов:

Мы постараемся представить сообщение в течение первого года исследования на Испанском респираторном конгрессе (SEPAR), а также на Европейском респираторном конгрессе (ERS), в результате изучения клинических данных пациентов до и после введения меполизумаба. . Кроме того, мы планируем опубликовать 3 публикации в журналах Q1, а также 2 или 3 других конгрессных сообщения, полученных в результате экспериментальных исследований.

Исследуемая популяция Исследуемая популяция будет включать здоровую контрольную группу (т. е. субъектов без астмы, аллергии, системных заболеваний или запланированных на небольшие операции) и пациентов с тяжелой эозинофильной астмой с поздним началом, которые будут набраны из разных областей Галисии (Сантьяго-де-Компостела, А. Корунья, Луго, Виго и Оренсе), Испания. Диагноз пациентов с тяжелой эозинофильной астмой при скрининге будет основываться на нескольких критериях включения и исключения, которые мы опишем ниже [12].

Критерии включения:

  • Диагностика тяжелой неконтролируемой астмы по критериям ERS/ATS [52].
  • Стойкая эозинофилия в крови (>300 клеток/мкл) в ≥ двух случаях (более 4 недель между каждым измерением).
  • Частые обострения (≥ двух в год), определяемые как период отсутствия контроля над астмой в течение ≥ 3 дней, требующий лечения системными кортикостероидами и/или обращения в отделение неотложной помощи и/или госпитализации.
  • Подписание информированного согласия и согласие соблюдать все посещения исследования и все процедуры, которые это влечет за собой.

Критерий исключения:

  • История курения: нынешние курильщики или бывшие курильщики со стажем курения ≥10 пачек-лет (количество пачек-лет = (количество сигарет в день/20) x количество лет курения). Бывший курильщик определяется как участник, который бросил курить как минимум за 6 месяцев до визита 1.
  • Клинически значимое заболевание легких, отличное от астмы (например, активная инфекция легких, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), бронхоэктазы, легочный фиброз, кистозный фиброз, синдром гиповентиляции, связанный с ожирением, рак легких, дефицит альфа-1-антитрипсина и первичная цилиарная дискинезия) или когда-либо диагностированные легочные или системные заболевания , кроме астмы, которые связаны с повышенным количеством периферических эозинофилов (например, аллергический бронхолегочный аспергиллез/микоз, синдром Чарга-Стросса, гиперэозинофильный синдром).
  • Любое расстройство, включая, помимо прочего, сердечно-сосудистое, желудочно-кишечное, печеночное, почечное, неврологическое, скелетно-мышечное, инфекционное, эндокринное, метаболическое, гематологическое, психическое или серьезное физическое нарушение, которое, по мнению исследователя, не является стабильным.
  • Злокачественное новообразование: Текущее злокачественное новообразование или рак в анамнезе в стадии ремиссии.
  • Острые инфекции верхних или нижних дыхательных путей, требующие назначения антибиотиков или противовирусных препаратов в течение 30 дней до визита 1.
  • Ксолар: участники, которые ранее получали омализумаб (Ксолар) или другое моноклональное антитело.
  • Участники, получавшие системные кортикостероиды в течение 30 дней до визита 1 [53].
  • Беременность: Участники, которые беременны или кормят грудью.
  • Ожирение 2 степени или выше (ИМТ ≥ 35 кг/м2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Размер образца

  • Когорта здоровых контролей (n = 15) только для анализа при T = 0.
  • Когорта из n = 15 пациентов с тяжелой эозинофильной астмой, которые начинают терапию меполизумабом без изменения назначенных им в настоящее время лекарств. Последующие учебные визиты через 4 (T4), 16 (T16) и 32 (T32) недели после исходного учебного визита (T=0).

    • Обоснование размера выборки объясняется в статистическом разделе.

Ожидаемый уровень охвата. Поскольку это будет многоцентровое исследование, мы ожидаем, что в каждом госпитале будет участвовать не менее 2 пациентов с тяжелой эозинофильной астмой, начинающих терапию меполизумабом, в месяц (4 недели) (всего = 8 в месяц). Это означает, что 15 субъектов должны получать меполизумаб в течение первых 36 недель этого исследования, имея достаточно времени для завершения исследования за 72 недели (1,5 года). Мы также ожидаем, что по крайней мере 90% испытуемых завершат это исследование.

Предполагаемая дата начала исследования: декабрь 2020 г. Предполагаемая дата завершения исследования: 1,5 года (72 недели)

Дизайн и методы исследования

Рисунок 2. Дизайн исследования. На этом рисунке схематически представлены как клиническая, так и экспериментальная части исследования.

Это обсервационное, лонгитюдное, проспективное и многоцентровое исследование для оценки как раннего ответа (4 недели), так и позднего ответа (16 и 32 недели) на терапию меполизумабом у больных с тяжелой эозинофильной астмой. Исследование возглавит доктор Франсиско Хавьер Гонсалес Баркала (служба пневмологии CHUS). Доктор Баркала был национальным координатором в одном клиническом испытании, а также главным исследователем и вспомогательным исследователем в 41 и 19 клинических испытаниях соответственно. Кроме того, д-р Баркала был главным исследователем 7 исследовательских проектов, соавтором еще 7 проектов и опубликовал более 120 соответствующих публикаций (рецензируемых и проиндексированных JCR) в области респираторных заболеваний, в основном астмы.

В исследовании также участвуют другие члены многопрофильного отделения астмы (д-р. Франсиско Хавьер Сальгадо Кастро, доктор Хуан Хосе Ньето Фонтариго). В частности, руководитель проекта д-р Сальгадо принимал участие в 11 исследовательских проектах, имеет 28 исследовательских работ в авторитетных журналах, относящихся к областям иммунологии, биохимии, протеомики и респираторных заболеваний. Кроме того, другие участники этого проекта имеют большой опыт в соответствующих областях, как фундаментальных, так и трансляционных исследований. Они Дра. Марина Бланко Апарисио, ответственная за отделение астмы в университетском больничном комплексе Ла-Коруньи (CHUAC), доктор Уксио Кальво в университетском больничном комплексе Феррола (CHUF) и Корал Гонсалес в университетском больничном комплексе Оренсе (CHUO) , Мар Мостейро в больнице Альваро Кункейро в Виго; Долорес Корбачо в больнице Повиза-Виго. Необходимо будет нанять исследователя на преддокторском этапе на 12 месяцев для подготовки образцов для транскриптомных и протеомных исследований, а также для RTqPCR, проточной цитометрии и анализов ELISA. Этот исследователь будет находиться под наблюдением доктора Франсиско Хавьера Сальгадо Кастро и доктора Хуана Хосе Ньето-Фонтариго (Многодисциплинарное отделение астмы, CHUS). Эксперименты по протеомике будут проводиться Дра. Сусана Белен Браво Лопес и Мария Гарсия Венс, работающие над протеомной платформой Фонда санитарных исследований Сантьяго-де-Компостела (FIDIS). Анализ nCounter® будет проводиться через сервис, предлагаемый группой GENVIP (Группа генетики, вакцин и инфекций в педиатрии; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Исследовательский проект будет минимально инвазивным (например, без бронхоскопических исследований), но протокол должен быть рассмотрен и одобрен Комитетом по этике клинических исследований Галисии, Испания. В это исследование будут включены только 15 пациентов, отвечающих критериям диагностики поздней тяжелой астмы, которым назначено лечение меполизумабом и которые подпишут информированное согласие. Один и тот же протокол будет применяться разными клиническими бригадами. Демографические, а также клинические, гематологические и биохимические параметры будут включены в базу данных. Кожные прик-тесты на распространенные аллергены и наличие аллерген-специфических IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) будут использоваться для проверки аллергической сенсибилизации. Также будут проанализированы параметры функции легких (объем форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ1), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ) и соотношение ОФВ1/ФЖЕЛ). Спирометрию проводят до и после применения бронхолитиков. Будут проведены тест контроля астмы (ACT) и опросник качества жизни при астме (AQLQ). Астматики должны находиться в стабильной фазе заболевания (т.е. отсутствие обострений в течение как минимум 4 недель до взятия образца). Обострения лечат в соответствии со стандартными клиническими рекомендациями. Пациенты (n = 15) будут получать 100 мг меполизумаба подкожно с интервалом в 4 недели, а образцы крови и сыворотки (2-3 пробирки с ЭДТА; 1 пробирка с SST) будут взяты через T = 0, 4, 16 и 32 недели. для оценки как раннего ответа (4 недели), так и позднего ответа (16 и 32 недели) на лечение.

Методы

  • Пробирки: ЭДТА (полная кровь) и SST (сыворотка)
  • Очистка эозинофилов

    • Эозинофилы могут быть выделены из цельной крови (гепариновые пробирки) с использованием набора для выделения эозинофилов человека Miltenyi (каталожный номер 130-104-466) или набора для выделения эозинофилов человека EasySep™ (каталожный номер 17956). эти лейкоциты. Мы ожидаем, по крайней мере, 1.0-4.0 х 106 клеток из ∼20 мл крови, а также высокая жизнеспособность и чистота (>95%).
  • ИФА-исследования.

    • Сбор образцов сыворотки: измерение IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS, 96 лунок), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, № по каталогу DY291) и IGF-BP3 (Human IGFBP-3). DuoSet ELISA, R&D Systems, № по каталогу DY675) с помощью ELISA.
  • Полная очистка РНК от эозинофилов и анализ nCounter nanoString (подход, основанный на открытии/выдвижении гипотез):

    • Очищенные эозинофилы от здоровых контролей (T=0) и пациентов (T=0, 4, 16 и 32 недели) будут храниться при -80ºC в растворе RNAlater (Ambion, Paisley, UK). Суммарную РНК выделяют с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen) и хранят при температуре -80ºC после проверки качества и концентрации РНК (Nanodrop).
    • Платформа nCounter® (nanoString; https://www.nanoString.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) представляет собой мультиплексную методологию, которая позволяет проводить количественную оценку до 800 мишеней РНК, ДНК или белков. Что касается молекул мРНК, эта технология основана на гибридизации в растворе каждой мРНК с двумя комплементарными олигонуклеотидами: биотинилированным мРНК-специфическим зондом и мРНК-специфическим олигонуклеотидом, содержащим последовательную комбинацию шести флуорохромов (четырех разных цветов), которые создают флуоресцентный штрих-код, который идентифицирует конкретную обнаруживаемую мРНК. После удаления избытка обоих зондов гибридизированные комплексы захватываются за счет взаимодействия биотин-стрептавидин и выравниваются на картридже, чтобы прибор nCounter мог считывать эти «штрих-коды». Для выполнения этих шагов платформа nCounter состоит из двух инструментов: Prep Station, выполняющей очистку гибридизированных комплексов и их иммобилизацию на поверхности картриджа, и Digital Analyzer (DA), сканера, который идентифицирует и подсчитывает штрих-коды, полученные для каждого образца. Этот количественный анализ Таким образом, каждая микроРНК может быть определена индивидуально (абсолютная количественная оценка, подсчет) из сложных образцов (например, эозинофилов) без необходимости выполнения других требований, таких как преобразование мРНК-кДНК (RT) или амплификация ДНК (qPCR), что приводит к меньшая изменчивость данных (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Кроме того, количество вводимого материала невелико (25 нг-300 нг мРНК) и может быть получено из РНК, полученной из FFPE, тотальной РНК, фрагментированной РНК, клеточных лизатов и отсортированных клеток. После этого данные nCounter будут нормализованы, фоновый шум вычтен, а дальнейшая коррекция будет выполнена для учета эффективности выделения (рассчитывается на основе экспрессии микроРНК с добавлением, которые будут добавлены в образец в определенном количестве перед экстракцией микроРНК). ). Нормализация будет выполняться с использованием пакета R NanoStringNorm. После нормализации будет проведено преобразование данных в log2, а затем они будут проанализированы с помощью пакета LIMMA Bioconductor для выявления тех мРНК, которые демонстрируют различное содержание при лечении меполизумабом. Этот анализ займет не более 24 часов.
  • Исследования RTqPCR (подход, основанный на гипотезах):

    • Для анализа уровней мРНК, кодирующих белки, связанные с алармином-опосредованной активацией эозинофилов (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) и с регуляторной функцией эозинофилов (FOXP3), у пациентов, получавших меполизумаб, общая РНК будет транскрибирована в кДНК. (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) и хранили при температуре -80ºC. qPCR (набор QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) будет проводиться на приборе LightCycler® 96 (Roche Life Science) и использоваться для анализа экспрессии FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R и гена HPRT1 (эндогенный контроль).
  • Исследования проточной цитометрии (подход, основанный на гипотезах):

    • Образцы периферической крови, обработанные ЭДТА, от здоровых контролей (n = 15; T0) и пациентов, получавших меполизумаб (n = 15; T0, T4, T16, T32).
    • Пометьте 100 мкл/пробирку цельной периферической крови (ЭДТА) как специфическими, так и соответствующими по изотипу контрольными антителами (BD). Лизис эритроцитов с помощью FACSlyse (BD). Анализ на проточном цитометре FACSCalibur (BD). Используйте FSC/SSC для выбора гранулоцитов; затем SSC против CCR3 (FITC) для отделения эозинофилов от нейтрофилов. Воротные эозинофилы:

      • Панель мультимаркеров 1 (регуляторные белки в эозинофилах): измерение CD16 и галектинов-1/10 [41-44].
      • Панель мультимаркеров 2 (рецепторы активации в эозинофилах): измерение CD48 (снижение общего числа эозинофилов при астме средней и тяжелой степени по сравнению со здоровым контролем (HC) [наши исследования, 54]), CD44 и CD11b.
      • Панель мультимаркеров 3 (подмножества эозинофилов): анализ подмножеств на основе экспрессии Siglec-8, CD62L (L-селектин) и IL-5Rα [40].
  • Анализ протеома эозинофилов (подход, основанный на открытии/выдвижении гипотез):

    • Для проведения протеомных анализов потребуется до 50 х 103 клеток. Мы ожидаем около 50-400 х 103 клеток из примерно 1 мл крови.
    • Изолированные эозинофилы (50 х 103 клеток) собирают центрифугированием, промывают и ресуспендируют в лизирующем буфере с ингибиторами протеиназы. После этого нерастворимый материал удаляют центрифугированием, а супернатанты клеток хранят при температуре -80°C.
    • Для эозинофилов общая характеристика протеома будет выполнена после расщепления трипсином с использованием метода DDA в системе LC-MSMS. Для этого подхода мы будем использовать образцы от 15 здоровых доноров и 15 пациентов (T0, T4, T16, T32). Выбранными белками будут только те, которые сообщили об уровне глобальных ложных открытий (FDR) 1% или выше [55, 56].
    • Будут использовать белковые «пулы» из 5 групп исследования (здоровые доноры и пациенты в моменты времени T0, T4, T16 и T32 после лечения), разделив их (1-DE) на 5-6 полос, извлекая белки из каждой band, генерируя соответствующие пептиды и анализируя их с помощью МС/МС для получения библиотеки для SWATH с большим количеством белков, на которой затем будет проводиться количественная оценка. После создания библиотеки и поддержания стандартных условий ЖХ-МС / МС (TripleTOF) мы проведем анализ SWATH-MS («метод информационно-зависимого сбора» или IDA; «Целевая протеомика без меток») в образцах из 15 здоровых доноров и 15 пациентов (Т0, Т4, Т16, Т32). Этот анализ позволит нам идентифицировать белки со значительными различиями между исследуемыми группами. Выбранными белками будут только те, у которых P<0,05 и кратность изменения ≥1,5 [56-59].

Конечные точки исследования:

Демографические данные для всех лиц, включенных в исследование, будут получены в начале исследования. Кроме того, будут собраны некоторые данные, включая историю астмы, параметры функции легких, кожный прик-тест, аллерген-специфический IgE, показатель AQLQ, показатель ACT, количество обострений и потребление преднизолона. Во время следующих посещений службы пульмонологии в T0, 4, 16 и 32 пациенты, получавшие меполизумаб, будут находиться под наблюдением. Сюда входят измерения функции легких (ОФВ1, ОФВ1/ФЖЕЛ), биохимических и гематологических параметров.

Будут собраны образцы периферической крови и сыворотки, а эозинофилы будут подвергнуты магнитной очистке в T0, T4, T16 и T32, а также будет проведена проточная цитометрия, RTqPCR и протеомный анализ, а также иммуноанализ. Все экспериментальные переменные (например, содержание эозинофильных белков в протеомных анализах, маркеры активации эозинофилов и т. д.) будут коррелировать с клиническими параметрами (например, функцией легких, контролем астмы, количеством обострений) для оценки связи этих переменных. с реакцией на лечение. Мы будем рассматривать благоприятный ответ на меполизумаб, если выполняется один из следующих критериев:

  • Для достижения адекватного контроля над астмой ACT ≥20 [60] или/ изменение ≥3 баллов, представляющее минимально важное различие.
  • Добиться снижения ежегодной частоты обострений на 48%. Обострение определяется как усиление симптомов, требующих лечения системными кортикостероидами в течение ≥3 дней или внеплановой медицинской консультации, аналогично тому, что было отражено в клинических исследованиях меполизумаба [20, 61].
  • Получите 50-процентное снижение годовой частоты госпитализаций из-за обострения астмы, аналогично тому, что отражено в клинических испытаниях [62].
  • Добиться снижения средней годовой дозы системных кортикостероидов на 50% [63].
  • Первичные конечные точки исследования:

    • Уровни IGF-1, IGF-BP3 и IGF-ALS в сыворотке
    • Данные транскриптомной (nanoString)/мРНК экспрессии: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
    • Протеомные данные
    • Данные проточной цитометрии: экспрессия CD16, галектинов-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L и IL-5Rα.
  • Изучите вторичные конечные точки:

    • Параметры функции легких (ОФВ1, ОФВ1/ФЖЕЛ)
    • Гематологические параметры (например, число эозинофилов).
    • Другие клинические и биохимические показатели (например, IgE или другие иммуноглобулины).
    • Количество обострений, потребление преднизолона, оценка ACT, оценка AQLQ.

Статистический план или анализ данных:

Graph Pad Prism будет использоваться для создания графики. Для статистического исследования будет использоваться IBM SPSS, Statistics 22.0 или R. Во время анализа нам будет помогать отдел статистики и операционных исследований Университета Южной Калифорнии (д-р. Роза Мария Крухейрас Касаис).

Размер выборки Расчет размера выборки (N) был выполнен с использованием G*Power 3.1.9.4 [64]. Во время этих анализов мы рассчитываем N, необходимое для получения статистической значимости в F-тесте (ANOVA: повторные измерения, в пределах факторов), учитывая α (0,05), мощность (1-β, 0,95), количество измерений (T0, T4, T16 и T32) и размер эффекта (f = 0,4; большой размер эффекта, что дает более клинически значимые результаты). Выход N был равен 15 с критическим значением F = 2,82705.

Для клинических данных, проточной цитометрии и транскриптомных данных. Поперечные сравнения между HC и пациентами в T0 (до лечения) в соответствии с нормальным распределением и однородностью дисперсии будут проводиться с использованием t-критерия. Для переменных с ненормальным распределением мы будем использовать U-критерий Манна-Уитни. Изменения различных переменных исследования в ответ на лечение меполизумабом (продольное исследование; T0, T4, T16 и T32) будут тестироваться с использованием RM-ANOVA. Многофакторный анализ (например, PCA, неконтролируемая кластеризация), а также анализ функционального обогащения будут выполняться с помощью проточной цитометрии и, прежде всего, транскриптомных данных.

Для полной характеристики протеома и количественного анализа SWATH мы будем использовать программное обеспечение ProteinPilotTM 5.0.1 от ABSciex, которое имеет алгоритм ParagonTM для поиска в базе данных и ProgroupTM для группировки данных. Поиск данных будет производиться с использованием специальной базы данных Uniprot для человека. Частота ложных обнаружений будет выполняться с использованием метода нелинейной аппроксимации, отображающего только те результаты, которые сообщают о глобальной частоте ложных обнаружений 1% или выше [65].

Функциональный анализ будет выполняться с помощью различных программ открытого доступа. FunRich (инструмент анализа функционального обогащения) для функционального обогащения и анализа сети взаимодействия (http://funrich.org/index.html). Для статистики FunRich использует гипергеометрический тест BH и Bonferroni [66, 67]. Мы будем использовать DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) или GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) для обогащения онтологии генов и для белок-белкового взаимодействия, сети построения и кластеризации мы будем использовать String (https://string-db.org/) или Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

Для данных SWATH программное обеспечение MarkerView предоставит нам многомерный статистический анализ с использованием анализа основных компонентов (PCA) для сравнения данных по выборкам. Средняя площадь пика МС каждого белка будет получена из повторов SWATH-MS каждого образца с последующим анализом t-критерия Стьюдента с использованием программного обеспечения MarkerView для сравнения между образцами на основе усредненных сумм площадей всех переходов, полученных для каждого белка. Стьюдентный критерий покажет, насколько хорошо каждая переменная различает две группы, представленные в виде P-значения. Для библиотеки будет выбран ее набор дифференциально распространенных белков (значение p <0,05) с 1,5 белками с повышенной или пониженной регуляцией.

Ограничения

  • Как отмечалось ранее, 15 субъектов будут получать меполизумаб в течение первой половины исследования (36 недель). Мы ожидаем, что по крайней мере 90% испытуемых завершат это исследование. Однако выбывание пациентов из исследования и несоблюдение режима лечения (или несоблюдение) являются обычными явлениями в клинических исследованиях. В таком случае размер выборки будет пропорционально увеличен.
  • Настоящий проект был предложен как исследование открытия молекулярных биомаркеров в ответ на меполизумаб. Этот вид исследований можно проводить с помощью целевых/гипотезированных или более широких/нецелевых подходов (технологии «омикс»). Мы понимаем, что может быть сложно найти прогностические маркеры в этом небольшом и проспективном/доказательном концептуальном исследовании. В настоящем проекте мы предлагаем двойной подход для минимизации этого риска. С одной стороны, современные и нецелевые методологии для работы и высокая чувствительность для обнаружения белков с низким содержанием (SWATH MS) или упрощенные протоколы для работы со сложными образцами (получение РНК хорошего качества из эозинофилов всегда проблематично из-за наличия большого количества белков). (например, EDN, член семейства РНКаз) и уменьшить техническую дисперсию (например, nCounter nanoString), чтобы сократить размер выборки. С другой стороны, подходы, основанные на гипотезах (например, проточная цитометрия, RT-qPCR, ELISA), с преимуществами большей достоверности, меньшим риском ошибок типа I (т. результатов. Эти целевые методологии также будут использоваться для подтверждения только клинически значимых (высокий размер эффекта) и значимых (p-значение <0,05) различий, полученных с помощью нецелевых транскриптомных/протеомных подходов.
  • Другим потенциальным ограничением является количество эозинофилов, которое может быть потенциально низким у некоторых пациентов после лечения меполизумабом (50 x 103 или ниже). Таким образом, может потребоваться очистка более 1 или 2 мл крови у этих пациентов, чтобы получить достаточное количество клеток для проведения протеомных и транскриптомных экспериментов. Мы рассмотрели этот вопрос в протоколе исследования и в бюджете проекта.
  • Наконец, TripleTOF — это высокочувствительный масс-спектрометр, предназначенный для более глубокого изучения сложных образцов, таких как протеом эозинофилов. Высокая чувствительность современных масс-спектрометров в сочетании с двумерными схемами наноЖХ позволяет обнаруживать большее количество белков (> 1000) и аналитов в концентрациях в аттомолярном диапазоне (10-18), что достаточно для обнаружения внутриклеточных белков с низким содержанием, таких как хемокины или цитокины. Таким образом, TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 и IL-18 были обнаружены с помощью наноЖХ-МС/МС (Q-TOF), но не другие, такие как IL-5 или IL-13 [69]. ]. Это ожидаемое ограничение связано с присутствием пептидов из белков с высоким содержанием (например, белков гранул эозинофилов), которые подавляют ионизацию пептидов из белков с низким содержанием в приложениях ЖХ-МС/МС. Это приводит к чрезмерному представлению в списке обнаруженных белков распространенных видов, таких как кристаллический белок Шарко-Лейдена (CLC, галектин-10), который все еще представляет интерес для настоящего проекта, поскольку идентифицирует эозинофилы с регуляторными способностями. Однако, чтобы уменьшить сложность образца и улучшить обнаружение белков с низким содержанием, существуют различные методы истощения (например, истощение ACN, ультрафильтрация, 1-DE) и обогащения (например, CPLL), которые мы могли бы использовать для обнаружения. чувствительность. Необязательно целевые подходы, такие как высокомультиплексные иммуноанализы (например, панели Olink Immune Response, Olink Inflammation или Olink Immuno-Oncology; https://www.olink.com/) обладают преимуществом высокой чувствительности обнаружения при небольшом объеме биологических образцов (например, клеточных лизатов), хотя позволяют одновременно измерять только 92 белковых биомаркера.

Тип исследования

Наблюдательный

Регистрация (Оцененный)

30

Контакты и местонахождение

В этом разделе приведены контактные данные лиц, проводящих исследование, и информация о том, где проводится это исследование.

Контакты исследования

Учебное резервное копирование контактов

  • Имя: FRANCISCO-JAVIER SALGADO-CASTRO, PHD
  • Номер телефона: 12263 +34981563100
  • Электронная почта: franciscojavier.salgado@usc.es

Места учебы

      • A Coruña, Испания, 15006
        • Еще не набирают
        • Complexo Hospitalario Universitario A Coruña
        • Контакт:
      • Ourense, Испания, 32005
        • Рекрутинг
        • Complexo Hospitalario Universitario de Ourense
        • Контакт:
    • A Coruña
      • Ferrol, A Coruña, Испания, 15405
        • Рекрутинг
        • Complejo Hospitalario Universitario de Ferrol
        • Контакт:
      • Santiago De Compostela, A Coruña, Испания, 15706
        • Еще не набирают
        • Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela
        • Контакт:
    • Pontevedra
      • Vigo, Pontevedra, Испания, 36211
        • Еще не набирают
        • Hospital Povisa - Grupo Ribera Salud
        • Контакт:

Критерии участия

Исследователи ищут людей, которые соответствуют определенному описанию, называемому критериям приемлемости. Некоторыми примерами этих критериев являются общее состояние здоровья человека или предшествующее лечение.

Критерии приемлемости

Возраст, подходящий для обучения

От 18 лет до 75 лет (Взрослый, Пожилой взрослый)

Принимает здоровых добровольцев

Да

Метод выборки

Невероятностная выборка

Исследуемая популяция

Тяжелая неконтролируемая астма по критериям ERS/ATS Стойкая эозинофилия в крови (>300 клеток/мкл)

Описание

Критерии включения:

  • Диагностика тяжелой неконтролируемой бронхиальной астмы по критериям ERS/ATS
  • Стойкая эозинофилия в крови (>300 клеток/мкл)
  • Частые обострения (≥ двух в год)
  • Подписание информированного согласия и согласие соблюдать все посещения исследования и все процедуры, которые это влечет за собой.

Критерий исключения:

  • Курение в анамнезе: нынешние или бывшие курильщики со стажем курения ≥10 пачек-лет.
  • Клинически значимое заболевание легких, отличное от астмы (например, активная инфекция легких, ХОБЛ, бронхоэктазы, легочный фиброз, кистозный фиброз, синдром гиповентиляции, связанный с ожирением, рак легких, дефицит альфа-1-антитрипсина и первичная цилиарная дискинезия) или когда-либо диагностированные легочные или системные заболевания, кроме астмы, которые связаны с повышенным количеством периферических эозинофилов
  • • Любое расстройство, включая, помимо прочего, сердечно-сосудистое, желудочно-кишечное, печеночное, почечное, неврологическое, скелетно-мышечное, инфекционное, эндокринное, метаболическое, гематологическое, психическое или серьезное физическое нарушение, которое, по мнению исследователя, не является стабильным.
  • Злокачественное новообразование: Текущее злокачественное новообразование или рак в анамнезе в стадии ремиссии.
  • Острые инфекции верхних или нижних дыхательных путей, требующие назначения антибиотиков или противовирусных препаратов в течение 30 дней до визита 1.
  • Ксолар: участники, которые ранее получали омализумаб (Ксолар) или другое моноклональное антитело.
  • Участники, получавшие системные кортикостероиды в течение 30 дней до визита 1 [53].
  • Беременность: Участники, которые беременны или кормят грудью.
  • Ожирение 2 степени или выше (ИМТ ≥ 35 кг/м2)

Учебный план

В этом разделе представлена ​​подробная информация о плане исследования, в том числе о том, как планируется исследование и что оно измеряет.

Как устроено исследование?

Детали дизайна

  • Наблюдательные модели: Кейс-контроль
  • Временные перспективы: Перспективный

Когорты и вмешательства

Группа / когорта
Вмешательство/лечение
Контроль
Здоровые взрослые
Тяжелая эозинофильная астма
Тяжелая неконтролируемая астма по критериям ERS/ATS и персистирующая эозинофилия в крови (>300 клеток/мкл)
Открытие прогностических/прогностических биомаркеров ответа на меполизумаб с использованием проточной цитометрии, транскриптомных и протеомных технологий.

Что измеряет исследование?

Первичные показатели результатов

Мера результата
Мера Описание
Временное ограничение
Измерение изменений поверхностных маркеров эозинофилов и субпопуляций эозинофилов в ответ на лечение меполизумабом с использованием методов проточной цитометрии
Временное ограничение: 32 недели
Анализы проточной цитометрии с мультимаркерными панелями 1 (регуляторные), 2 (активационные) и 3 (подмножества эозинофилов)
32 недели
Измерьте изменения в сывороточных белках средней и низкой концентрации в ответ на лечение меполизумабом с помощью ЖХ-МС/МС.
Временное ограничение: 32 недели
Изменения уровней нескольких белков в низкообильном протеоме сыворотки пациентов, измеренные как отношение к исходному уровню (Т=0) на 4-й и 32-й неделе (SWATH-MS), и отношение к здоровому контролю (Т=0) у пациентов при Т=0.
32 недели

Вторичные показатели результатов

Мера результата
Мера Описание
Временное ограничение
Транскриптомный анализ для выявления мРНК в транскриптоме эозинофилов с повышенным или пониженным уровнем в ответ на лечение меполизумабом.
Временное ограничение: 32 недели
Оценка уровней 770 мРНК, кодирующих белок человека, связанных с рекрутированием, активацией и эффекторными функциями миелоидных клеток, с помощью платформы прямого мультиплексного молекулярного измерения под названием nCounter® NanoString) в сочетании с готовым тестом nCounter® Human Myeloid. Панель врожденного иммунитета (v2)"
32 недели

Соавторы и исследователи

Здесь вы найдете людей и организации, участвующие в этом исследовании.

Соавторы

Следователи

  • Главный следователь: FRANCISCO-JAVIER GONZALEZ-BARCALA, MD, PHD, CLINIC UNIVERSITY HOSPITAL

Публикации и полезные ссылки

Лицо, ответственное за внесение сведений об исследовании, добровольно предоставляет эти публикации. Это может быть что угодно, связанное с исследованием.

Общие публикации

Даты записи исследования

Эти даты отслеживают ход отправки отчетов об исследованиях и сводных результатов на сайт ClinicalTrials.gov. Записи исследований и сообщаемые результаты проверяются Национальной медицинской библиотекой (NLM), чтобы убедиться, что они соответствуют определенным стандартам контроля качества, прежде чем публиковать их на общедоступном веб-сайте.

Изучение основных дат

Начало исследования (Действительный)

1 апреля 2021 г.

Первичное завершение (Оцененный)

31 декабря 2023 г.

Завершение исследования (Оцененный)

1 марта 2025 г.

Даты регистрации исследования

Первый отправленный

18 ноября 2020 г.

Впервые представлено, что соответствует критериям контроля качества

18 ноября 2020 г.

Первый опубликованный (Действительный)

24 ноября 2020 г.

Обновления учебных записей

Последнее опубликованное обновление (Действительный)

25 сентября 2023 г.

Последнее отправленное обновление, отвечающее критериям контроля качества

21 сентября 2023 г.

Последняя проверка

1 сентября 2023 г.

Дополнительная информация

Термины, связанные с этим исследованием

Планирование данных отдельных участников (IPD)

Планируете делиться данными об отдельных участниках (IPD)?

НЕТ

Описание плана IPD

Индивидуальные данные конфиденциальны

Данные исследования/документы

  1. Протокол исследования
    Информационный идентификатор: FGBMEP202001
    Информационные комментарии: Протокол исследования добавлен на сайт Clinicaltrials.gov.

Информация о лекарствах и устройствах, исследовательские документы

Изучает лекарственный продукт, регулируемый FDA США.

Да

Изучает продукт устройства, регулируемый Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США.

Нет

продукт, произведенный в США и экспортированный из США.

Нет

Эта информация была получена непосредственно с веб-сайта clinicaltrials.gov без каких-либо изменений. Если у вас есть запросы на изменение, удаление или обновление сведений об исследовании, обращайтесь по адресу register@clinicaltrials.gov. Как только изменение будет реализовано на clinicaltrials.gov, оно будет автоматически обновлено и на нашем веб-сайте. .

Клинические исследования Меполизумаб 100 мг

Подписаться