Effetto di Mepolizumab sull'asma eosinofilo grave (EMESEA)

Ipotesi

Hº1. I livelli di alcune molecole di superficie sugli eosinofili o la presenza o l'assenza di determinate proteine ​​nel proteoma di questo sottoinsieme di leucociti prima del trattamento con mepolizumab possono essere utilizzati come marcatori predittivi/prognostici di risposta a questo biologico.

Hº2. Mepolizumab altera l'abbondanza di diverse proteine ​​di superficie o intracellulari negli eosinofili come risultato correlato ai cambiamenti nel loro stato di attivazione, capacità migratoria, funzione regolatoria/effettrice o composizione di sottogruppi.

Hº3. Gli asmatici eosinofilici gravi a esordio tardivo hanno aumenti della concentrazione sierica di diversi membri della famiglia IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) e il trattamento con mepolizumab riduce questi livelli e si comporta come un biomarcatore di risposta insieme al numero di eosinofili e riacutizzazioni cliniche.

Obiettivi o domande di ricerca

OB (obiettivo ambizioso): scoperta di biomarcatori predittivi/prognostici di risposta a mepolizumab utilizzando tecnologie di citometria a flusso, trascrittomica e proteomica.

• OB1.- Identificare i cambiamenti nei marcatori di superficie degli eosinofili e delle sottopopolazioni di eosinofili in risposta al trattamento con mepolizumab utilizzando tecniche di citometria a flusso. Questo obiettivo è distribuito nei seguenti deliverable (DE):

  • DE1.1: Selezione di 15 controlli sani
  • DE1.2: Diagnosi di pazienti con asma eosinofilico grave a esordio tardivo e selezione di 15 pazienti che soddisfano i criteri, sono programmati per ricevere mepolizumab e firmano il consenso informato.
  • DE1.3: Generazione del database iniziale per controlli sani e pazienti asmatici con informazioni demografiche, cliniche, ematologiche e biochimiche.
  • DE1.4: Raccolta e trattamento di campioni di siero (1 provetta SST) e di sangue intero (1-2 provette) da donatori sani (T0) e pazienti trattati con mepolizumab (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Saggi di citometria a flusso con pannelli multimarcatore 1 (regolatorio), 2 (attivazione) e 3 (sottoinsiemi di eosinofili) (vedi sotto).
  • DE1.6: Completare il database con i dati clinici, ematologici, biochimici e di citometria a flusso generati ai tempi T4, T16 e T32. Analisi statistica finale uni e multivariata.
  • DE1.7: Pubblicazione dei risultati.

• OB2.- Analisi trascrittomica per identificare gli mRNA all'interno del trascrittoma eosinofilo che mostrano livelli aumentati o ridotti in risposta al trattamento con mepolizumab. Questo obiettivo è distribuito nei seguenti deliverable (DE):

  • DE2.1: impostare un protocollo di isolamento degli eosinofili e controllare la purezza cellulare mediante citometria a flusso.
  • DE2.2: Purificazione degli eosinofili da 15 donatori sani (T0) e 15 pazienti (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Estrazione dell'RNA totale da lisati di eosinofili, analisi della qualità e quantità dell'RNA e conservazione a -80ºC.
  • DE2.4: Approccio basato sulla scoperta/generazione di ipotesi. Valutazione dei livelli di 770 mRNA codificanti proteine ​​umane collegati al reclutamento, attivazione e funzioni effettrici delle cellule mieloidi mediante una piattaforma di misurazione molecolare multiplex diretta denominata nCounter® NanoString) in combinazione con un "nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). A causa dell'elevato costo economico, questa parte dello studio verrà eseguita solo con campioni di eosinofili da donatori sani (T = 0) e due punti temporali nei pazienti (T = 0 e T = 16).
  • DE2.5: Elaborazione dei dati ottenuti e analisi statistica iniziale.
  • DE2.6: Convalida dei dati nCounter® e approccio basato su ipotesi con una tecnica quantitativa consolidata. Eseguire analisi di retrotrascrizione e qPCR di quegli mRNA negli eosinofili che mostrano i maggiori cambiamenti di abbondanza in risposta al trattamento con mepolizumab secondo lo studio nCounter®. Inoltre, verranno analizzati alcuni mRNA aggiuntivi non inclusi nel pannello "nanoString Myeloid Innate Immunity", come FOXP3 (funzione regolatoria), CRLF2, ST2 o IL-7R (recettori delle citochine; attivazione). Il gene HPRT1 sarà utilizzato come gene house-keeping in questa serie di esperimenti di RTqPCR.
  • DE2.7: Analisi statistiche uni e multivariate.
  • DE2.8: Pubblicazione dei risultati trascrittomici.

• OB3.- Profilazione proteomica per identificare proteine ​​con abbondanza differenziale all'interno degli eosinofili in risposta al trattamento con mepolizumab. Questo obiettivo è distribuito nei seguenti deliverable (DE):

  • DE3.1: Lisi degli eosinofili, rimozione del materiale insolubile mediante centrifugazione, quantificazione delle proteine ​​(BCA) e conservazione dei surnatanti cellulari a -80°C.
  • DE3.2: Sviluppare un protocollo di analisi del proteoma totale con un metodo di acquisizione dipendente dai dati (DDA) utilizzando una tecnologia di cromatografia liquida (LC)-MS/MS (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Verificare la variabilità biologica (repliche biologiche) e la tecnica (repliche tecniche) per verificare la riproducibilità dei test.
  • DE3.4: Mantenendo le condizioni standardizzate di LC-MS/MS (TripleTOF), creare una libreria per SWATH (acquisizione sequenziale della finestra di tutti gli spettri di massa teorici) con il maggior numero possibile di proteine ​​eosinofile.
  • DE3.5: eseguire l'analisi SWATH-MS in campioni di 15 donatori sani e 15 pazienti (T0, T4, T16, T32) ("metodo di acquisizione dipendente dalle informazioni" o IDA; "proteomica mirata senza etichetta").
  • DE3.6: Elaborazione dei dati ottenuti e analisi statistica iniziale.
  • DE3.7: Verifica del pannello di biomarcatori ottenuti con una tecnologia diversa (ad es. monitoraggio della reazione selezionata/SRM, ELISA).
  • DE3.8: Analisi statistica finale uni e multivariata. Identificare le proteine ​​con differenze significative tra i gruppi (P <0,05) e almeno un cambiamento di piega ≥ 1,5.
  • DE3.9: Pubblicazione dei risultati proteomici

• OB4. Verificare se gli asmatici eosinofilici gravi a esordio tardivo mostrano livelli elevati di IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS nei campioni di siero, se la risposta di mepolizumab dipende dai livelli di questi marcatori e se il trattamento con questo biologico riduce la concentrazione in siero di questi membri della famiglia IGF. Questo obiettivo è distribuito nei seguenti deliverable (DE):

  • DE4.1: Analisi di IGF-1, IGF-BP3 e IGF-ALS mediante ELISA
  • DE4.2: Analisi statistica uni e multivariata di dati sperimentali
  • DE4.3: Pubblicazione dei risultati

Pubblicazione dei risultati:

Cercheremo di presentare una comunicazione durante il primo anno dello studio in un Congresso respiratorio spagnolo (SEPAR) e nel Congresso respiratorio europeo (ERS) risultante dallo studio dei dati clinici dei pazienti prima e dopo la somministrazione di mepolizumab . Inoltre, prevediamo di pubblicare 3 pubblicazioni su riviste del primo trimestre e altre 2 o 3 comunicazioni congressuali risultanti da studi sperimentali.

Popolazione dello studio La popolazione dello studio includerà controlli sani (ovvero soggetti senza asma, allergie, malattie sistemiche o programmati per interventi chirurgici minori) e pazienti con asma eosinofilo grave a insorgenza tardiva, che saranno reclutati da diverse aree della Galizia (Santiago de Compostela, A Coruña, Lugo, Vigo e Ourense), Spagna. La diagnosi di pazienti con asma eosinofilo grave allo screening si baserà su diversi criteri di inclusione e criteri di esclusione che descriviamo di seguito [12].

Criterio di inclusione:

• Diagnosi di asma grave non controllato secondo i criteri ERS/ATS [52].
• Eosinofilia persistente nel sangue (>300 cellule/μL) in ≥ due occasioni (più di 4 settimane tra ogni misurazione).
• Riacutizzazioni frequenti (≥ due all'anno), definite come un periodo di ≥ 3 giorni di mancanza di controllo dell'asma che richiede un trattamento con corticosteroidi sistemici e/o una visita al pronto soccorso (DE) e/o il ricovero in ospedale.
• Firma del consenso informato e impegno a rispettare tutte le visite dello studio e tutte le procedure che ciò comporta.

Criteri di esclusione:

• Storia del fumo: fumatori attuali o ex fumatori con una storia di fumo di ≥10 pacchetti-anno (numero di pacchetti-anno = (numero di sigarette al giorno/20) x numero di anni fumati). Un ex fumatore è definito come un partecipante che ha smesso di fumare almeno 6 mesi prima della Visita 1.
• Malattie polmonari clinicamente importanti diverse dall'asma (ad es. infezione polmonare attiva, broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), bronchiectasie, fibrosi polmonare, fibrosi cistica, sindrome da ipoventilazione associata a obesità, cancro ai polmoni, deficit di alfa 1 anti-tripsina e discinesia ciliare primaria) o mai stata diagnosticata una malattia polmonare o sistemica , diversi dall'asma, che sono associati a conte elevate di eosinofili periferici (ad es. aspergillosi/micosi broncopolmonare allergica, sindrome di Churg-Strauss, sindrome ipereosinofila).
• Qualsiasi disturbo, incluso, ma non limitato a, cardiovascolare, gastrointestinale, epatico, renale, neurologico, muscoloscheletrico, infettivo, endocrino, metabolico, ematologico, psichiatrico o grave compromissione fisica che non è stabile secondo l'opinione dello Sperimentatore.
• Malignità: un'attuale malignità o una precedente storia di cancro in remissione.
• Infezioni acute delle vie respiratorie superiori o inferiori che richiedono antibiotici o farmaci antivirali entro 30 giorni prima della visita 1.
• Xolair: partecipanti che hanno ricevuto in precedenza omalizumab (Xolair) o un altro anticorpo monoclonale.
• Partecipanti che hanno ricevuto corticosteroidi sistemici entro 30 giorni prima della Visita 1 [53].
• Gravidanza: partecipanti in gravidanza o allattamento.
• Classe di obesità 2 o superiore (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Misura di prova

• Coorte di controlli sani (n=15) solo per analisi a T = 0.

• Coorte di n=15 soggetti con asma eosinofilo grave che iniziano con la terapia con mepolizumab senza modifiche ai farmaci attualmente prescritti. Visite di studio di follow-up a 4 (T4), 16 (T16) e 32 (T32) settimane dopo la visita di studio originale (T=0).

  • La motivazione per la dimensione del campione è spiegata nella sezione statistica.

Tasso di arruolamento previsto Poiché questo sarà uno studio multicentrico, ci aspettiamo di raggiungere un tasso di arruolamento di almeno 2 asmatici eosinofilici gravi che iniziano con la terapia con mepolizumab al mese (4 settimane) in ciascun ospedale (totale = 8 al mese). Ciò significa che i 15 soggetti dovrebbero essere programmati per ricevere mepolizumab durante le prime 36 settimane di questo studio, avendo tempo sufficiente per completare lo studio in 72 settimane (1,5 anni). Ci aspettiamo inoltre che almeno il 90% dei soggetti completi questo studio.

Data stimata di inizio dello studio: dicembre 2020 Data stimata di completamento dello studio: 1,5 anni (72 settimane)

Disegno e metodi dello studio

Figura 2. Disegno dello studio. Questa figura rappresenta in modo schematico sia la parte clinica che quella sperimentale dello studio.

Questo è uno studio osservazionale, longitudinale, prospettico e multicentrico per valutare sia la risposta precoce (4 settimane) che la risposta tardiva (16 e 32 settimane) alla terapia con mepolizumab negli asmatici gravi eosinofili. Lo studio sarà diretto dal Dr. Francisco Javier González Barcala (Servizio di Pneumologia presso CHUS). Il dottor Barcala è stato coordinatore nazionale in uno studio clinico, nonché ricercatore principale e sub-ricercatore in 41 e 19 studi clinici, rispettivamente. Inoltre, il Dr. Barcala è stato ricercatore principale di 7 progetti di ricerca, collaboratore in altri 7 progetti e ha pubblicato più di 120 pubblicazioni rilevanti (peer-reviewed e JCR-indexed) nel campo delle malattie respiratorie, principalmente l'asma.

Lo studio coinvolge anche altri membri dell'Unità Multidisciplinare per l'Asma (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dott. Juan José Nieto Fontarigo). In particolare, il Project Manager Dr. Salgado è stato coinvolto in 11 progetti di ricerca, ha 28 articoli di ricerca in riviste ad alto impatto appartenenti ai campi di Immunologia, Biochimica, Proteomica e Malattie Respiratorie. Inoltre, gli altri partecipanti a questo progetto hanno una vasta esperienza nei rispettivi campi, sia nella ricerca di base che in quella traslazionale. Loro sono Dra. Marina Blanco Aparicio, responsabile dell'Unità di Asma del Complesso Ospedaliero Universitario di A Coruña (CHUAC), il Dott. Uxío Calvo, del Complesso Ospedaliero Universitario di Ferrol (CHUF) e Coral González del Complesso Ospedaliero Universitario di Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro dell'Ospedale Alvaro Cunqueiro di Vigo; Dolores Corbacho all'Ospedale Povisa-Vigo . Sarà necessario assumere un ricercatore in fase predottorale per 12 mesi per eseguire la preparazione del campione negli studi di trascrittomica e proteomica, nonché i test RTqPCR, citometria a flusso e ELISA. Questo ricercatore sarà sotto la supervisione del Dr. Francisco Javier Salgado Castro e del Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Unità multidisciplinare per l'asma, CHUS). Gli esperimenti di proteomica saranno condotti da Dra. Susana Belén Bravo López e María García Vence, che lavorano alla Piattaforma Proteomica della Fondazione di Ricerca Sanitaria di Santiago de Compostela (FIDIS). L'analisi nCounter® sarà effettuata attraverso un servizio offerto dal gruppo GENVIP (Gruppo di genetica, vaccini e infezioni in pediatria; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Il progetto di ricerca sarà minimamente invasivo (ad esempio, nessun esame broncoscopico) ma il protocollo deve essere rivisto e approvato dal Comitato etico della ricerca clinica della Galizia, in Spagna. In questo studio verranno arruolati solo quindici pazienti che soddisfano i criteri per la diagnosi di asma grave a insorgenza tardiva, che riceveranno mepolizumab e firmeranno il consenso informato. Lo stesso protocollo sarà seguito dai diversi team clinici. Le variabili demografiche, cliniche, ematologiche e biochimiche saranno incluse in un database. Per verificare la sensibilizzazione allergica verrà utilizzato il prick test cutaneo per gli allergeni comuni e la presenza di IgE allergene-specifiche (ImmunoCAP, Thermo Fisher). Verranno inoltre analizzati i parametri di funzionalità polmonare (volume espiratorio forzato nel 1° secondo (FEV1), capacità vitale forzata (FVC) e rapporto FEV1/FVC). La spirometria verrà eseguita prima e dopo l'uso di un broncodilatatore. Verranno eseguiti il ​​​​test di controllo dell'asma (ACT) e il questionario Asthma Quality of Life (AQLQ). Gli asmatici devono trovarsi in una fase stabile della malattia (es. assenza di riacutizzazioni per almeno 4 settimane prima del prelievo del campione). Le riacutizzazioni saranno gestite secondo le linee guida cliniche standard. I pazienti (n=15) riceveranno 100 mg di iniezione sottocutanea di mepolizumab a intervalli di 4 settimane e campioni di sangue e siero (2-3 provette EDTA; 1 provetta SST) verranno prelevati a T=0, 4, 16 e 32 settimane, al fine di valutare sia la risposta precoce (4 settimane) che la risposta tardiva (16 e 32 settimane) al trattamento.

Metodi

• Provette: EDTA (sangue completo) e SST (siero)

• Purificazione degli eosinofili

  • Gli eosinofili possono essere isolati dal sangue intero (provette con eparina) utilizzando il Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (catalogo n. 130-104-466) o il EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (catalogo n. 17956), entrambe procedure di selezione negativa che producono sottoinsiemi intatti di questi leucociti. Ci aspettiamo almeno intorno a 1.0-4.0 x 106 cellule da ∼20 ml di sangue, ma anche elevata vitalità e purezza (>95%).

• Studi ELISA.

  • Raccolta di campioni di siero: misurazione di IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 well), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, catalogo #DY291) e IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, catalogo #DY675) mediante ELISA.

• Purificazione totale dell'RNA da eosinofili e analisi nCounter nanoString (approccio basato sulla scoperta/generazione di ipotesi):

  • Eosinofili purificati da controlli sani (T=0) e pazienti (T=0, 4, 16 e 32 settimane) saranno conservati a -80ºC in soluzione RNAlater (Ambion, Paisley, UK). L'RNA totale sarà isolato mediante un kit RNeasy Mini (Qiagen) e conservato a -80ºC dopo aver verificato la qualità e la concentrazione dell'RNA (Nanodrop).
  • La piattaforma nCounter® (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) è una metodologia multiplex che consente la quantificazione di un massimo di 800 target di RNA, DNA o proteine. Per quanto riguarda le molecole di mRNA, questa tecnologia si basa sull'ibridazione in soluzione di ogni mRNA a due oligonucleotidi complementari: una sonda biotinilata specifica per l'mRNA e un oligonucleotide specifico per l'mRNA contenente una combinazione sequenziale di sei fluorocromi (quattro diversi colori) che creano una luce fluorescente codice a barre che identifica lo specifico mRNA rilevato. Una volta rimosso l'eccesso di entrambe le sonde, i complessi ibridati vengono catturati attraverso un'interazione biotina-streptavidina e allineati sulla cartuccia in modo che lo strumento nCounter possa leggere quei "codici a barre". Per eseguire questi passaggi, la piattaforma nCounter è composta da due strumenti, la Prep Station, che esegue la purificazione dei complessi ibridati e la loro immobilizzazione sulla superficie di una cartuccia, e il Digital Analyzer (DA), uno scanner che identifica e conta i codici a barre catturati per ogni campione. Questa analisi quantitativa Pertanto, ciascun miRNA può essere quantificato individualmente (quantificazione assoluta; conteggi) da campioni difficili (ad esempio, eosinofili) senza necessità di altri requisiti come la conversione mRNA-cDNA (RT) o l'amplificazione del DNA (qPCR), portando minore variabilità dei dati (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Inoltre, la quantità di materiale di input è bassa (25 ng-300 ng mRNA) e può essere derivata da RNA derivato da FFPE, RNA totale, RNA frammentato, lisati cellulari e cellule selezionate. Successivamente, i dati nCounter verranno normalizzati, il rumore di fondo sottratto e un'ulteriore correzione eseguita per tenere conto dell'efficienza dell'estrazione (calcolata in base all'espressione dei miRNA spike-in che verranno aggiunti al campione in una quantità definita prima dell'estrazione del miRNA ). Le normalizzazioni verranno eseguite utilizzando il pacchetto R NanoStringNorm. Dopo la normalizzazione, verrà effettuata una trasformazione log2 dei dati e successivamente analizzati mediante il pacchetto LIMMA Bioconductor per identificare quegli mRNA che mostrano un'abbondanza differenziale dopo il trattamento con mepolizumab. Questa analisi non richiederà più di 24 ore.

• Studi RTqPCR (approccio basato sull'ipotesi):

  • Per analizzare i livelli di mRNA che codificano per le proteine ​​correlate con l'attivazione degli eosinofili mediata da allarmina (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) e con la funzione regolatoria degli eosinofili (FOXP3) da pazienti trattati con mepolizumab, l'RNA totale sarà trascritto nel cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) e conservato a -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) sarà eseguito in uno strumento LightCycler® 96 (Roche Life Science) e utilizzato per analizzare l'espressione di FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R e il gene HPRT1 (controllo endogeno).

• Studi di citometria a flusso (approccio basato su ipotesi):

  • Campioni di sangue periferico trattati con EDTA da controlli sani (n=15; T0) e pazienti trattati con mepolizumab (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Etichettare 100 μL/provetta di sangue periferico intero (EDTA) con anticorpi di controllo (BD) specifici e corrispondenti all'isotipo. Lisi dei globuli rossi con FACSlyse (BD). Analisi con un citometro a flusso FACSCalibur (BD). Utilizzare FSC/SSC per selezionare i granulociti; quindi SSC vs CCR3 (FITC) per separare gli eosinofili dai neutrofili. Eosinofili di gate:

    • Pannello multimarcatore 1 (proteine ​​regolatrici negli eosinofili): misurazione di CD16 e galectine-1/10 [41-44].
    • Pannello multimarker 2 (recettori di attivazione negli eosinofili): misurazione di CD48 (ridotto negli eosinofili totali con asma moderato-grave rispetto ai controlli sani (HC) [i nostri studi, 54]), CD44 e CD11b.
    • Pannello multimarcatore 3 (sottoinsiemi di eosinofili): analisi dei sottoinsiemi basata sull'espressione di Siglec-8, CD62L (L-selectina) e IL-5Rα [40].

• Analisi del proteoma eosinofilo (approccio basato sulla scoperta/generazione di ipotesi):

  • Saranno necessarie fino a 50 x 103 cellule per eseguire saggi proteomici. Ci aspettiamo circa 50-400 x 103 cellule da ∼1 mL di sangue.
  • Gli eosinofili isolati (50 x 103 cellule) saranno raccolti mediante centrifugazione, lavati e risospesi in tampone di lisi con inibitori della proteinasi. Successivamente, il materiale insolubile sarà rimosso mediante centrifugazione ei surnatanti cellulari conservati a -80°C.
  • Per gli eosinofili la caratterizzazione del proteoma totale sarà effettuata dopo digestione con tripsina utilizzando un metodo DDA in un sistema LC-MSMS. Per questo approccio utilizzeremo campioni di 15 donatori sani e 15 pazienti (T0, T4, T16, T32). Le proteine ​​selezionate saranno solo quelle che hanno riportato un tasso globale di false scoperte (FDR) dell'1% o superiore [55, 56].
  • Verranno utilizzati i "pool" proteici dei 5 gruppi di studio (donatori sani e pazienti ai tempi T0, T4, T16 e T32 dopo il trattamento), dividendoli (1-DE) in 5-6 bande, estraendo le proteine ​​da ciascuna banda, generando i peptidi corrispondenti e analizzandoli tramite MS/MS per produrre una libreria per SWATH con un elevato numero di proteine, su cui poi verrà effettuata la quantificazione. Una volta realizzata la libreria e mantenendo le condizioni standardizzate di LC-MS/MS (TripleTOF), eseguiremo un'analisi SWATH-MS (metodo "information-dependent acquisition" o IDA; "Targeted label-free proteomics") in campioni provenienti da 15 donatori sani e 15 pazienti (T0, T4, T16, T32). Questo saggio ci permetterà di identificare le proteine ​​con differenze significative tra i gruppi di studio. Le proteine ​​selezionate saranno solo quelle con P<0.05 e fold change ≥1.5 [56-59].

Endpoint dello studio:

I dati demografici per tutti gli individui arruolati nello studio saranno ottenuti al basale. Inoltre, verranno raccolti diversi dati, tra cui anamnesi di asma, parametri di funzionalità polmonare, test cutaneo, IgE allergene-specifiche, punteggio AQLQ, punteggio ACT, numero di riacutizzazioni e consumo di prednisone. Durante le successive visite al servizio di Pneumologia al T0, 4, 16 e 32, verranno seguiti i pazienti trattati con mepolizumab. Ciò include misurazioni della funzione polmonare (FEV1, FEV1/FVC), parametri biochimici ed ematologici.

Saranno raccolti campioni di sangue periferico e siero, e gli eosinofili saranno purificati magneticamente, a T0, T4, T16 e T32, e verranno eseguite citometria a flusso, RTqPCR e analisi proteomiche, nonché immunodosaggi. Tutte le variabili sperimentali (es. abbondanza di proteine ​​eosinofile nei saggi proteomici, marcatori di attivazione degli eosinofili, …) saranno correlate con parametri clinici (es. funzione polmonare, controllo dell'asma, numero di riacutizzazioni) al fine di valutare l'associazione di queste variabili con la risposta al trattamento. Prenderemo in considerazione una risposta favorevole a mepolizumab se viene soddisfatto uno dei seguenti criteri:

• Per ottenere un adeguato controllo dell'asma ACT ≥20 [60], o/ una variazione di ≥3 punti che rappresenta una differenza minimamente importante.
• Raggiungere una riduzione del tasso annuo di riacutizzazioni del 48%. L'esacerbazione è definita come l'aumento dei sintomi che richiedono un trattamento con corticosteroidi sistemici per ≥3, o una visita medica non programmata, simile a quella riflessa negli studi clinici con mepolizumab [20, 61].
• Ottenere una riduzione del 50% del tasso annuo di ricoveri ospedalieri a causa di esacerbazione dell'asma, simile a quella riflessa negli studi clinici [62].
• Per ottenere una riduzione della dose media annua di corticosteroidi sistemici del 50% [63].

• Studiare gli endpoint primari:

  • Livelli di IGF-1, IGF-BP3 e IGF-ALS nel siero
  • Dati di espressione trascrittomica (nanoString)/mRNA: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Dati proteomici
  • Dati di citometria a flusso: espressione di CD16, galectins-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L e IL-5Rα

• Studiare gli endpoint secondari:

  • Parametri di funzionalità polmonare (FEV1, FEV1/FVC)
  • Parametri ematologici (ad esempio, numero di eosinofili).
  • Altre variabili cliniche e biochimiche (ad es. IgE o altre immunoglobuline).
  • Numero di riacutizzazioni, consumo di prednisone, punteggio ACT, punteggio AQLQ.

Piano statistico o analisi dei dati:

Graph Pad Prism verrà utilizzato per creare grafica. IBM SPSS, Statistics 22.0 o R. verrà utilizzato per lo studio statistico. Durante le analisi saremo assistiti dall'area Statistica e Ricerca Operativa dell'USC (Dr. Rosa Maria Crujeiras Casais).

Dimensione del campione Il calcolo della dimensione del campione (N) è stato effettuato utilizzando G*Power 3.1.9.4 [64]. Durante queste analisi calcoliamo N necessario ottenere significatività statistica in un test F (ANOVA: misure ripetute, entro fattori), dati α (0,05), potenza (1-β, 0,95), il numero di misurazioni (T0, T4, T16 e T32) e la dimensione dell'effetto (f = 0,4; dimensione dell'effetto grande, che fornisce risultati clinicamente più rilevanti). L'output N era 15, con un F critico = 2,82705.

Per dati clinici, di citometria a flusso e trascrittomici. Confronti trasversali tra HC e pazienti in T0 (prima del trattamento) seguendo una distribuzione normale e con omogeneità di varianze saranno effettuati utilizzando il t-test. Per le variabili distribuite non normali, useremo il test U di Mann-Whitney. I cambiamenti nelle diverse variabili dello studio in risposta al trattamento con mepolizumab (studio longitudinale; T0, T4, T16 e T32) saranno testati utilizzando RM-ANOVA. L'analisi multivariata (ad es. PCA, clustering non supervisionato) e l'analisi di arricchimento funzionale saranno eseguite con citometria a flusso e, soprattutto, dati trascrittomici.

Per la caratterizzazione del proteoma totale e l'analisi SWATH quantitativa useremo il software ProteinPilotTM 5.0.1 di ABSciex che ha l'algoritmo ParagonTM per la ricerca nel database e ProgroupTM per il raggruppamento dei dati. I dati verranno ricercati utilizzando un database Uniprot specifico per Human. Il tasso di false scoperte verrà eseguito utilizzando un metodo di adattamento non lineare che mostra solo quei risultati che hanno riportato un tasso globale di false scoperte dell'1% o migliore [65].

L'analisi funzionale sarà eseguita da diversi software ad accesso aperto. FunRich (strumento di analisi dell'arricchimento funzionale) per l'arricchimento funzionale e l'analisi della rete di interazione (http://funrich.org/index.html). Per le statistiche, FunRich utilizza il test ipergeometrico, BH e Bonferroni [66, 67]. Useremo DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) o GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) per l'arricchimento dell'ontologia genica e per l'interazione proteina-proteina, rete costruzione e clustering, useremo String (https://string-db.org/) o Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

Per i dati SWATH, il software MarkerView ci fornirà un'analisi statistica multivariata utilizzando l'analisi dei componenti principali (PCA) per confrontare i dati tra i campioni. L'area di picco MS media di ciascuna proteina sarà derivata dai replicati di SWATH-MS di ciascun campione seguita dall'analisi t-test di Student utilizzando il software MarkerView per il confronto tra i campioni in base alle somme dell'area media di tutte le transizioni derivate per ogni proteina. Il test t indicherà quanto bene ciascuna variabile distingue i due gruppi, riportati come valore P. Per la libreria, sarà selezionato il suo insieme di proteine ​​differenzialmente abbondanti (p-value <0.05) con proteine ​​up-regolate o down-regolate di 1.5.

Limitazioni

• Come precedentemente commentato, 15 soggetti riceveranno mepolizumab durante la prima metà dello studio (36 settimane). Ci aspettiamo che almeno il 90% dei soggetti completi questo studio. Tuttavia, gli abbandoni dei pazienti e la non aderenza (o non conformità) sono eventi comuni negli studi clinici. In tal caso, la dimensione del campione verrà gonfiata proporzionalmente.
• Il presente progetto è stato proposto come studio della scoperta di biomarcatori molecolari in risposta al mepolizumab. Questo tipo di studi può essere effettuato tramite approcci mirati/basati su ipotesi o più ampi/non mirati (tecnologie "-omiche"). Siamo consapevoli che potrebbe essere difficile trovare marcatori predittivi in ​​questo piccolo studio prospettico/prova di concetto. Nel presente progetto proponiamo un duplice approccio per minimizzare questo rischio. Da un lato, metodologie moderne e non mirate per funzionare e altamente sensibili per rilevare proteine ​​poco abbondanti (SWATH MS) o protocolli semplificati per lavorare con campioni difficili (la generazione di RNA di buona qualità dagli eosinofili è sempre impegnativa a causa della presenza di proteine ​​abbondanti come EDN, un membro della famiglia RNase) e ridurre la varianza tecnica (ad esempio, nCounter nanoString) per accorciare le dimensioni del campione. D'altra parte, approcci basati su ipotesi (ad es. Citometria a flusso, RT-qPCR, ELISA), con i vantaggi di una maggiore credibilità, minor rischio di errori di tipo I (cioè falsa scoperta) e II e facile replicabilità futura dei risultati. Queste metodologie mirate saranno utilizzate anche per confermare solo le differenze clinicamente rilevanti (grande dimensione dell'effetto) e significative (p-value <0.05) ottenute con approcci trascrittomici/proteomici non mirati.
• Un'altra potenziale limitazione è il numero di eosinofili, che potrebbe essere potenzialmente basso in alcuni pazienti dopo il trattamento con mepolizumab (50 x 103 o inferiore). Pertanto, potrebbe essere necessario purificare più di 1 o 2 ml di sangue in quei pazienti per ottenere abbastanza cellule per eseguire gli esperimenti di proteomica e trascrittomica. Abbiamo considerato questo problema nel protocollo di studio e nel budget del progetto.
• Infine, il TripleTOF è uno spettrometro di massa altamente sensibile progettato per scavare più a fondo in campioni complessi come il proteoma degli eosinofili. L'elevata sensibilità degli attuali spettrometri di massa combinata con schemi bidimensionali di nanoLC consente il rilevamento di un numero maggiore di proteine ​​(> 1000) e analiti a concentrazioni nell'intervallo attomolare (10-18), sufficienti per rilevare proteine ​​intracellulari poco abbondanti come chemochine o citochine. Pertanto, TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 e IL-18 sono stati rilevati da nanoLC-MS/MS (Q-TOF), ma non altri come IL-5 o IL-13 [69 ]. Questa limitazione prevista è dovuta alla presenza di peptidi da proteine ​​​​molto abbondanti (ad esempio, proteine ​​​​dei granuli eosinofili) che sopprimono la ionizzazione dei peptidi da proteine ​​​​poco abbondanti nelle applicazioni LC-MS/MS. Ciò porta alla sovrarappresentazione nell'elenco delle proteine ​​rilevate di specie abbondanti come la proteina di cristallo di Charcot-Leyden (CLC, galectin-10), che è ancora interessante per il presente progetto in quanto identifica gli eosinofili con capacità regolatorie. Tuttavia, al fine di ridurre la complessità del campione e migliorare il rilevamento di proteine ​​​​a bassa abbondanza, esistono diversi metodi di deplezione (ad es. ACN-deplezione, ultrafiltrazione, 1-DE) e di arricchimento (ad es. CPLL) che potremmo utilizzare per ottenere il rilevamento sensibilità. Facoltativamente, approcci mirati come saggi immunologici ad alto multiplex (ad esempio, i pannelli Olink Immune Response, Olink Inflammation o Olink Immuno-Oncology; https://www.olink.com/) hanno il vantaggio di un'elevata sensibilità di rilevamento con un basso volume di campioni biologici (ad esempio, lisati cellulari), anche se consente solo la misurazione di 92 biomarcatori proteici contemporaneamente.