Mepolitsumabin vaikutus vaikeaan eosinofiiliseen astmaan (EMESEA)

Hypoteesit

Hº1. Tiettyjen eosinofiilien pintamolekyylien tasoja tai tiettyjen proteiinien läsnäoloa tai puuttumista tämän leukosyyttialaryhmän proteomissa ennen mepolitsumabihoitoa voidaan käyttää ennustavina/ennustemarkkereina vasteen tälle biologiselle aineelle.

Hº2. Mepolitsumabi muuttaa useiden pinta- tai solunsisäisten proteiinien runsautta eosinofiileissä, mikä johtuu niiden aktivaatiostatuksen, migraatiokyvyn, säätely-/efektoritoiminnon tai alaryhmän koostumuksen muutoksista.

Hº3. Myöhään alkavilla vaikeilla eosinofiilisillä astmaatikoilla on kohonneita seerumipitoisuuksia IGF-perheen eri jäsenillä (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS), ja mepolitsumabihoito alentaa näitä tasoja ja toimii vaste-biomarkkerina yhdessä infektioiden määrän kanssa. eosinofiilit ja kliiniset pahenemisvaiheet.

Tavoitteet tai tutkimuskysymykset

OB (Aspirational tavoite): Mepolitsumabivasteen ennustavien/ennusteisten biomarkkerien löytäminen virtaussytometriaa, transkriptiomista ja proteomista tekniikoita käyttäen.

• OB1. - Tunnistaa muutokset eosinofiilien ja eosinofiilien alapopulaatioiden pintamarkkereissa vasteena mepolitsumabihoitoon käyttämällä virtaussytometriatekniikoita. Tämä tavoite on jaettu seuraaviin suoritteisiin (DE):

  • DE1.1: 15 terveen kontrollin valinta
  • DE1.2: Myöhään alkaneiden vaikean eosinofiilisen astman potilaiden diagnoosi ja 15 kriteerit täyttävän potilaan valinta on määrä saada mepolitsumabia ja allekirjoittaa tietoinen suostumus.
  • DE1.3: Alkuperäisen tietokannan luominen terveille kontrolleille ja astmapotilaille demografisista, kliinisistä, hematologisista ja biokemiallisista tiedoista.
  • DE1.4: Seerumin (1 SST-putki) ja kokoverinäytteiden (1-2 putkea) kerääminen ja käsittely terveiltä luovuttajilta (T0) ja mepolitsumabilla hoidetuilta potilailta (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Virtaussytometriset määritykset monimerkkipaneeleilla 1 (säätely), 2 (aktivointi) ja 3 (eosinofiilien alajoukot) (katso alla).
  • DE1.6: Täydennä tietokanta kliinisillä, hematologisilla, biokemiallisilla ja virtaussytometriatiedoilla, jotka on luotu ajankohtina T4, T16 ja T32. Lopullinen yksi- ja monimuuttujien tilastollinen analyysi.
  • DE1.7: Tulosten julkaiseminen.

• OB2. - Transkriptominen analyysi mRNA:iden tunnistamiseksi eosinofiilien transkriptomissa, joilla on lisääntynyt tai alentunut taso vasteena mepolitsumabihoitoon. Tämä tavoite on jaettu seuraaviin suoritteisiin (DE):

  • DE2.1: Aseta eosinofiilien eristysprotokolla ja tarkista solujen puhtaus virtaussytometrillä.
  • DE2.2: Eosinofiilien puhdistus 15 terveeltä luovuttajalta (T0) ja 15 potilaalta (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: RNA:n kokonaisuutto eosinofiililysaateista, RNA:n laadun ja määrän määritys ja varastointi -80 ºC:ssa.
  • DE2.4: Löytöihin perustuva/hypoteesia luova lähestymistapa. 770 ihmisen proteiinia koodaavan mRNA:n tasojen arviointi, jotka liittyvät myeloidisolujen rekrytointiin, aktivointiin ja efektoritoimintoihin suoran multipleksoidun molekyylimittausalustan avulla nimeltä nCounter® NanoString) yhdistettynä valmiiksi valmistetun "nCounter® Human Myeloidin" kanssa Inte Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Korkeiden taloudellisten kustannusten vuoksi tämä osa tutkimuksesta suoritetaan vain terveiltä luovuttajilta peräisin olevilla eosinofiilinäytteillä (T = 0) ja kahdella aikapisteellä potilailla (T = 0 ja T = 16).
  • DE2.5: Saatujen tietojen käsittely ja alustava tilastollinen analyysi.
  • DE2.6: nCounter®-tietojen validointi ja hypoteesilähtöinen lähestymistapa vakiintuneella kvantitatiivisella tekniikalla. Suorita retrotranskriptio- ja qPCR-analyysit niille mRNA:ille eosinofiileissä, joissa esiintyy suurimmat runsausmuutokset vasteena mepolitsumabihoitoon nCounter®-tutkimuksen mukaan. Lisäksi analysoidaan joitain muita mRNA:ita, jotka eivät sisälly "nanoString Myeloid Inte Immunity" -paneeliin, kuten FOXP3 (säätelytoiminto), CRLF2, ST2 tai IL-7R (sytokiinireseptorit; aktivaatio). HPRT1-geeniä käytetään talonpitogeeninä tässä RTqPCR-koesarjassa.
  • DE2.7: Yksi- ja monimuuttujan tilastolliset analyysit.
  • DE2.8: Transkriptomisten tulosten julkaiseminen.

• OB3. – Proteominen profilointi sellaisten proteiinien tunnistamiseksi, joiden eosinofiilien sisällä on erilaista runsautta vasteena mepolitsumabihoitoon. Tämä tavoite on jaettu seuraaviin suoritteisiin (DE):

  • DE3.1: Eosinofiilien hajoaminen, liukenemattoman materiaalin poistaminen sentrifugoimalla, proteiinien kvantifiointi (BCA) ja solusupernatanttien varastointi -80 °C:ssa.
  • DE3.2: Kehitä kokonaisproteomianalyysiprotokolla Data Dependent Acquisition (DDA) -menetelmällä käyttämällä nestekromatografiaa (LC)-MS/MS-tekniikkaa (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Tarkista biologinen vaihtelu (biologiset replikaatiot) ja tekniikka (tekniset jäljennökset) testien toistettavuuden tarkistamiseksi.
  • DE3.4: Säilyttämällä LC-MS/MS:n (TripleTOF) standardoidut olosuhteet, luo SWATH-kirjasto (kaikkien teoreettisten massaspektrien peräkkäinen ikkunankeruu) mahdollisimman monella eosinofiiliproteiinilla.
  • DE3.5: Suorita SWATH-MS-analyysi näytteistä 15 terveeltä luovuttajalta ja 15 potilaalta (T0, T4, T16, T32) ("tiedosta riippuvainen hankinta" eli IDA; "Targeted label-free proteomiikka").
  • DE3.6: Saatujen tietojen käsittely ja alustava tilastollinen analyysi.
  • DE3.7: Tarkastetaan eri tekniikalla saatujen biomarkkerien paneeli (esim. valikoidun reaktion seuranta / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Lopullinen yksi- ja monimuuttujien tilastollinen analyysi. Tunnista proteiinit, joissa on merkittäviä eroja ryhmien välillä (P < 0,05) ja joiden muutos on vähintään ≥ 1,5.
  • DE3.9: Proteomisten tulosten julkaiseminen

• OB4. Tarkista, onko myöhään alkaneilla vaikeilla eosinofiilisillä astmaatikoilla kohonneita IGF-1-, IGF-BP3- ja IGF-ALS-pitoisuuksia seeruminäytteissä, jos mepolitsumabin vaste riippuu näiden merkkiaineiden tasoista ja vähentääkö hoito tällä biologisella aineella pitoisuutta näiden IGF-perheen jäsenten seerumi. Tämä tavoite on jaettu seuraaviin suoritteisiin (DE):

  • DE4.1: IGF-1:n, IGF-BP3:n ja IGF-ALS:n analyysi ELISA:lla
  • DE4.2: Yksi- ja monimuuttuja kokeellisten tietojen tilastollinen analyysi
  • DE4.3: Tulosten julkaiseminen

Tulosten julkaisu:

Pyrimme esittämään tutkimuksen ensimmäisenä vuonna Espanjan hengitystiekongressissa (SEPAR) sekä European Respiratory Congressissa (ERS) tiedonannon, joka perustuu potilaiden kliinisten tietojen tutkimukseen ennen mepolitsumabin antoa ja sen jälkeen. . Lisäksi odotamme julkaisevamme 3 julkaisua Q1-lehdissä sekä 2 tai 3 muuta kokeellisista tutkimuksista saatua kongressiviestintää.

Tutkimuspopulaatio Tutkimuspopulaatio sisältää terveet kontrollit (eli henkilöt, joilla ei ole astmaa, allergiaa, systeemisiä sairauksia tai joille on määrä tehdä pieniä leikkauksia) ja myöhään alkavia vaikeaa eosinofiilistä astmaa sairastavia potilaita, jotka rekrytoidaan Galician eri alueilta (Santiago de Compostela, A.) Coruña, Lugo, Vigo ja Ourense), Espanja. Vakavan eosinofiilisen astman potilaiden diagnoosi seulonnassa perustuu useisiin sisällyttämis- ja poissulkemiskriteereihin, jotka kuvataan alla [12].

Sisällyttämiskriteerit:

• Vaikean hallitsemattoman astman diagnoosi ERS/ATS-kriteerien mukaan [52].
• Pysyvä eosinofilia veressä (>300 solua/μl) vähintään kahdesti (yli 4 viikkoa kunkin mittauksen välillä).
• Toistuvat pahenemisvaiheet (≥ kaksi vuodessa), jotka määritellään ≥ 3 päivän ajan, jolloin astma ei ole hallinnassa ja vaatii hoitoa systeemisillä kortikosteroideilla ja/tai päivystyskäyntiä ja/tai sairaalahoitoa.
• Allekirjoita tietoinen suostumus ja suostuu noudattamaan kaikkia tutkimuskäyntejä ja kaikkia tähän liittyviä menettelyjä.

Poissulkemiskriteerit:

• Tupakointihistoria: Nykyiset tupakoitsijat tai entiset tupakoitsijat, joiden tupakointihistoria on ≥10 ask-vuotta (askkivuosien lukumäärä = (savukkeiden määrä päivässä/20) x poltettujen vuosien lukumäärä). Entinen tupakoitsija määritellään osallistujaksi, joka lopetti tupakoinnin vähintään 6 kuukautta ennen vierailua 1.
• Kliinisesti tärkeä muu keuhkosairaus kuin astma (esim. aktiivinen keuhkosairaus, krooninen obstruktiivinen keuhkosairaus (COPD), keuhkoputkentulehdus, keuhkofibroosi, kystinen fibroosi, liikalihavuuteen liittyvä hypoventilaatio-oireyhtymä, keuhkosyöpä, alfa 1 -antitrypsiinin puutos ja primaarinen keuhkodyskinesia) tai joilla on koskaan diagnosoitu keuhkosairaus tai systeeminen sairaus muut kuin astma, joihin liittyy kohonnut perifeerinen eosinofiilimäärä (esim. allerginen bronkopulmonaalinen aspergilloosi/mykoosi, Churg-Straussin oireyhtymä, hypereosinofiilinen oireyhtymä).
• Mikä tahansa häiriö, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, sydän- ja verisuoni-, maha-suolikanavan, maksan, munuaisten, neurologiset, tuki- ja liikuntaelinten, infektio-, endokriiniset, metaboliset, hematologiset, psykiatriset tai merkittävät fyysiset häiriöt, jotka eivät ole tutkijan mielestä stabiileja.
• Pahanlaatuisuus: Nykyinen pahanlaatuinen syöpä tai aikaisempi syöpä remissiossa.
• Akuutit ylä- tai alahengitystieinfektiot, jotka vaativat antibiootteja tai viruslääkitystä 30 päivän sisällä ennen käyntiä 1.
• Xolair: Osallistujat, jotka ovat saaneet omalitsumabia (Xolair) tai muuta monoklonaalista vasta-ainetta aiemmin.
• Osallistujat, jotka ovat saaneet systeemisiä kortikosteroideja 30 päivän sisällä ennen käyntiä 1 [53].
• Raskaus: Osallistujat, jotka ovat raskaana tai imettävät.
• Lihavuusluokka 2 tai korkeampi (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Otoskoko

• Terveiden kontrollien kohortti (n = 15) vain analyysiin, kun T = 0.

• Kohortti n = 15 henkilöä, joilla on vaikea eosinofiilinen astma ja jotka aloittavat mepolitsumabihoidolla ilman muutoksia tällä hetkellä määrättyihin lääkkeisiin. Seurantatutkimuskäynnit 4 (T4), 16 (T16) ja 32 (T32) viikkoa alkuperäisen opintokäynnin jälkeen (T=0).

  • Otoskoon perusteet selitetään tilastoosiossa.

Odotettu ilmoittautumisaste Koska tämä on monikeskustutkimus, odotamme saavuttavamme vähintään 2 vakavaa eosinofiilistä astmaatikota aloittaen mepolitsumabihoidolla kuukaudessa (4 viikkoa) kussakin sairaalassa (yhteensä = 8 kuukaudessa). Tämä tarkoittaa, että 15 koehenkilölle tulisi määrätä mepolitsumabihoito tämän tutkimuksen ensimmäisten 36 viikon aikana, jotta heillä olisi riittävästi aikaa suorittaa tutkimus 72 viikossa (1,5 vuodessa). Odotamme myös, että vähintään 90 % tutkittavista suorittaa tämän tutkimuksen.

Arvioitu opintojen alkamispäivä: joulukuu 2020 Arvioitu opintojen päättymispäivä: 1,5 vuotta (72 viikkoa)

Opintojen suunnittelu ja menetelmät

Kuva 2. Tutkimussuunnitelma. Tämä kuva edustaa kaavamaisesti sekä tutkimuksen kliinistä että kokeellista osaa.

Tämä on havainnollinen, pitkittäinen, prospektiivinen ja monikeskustutkimus, jossa arvioidaan sekä varhaista vastetta (4 viikkoa) että myöhäistä vastetta (16 ja 32 viikkoa) mepolitsumabihoitoon vaikeissa eosinofiilisissä astmaatikoissa. Tutkimusta johtaa tri Francisco Javier González Barcala (CHUS:n pneumologiapalvelu). Dr. Barcala oli kansallinen koordinaattori yhdessä kliinisessä tutkimuksessa sekä päätutkija ja osatutkija 41 ja 19 kliinisessä tutkimuksessa. Lisäksi tohtori Barcala on ollut päätutkija 7 tutkimusprojektissa, yhteistyökumppani 7 muussa hankkeessa ja julkaissut yli 120 asiaankuuluvaa julkaisua (vertaisarvioitu ja JCR-indeksoitu) hengityselinsairauksien, pääasiassa astman, alalla.

Tutkimuksessa on mukana myös muita monitieteisen astmayksikön jäseniä (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, tohtori Juan José Nieto Fontarigo). Erityisesti projektipäällikkö Dr. Salgado on ollut mukana 11 tutkimusprojektissa, hänellä on 28 tutkimuspaperia vaikuttavissa aikakauslehdissä, jotka kuuluvat immunologian, biokemian, proteomiikan ja hengityselinten sairauksien aloille. Lisäksi muilla tämän hankkeen osallistujilla on laaja kokemus omalta alaltaan, sekä perustutkimuksesta että translaatiotutkimuksesta. He ovat Dra. Marina Blanco Aparicio, joka vastaa A Coruñan yliopistollisen sairaalakompleksin (CHUAC) astmayksiköstä, tohtori Uxío Calvo Ferrolin yliopistollisessa sairaalakompleksissa (CHUF) ja Coral González Ourensen yliopistollisessa sairaalakompleksissa (CHUO) , Mar Mosteiro Alvaro Cunqueiron sairaalassa Vigossa; Dolores Corbacho Povisa-Vigon sairaalassa. Esitohtorivaiheessa oleva tutkija on palkattava 12 kuukaudeksi suorittamaan näytteen valmistelua transkriptomisissa ja proteomisissa tutkimuksissa sekä RTqPCR-, virtaussytometria- ja ELISA-määrityksissä. Tätä tutkijaa ohjaavat tohtori Francisco Javier Salgado Castron ja tohtori Juan José Nieto-Fontarigo (monitieteellinen astmayksikkö, CHUS). Proteomiikkakokeita suorittaa Dra. Susana Belén Bravo López ja María García Vence, jotka työskentelevät Santiago de Compostelan Sanitary Research Foundationin (FIDIS) Proteomic Platformissa. nCounter®-analyysi suoritetaan GENVIP-ryhmän (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDISin tarjoaman palvelun kautta.

Tutkimusprojekti on minimaalisesti invasiivinen (esim. ei bronkoskooppisia tutkimuksia), mutta protokollan on tarkistettava ja hyväksyttävä Espanjan Galician kliinisen tutkimuksen eettinen komitea. Vain viisitoista potilasta, jotka täyttävät myöhään alkavan vaikean astman diagnoosikriteerit, saavat mepolitsumabia ja allekirjoittavat tietoisen suostumuksen, otetaan mukaan tähän tutkimukseen. Eri kliiniset tiimit noudattavat samaa protokollaa. Demografiset sekä kliiniset, hematologiset ja biokemialliset muuttujat sisällytetään tietokantaan. Allergisen herkistymisen tarkistamiseen käytetään ihopistokoetta yleisille allergeeneille ja allergeenispesifisen IgE:n (ImmunoCAP, Thermo Fisher) läsnäololle. Myös keuhkojen toimintaparametrit (pakotettu uloshengitystilavuus 1. sekunnissa (FEV1), pakotettu vitaalikapasiteetti (FVC) ja FEV1/FVC-suhde) analysoidaan. Spirometria tehdään ennen ja jälkeen keuhkoputkia laajentavan lääkkeen käytön. Asthma Control Test (ACT) ja Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) -kysely suoritetaan. Astmapotilaiden on oltava sairauden vakaassa vaiheessa (esim. pahenemisvaiheiden puuttuminen vähintään 4 viikkoa ennen näytteenottoa). Pahenemisvaiheet hoidetaan kliinisten standardien mukaisesti. Potilaat (n=15) saavat 100 mg:n ihonalaisen injektion mepolitsumabia 4 viikon välein, ja veri- ja seeruminäytteet (2–3 EDTA-putkea; 1 SST-putki) otetaan T=0, 4, 16 ja 32 viikon välein. arvioidakseen sekä varhaista (4 viikkoa) että myöhäistä vastetta (16 ja 32 viikkoa) hoitoon.

menetelmät

• Putket: EDTA (täysveri) ja SST (seerumi)

• Eosinofiilien puhdistus

  • Eosinofiilit voidaan eristää kokoverestä (hepariiniputket) käyttämällä Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit -pakkausta (luettelo #130-104-466) tai EasySep™ Human Eosinophil Isolation -pakkausta (luettelo #17956), molemmat negatiiviset valintamenetelmät, jotka tuottavat koskemattomia osajoukkoja nämä leukosyytit. Odotamme noin 1,0-4,0 x 106 solua ~20 ml:sta verta, mutta myös korkea elinkelpoisuus ja puhtaus (>95 %).

• ELISA-tutkimukset.

  • Seeruminäytteiden kerääminen: IGF-ALS:n (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 -kuoppa), IGF-1:n (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, luettelonumero DY291) ja IGF-BP3:n (ihmisen IGFBP-3) mittaus DuoSet ELISA, R&D Systems, luettelo #DY675) ELISA:n avulla.

• RNA:n kokonaispuhdistus eosinofiileistä ja nCounter nanoString -analyysi (löytöihin perustuva/hypoteesia luova lähestymistapa):

  • Puhdistetut eosinofiilit terveiltä kontrolleilta (T=0) ja potilailta (T=0, 4, 16 ja 32 viikkoa) säilytetään -80 ºC:ssa RNAlater-liuoksessa (Ambion, Paisley, UK). Kokonais-RNA eristetään RNeasy Mini -sarjan (Qiagen) avulla ja säilytetään -80 ºC:ssa RNA:n laadun ja pitoisuuden (Nanodrop) tarkistamisen jälkeen.
  • nCounter®-alusta (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) on multipleksimenetelmä, joka mahdollistaa jopa 800 RNA-, DNA- tai proteiinikohteen kvantifioinnin. Mitä tulee mRNA-molekyyleihin, tämä tekniikka perustuu jokaisen mRNA:n hybridisaatioon liuoksessa kahteen komplementaariseen oligonukleotidiin: biotinyloituun mRNA-spesifiseen koettimeen ja mRNA-spesifiseen oligonukleotidiin, joka sisältää kuuden fluorokromin (neljä eri väriä) peräkkäisen yhdistelmän, jotka luovat fluoresoivan viivakoodi, joka tunnistaa spesifisen havaittavan mRNA:n. Kun molempien koettimien ylimäärä on poistettu, hybridisoidut kompleksit siepataan biotiini-streptavidiini-vuorovaikutuksen kautta ja kohdistetaan patruunaan, jotta nCounter-laite voi lukea nuo "viivakoodit". Näiden vaiheiden suorittamiseksi nCounter-alusta koostuu kahdesta instrumentista: Prep Station, joka puhdistaa hybridisoituneet kompleksit ja immobilisoi ne patruunan pinnalle, ja Digital Analyzer (DA), skanneri, joka tunnistaa ja laskee jokaiselle näytteelle kaapatut viivakoodit. Tämä kvantitatiivinen analyysi Siksi jokainen miRNA voidaan kvantifioida yksitellen (absoluuttinen kvantifiointi; laskennat) vaikeista näytteistä (esim. eosinofiilit) ilman muita vaatimuksia, kuten mRNA-cDNA-konversiota (RT) tai DNA-amplifikaatiota (qPCR), mikä johtaa vähemmän tietojen vaihtelua (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Lisäksi syöttömateriaalin määrä on pieni (25 ng-300 ng mRNA:ta) ja se voidaan johtaa FFPE-peräisestä RNA:sta, kokonais-RNA:sta, fragmentoidusta RNA:sta, solulysaateista ja lajitetuista soluista. Jälkeenpäin nCounter-tiedot normalisoidaan, taustamelu vähennetään ja tehdään lisäkorjaus uuttamisen tehokkuuden huomioon ottamiseksi (laskettu näytteeseen lisättyjen piikkien miRNA:iden ilmentymisen perusteella, joita lisätään näytteeseen tietyssä määrässä ennen miRNA-uuttoa ). Normalisoinnit tehdään R NanoStringNorm -paketilla. Normalisoinnin jälkeen tiedoista tehdään log2-muunnos ja analysoidaan sen jälkeen LIMMA Bioconductor -paketin avulla niiden mRNA:iden tunnistamiseksi, joiden runsaus on erilainen mepolitsumabihoidon aikana. Tämä analyysi kestää enintään 24 tuntia.

• RTqPCR-tutkimukset (hypoteesilähtöinen lähestymistapa):

  • Mepolitsumabilla hoidetuista potilaista peräisin olevia hälytysvälitteiseen eosinofiilien (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) ja eosinofiilien (FOXP3) säätelytoimintoihin liittyviä proteiineja koodaavien mRNA:iden tasojen analysoimiseksi kokonais-RNA transkriptoidaan cDNA:ksi. (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) ja säilytetty -80 ºC:ssa. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) suoritetaan LightCycler® 96 -laitteella (Roche Life Science) ja sitä käytetään analysoimaan FOXP3:n, CRLF2:n, ST2:n, IL-7R:n ja HPRT1-geenin (endogeeninen kontrolli) ilmentymistä.

• Virtaussytometriatutkimukset (hypoteesilähtöinen lähestymistapa):

  • EDTA-käsitellyt perifeeriset verinäytteet terveiltä kontrolleilta (n=15; T0) ja mepolitsumabilla hoidetuilta potilailta (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Merkitse 100 μl/putki koko perifeeristä verta (EDTA) sekä spesifisillä että isotyyppisovitetuilla kontrollivasta-aineilla (BD). Punasolujen lyysi FACSlyse:llä (BD). Analyysi FACSCalibur-virtaussytometrillä (BD). Käytä FSC/SSC:tä granulosyyttien valitsemiseen; sitten SSC vs CCR3 (FITC) eosinofiilien erottamiseksi neutrofiileistä. Portin eosinofiilit:

    • Multimarkkeripaneeli 1 (eosinofiilien säätelyproteiinit): CD16:n ja galektiinien-1/10 mittaus [41-44].
    • Multimarkkeripaneeli 2 (Eosinofiilien aktivaatioreseptorit): CD48:n (eosinofiilien kokonaismäärä vähentynyt keskivaikeassa astmassa verrattuna terveisiin kontrolleihin (HC) [tutkimuksemme, 54]), CD44:n ja CD11b:n mittaus.
    • Multimarkkeripaneeli 3 (eosinofiilien alajoukot): Siglec-8:n, CD62L:n (L-selektiinin) ja IL-5Ra:n ilmentymiseen perustuva osajoukkojen analyysi [40].

• Eosinofiilin proteomin analyysi (löytöihin perustuva/hypoteesia luova lähestymistapa):

  • Jopa 50 x 103 solua tarvitaan proteomisten määritysten suorittamiseen. Odotamme noin 50-400 x 103 solua noin 1 ml:sta verta.
  • Eristetyt eosinofiilit (50 x 103 solua) kerätään sentrifugoimalla, pestään ja suspendoidaan uudelleen lyysipuskuriin, jossa on proteinaasi-inhibiittoreita. Sen jälkeen liukenematon materiaali poistetaan sentrifugoimalla ja solusupernatantit säilytetään -80 °C:ssa.
  • Eosinofiilien kokonaisproteomin karakterisointi tehdään trypsiinidigestion jälkeen käyttämällä DDA-menetelmää LC-MSMS-järjestelmässä. Tätä lähestymistapaa varten käytämme näytteitä 15 terveeltä luovuttajalta ja 15 potilaalta (T0, T4, T16, T32). Valitut proteiinit ovat vain sellaisia, jotka raportoivat 1 %:n maailmanlaajuisen väärän havainnoinnin (FDR) tai paremman [55, 56].
  • Proteiini"poolit" viidestä tutkimusryhmästä (terveet luovuttajat ja potilaat ajanhetkellä T0, T4, T16 ja T32 hoidon jälkeen) käytetään jakaen ne (1-DE) 5-6 vyöhykkeeseen ja uuttamalla proteiinit kustakin. Vyöhykkeen muodostamalla vastaavat peptidit ja analysoimalla ne MS/MS:llä SWATH:n kirjaston tuottamiseksi, jossa on suuri määrä proteiineja ja jonka kvantifiointi sitten suoritetaan. Kun kirjasto on tehty ja LC-MS/MS:n (TripleTOF) standardoidut olosuhteet ylläpidetään, suoritamme SWATH-MS-analyysin ("informaatiosta riippuvainen hankintamenetelmä" eli IDA; "Targeted label-free proteomiics") näytteille 15 tervettä luovuttajaa ja 15 potilasta (T0, T4, T16, T32). Tämä määritys antaa meille mahdollisuuden tunnistaa proteiineja, joilla on merkittäviä eroja tutkimusryhmien välillä. Valitut proteiinit ovat vain sellaisia, joiden P < 0,05 ja kertamuutos ≥ 1,5 [56-59].

Tutkimuksen päätepisteet:

Demografiset tiedot kaikista tutkimukseen osallistuneista henkilöistä saadaan perusvaiheessa. Lisäksi kerätään useita tietoja, kuten astmahistoria, keuhkojen toimintaparametrit, ihopistokoe, allergeenispesifinen IgE, AQLQ-pisteet, ACT-pisteet, pahenemisvaiheet ja prednisonin kulutus. Seuraavien Pneumologian käyntien aikana klo T0, 4, 16 ja 32 mepolitsumabilla hoidettuja potilaita seurataan. Tämä sisältää keuhkojen toiminnan (FEV1, FEV1/FVC), biokemiallisten ja hematologisten parametrien mittaukset.

Perifeeriset veri- ja seeruminäytteet kerätään ja eosinofiilit puhdistetaan magneettisesti T0-, T4-, T16- ja T32-pisteissä, ja suoritetaan virtaussytometria, RTqPCR ja proteomianalyysit sekä immunomääritykset. Kaikki kokeelliset muuttujat (esim. eosinofiiliproteiinien runsaus proteomisissa määrityksissä, eosinofiilien aktivaatiomarkkerit jne.) korreloidaan kliinisten parametrien (esim. keuhkojen toiminta, astman hallinta, pahenemisvaiheiden lukumäärä) kanssa, jotta voidaan arvioida näiden muuttujien yhteys. hoitovasteen kanssa. Harkitsemme suotuisaa vastausta mepolitsumabille, jos jokin seuraavista kriteereistä täyttyy:

• Riittävän astman hallinnan saavuttamiseksi ACT ≥20 [60] tai/ ≥3 pisteen muutos edustaa minimaalisen tärkeää eroa.
• Vuotuisen pahenemisasteen vähentämiseksi 48 %. Paheneminen määritellään sellaisten oireiden lisääntymisenä, jotka vaativat hoitoa systeemisillä kortikosteroideilla ≥3 ajan tai suunnittelematonta lääkärinkäyntiä, joka on samanlainen kuin mepolitsumabilla tehdyissä kliinisissä tutkimuksissa [20, 61].
• Saat 50 prosentin vähennyksen vuosittaisessa astman pahenemisen aiheuttamassa sairaalassa käynnissä, samalla tavalla kuin kliinisissä tutkimuksissa [62].
• Systeemisten kortikosteroidien vuotuisen mediaaniannoksen pienentäminen 50 % [63].

• Tutkimuksen ensisijaiset päätetapahtumat:

  • IGF-1-, IGF-BP3- ja IGF-ALS-tasot seerumissa
  • Transkriptominen (nanoString)/mRNA-ekspressiotiedot: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteominen data
  • Virtaussytometriatiedot: CD16:n, galektiinien-1/10:n, CD48:n, CD44:n, CD11b:n, Siglec-8:n, CD62L:n ja IL-5Ra:n ilmentyminen

• Tutki toissijaisia ​​päätepisteitä:

  • Keuhkojen toimintaparametrit (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hematologiset parametrit (esim. eosinofiilien määrä).
  • Muut kliiniset ja biokemialliset muuttujat (esim. IgE tai muut immunoglobuliinit).
  • Pahenemisvaiheiden lukumäärä, prednisonin kulutus, ACT-pisteet, AQLQ-pisteet.

Tilastosuunnitelma tai data-analyysi:

Graph Pad Prismia käytetään grafiikan luomiseen. Tilastotutkimuksessa käytetään IBM SPSS:tä, Statistics 22.0:aa tai R:tä. Analyysien aikana meitä avustaa USC Statistics and Operational Research -alue (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Otoskoko Näytteen koon (N) laskenta on suoritettu käyttämällä G*Power 3.1.9.4 [64]. Näiden analyysien aikana laskemme N tarvittavaa saada tilastollista merkitsevyyttä F-testissä (ANOVA: Toistetut mittaukset, tekijöiden sisällä), annettuna α (0,05), tehon (1-β, 0,95), mittausten lukumäärän (T0, T4, T16 ja T32) ja vaikutuksen koko (f = 0,4; suuri vaikutuskoko, joka antaa kliinisesti merkityksellisemmän tuloksen). Lähtö N oli 15, ja kriittinen F = 2,82705.

Kliinisiä, virtaussytometria- ja transkriptiotietoja varten. Poikkileikkausvertailut HC:n ja potilaiden välillä T0:ssa (ennen hoitoa) normaalijakauman jälkeen ja varianssien homogeenisuus tehdään t-testillä. Ei-normaalihajautetuille muuttujille käytämme Mann-Whitney U -testiä. Muutokset eri tutkimusmuuttujissa vasteena mepolitsumabihoitoon (pitkittäistutkimus; T0, T4, T16 ja T32) testataan käyttämällä RM-ANOVAa. Monimuuttuja-analyysi (esim. PCA, valvomaton klusterointi) sekä toiminnallinen rikastusanalyysi suoritetaan virtaussytometrialla ja ennen kaikkea transkriptomistisilla tiedoilla.

Proteomin kokonaiskarakterisointiin ja kvantitatiiviseen SWATH-analyysiin Käytämme ABSciexin ProteinPilotTM 5.0.1 -ohjelmistoa, jossa on algoritmi ParagonTM tietokantahakuun ja ProgroupTM tietojen ryhmittelyyn. Tiedot haetaan käyttämällä ihmiskohtaista Uniprot-tietokantaa. Väärien löydösten määrä suoritetaan käyttämällä ei-lineaalista sovitusmenetelmää, joka näyttää vain ne tulokset, jotka raportoivat 1 %:n maailmanlaajuisen väärien löydösten prosentin tai paremman [65].

Toiminnallinen analyysi suoritetaan erilaisilla avoimen pääsyn ohjelmistoilla. FunRich (Functional Enrichment -analyysityökalu) toiminnalliseen rikastamiseen ja vuorovaikutusverkkoanalyysiin (http://funrich.org/index.html). Tilastoja varten FunRich käyttää hypergeometristä testiä, BH:ta ja Bonferronia [66, 67]. Käytämme DAVIDia (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) tai GO:ta (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) geeniontologian rikastamiseen ja proteiini-proteiinivuorovaikutukseen, verkkoon rakentamiseen ja klusterointiin, käytämme merkkijonoa (https://string-db.org/) tai Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

SWATH-tiedoille MarkerView-ohjelmisto antaa meille monimuuttujan tilastollisen analyysin käyttämällä pääkomponenttianalyysiä (PCA) vertaillaksemme tietoja näytteiden välillä. Kunkin proteiinin keskimääräinen MS-huippupinta-ala johdetaan kunkin näytteen SWATH-MS:n replikaatioista, mitä seuraa Studentin t-testianalyysi käyttäen MarkerView-ohjelmistoa näytteiden vertailua varten, joka perustuu kaikkien näytteen siirtymien keskimääräisiin pinta-aloihin. jokainen proteiini. T-testi osoittaa, kuinka hyvin kukin muuttuja erottaa nämä kaksi ryhmää, jotka ilmoitetaan P-arvona. Kirjastoa varten valitaan sen joukko erilaisia ​​runsaasti proteiineja (p-arvo <0,05), joissa on 1,5 ylös- tai alas-säädelty proteiini.

Rajoitukset

• Kuten aiemmin kommentoitiin, 15 koehenkilöä määrätään saamaan mepolitsumabia tutkimuksen ensimmäisen puoliskon aikana (36 viikkoa). Odotamme, että vähintään 90 % tutkittavista suorittaa tämän tutkimuksen. Potilaiden keskeyttäminen ja noudattamatta jättäminen (tai noudattamatta jättäminen) ovat kuitenkin yleisiä tapahtumia kliinisissä tutkimuksissa. Tällaisessa tapauksessa otoskoko kasvaa suhteellisesti.
• Tätä projektia on ehdotettu tutkimukseksi molekyylibiomarkkerien löytämisestä vasteena mepolitsumabille. Tällaisiin tutkimuksiin voidaan ryhtyä käyttämällä kohdennettuja/hypoteesilähtöisiä tai laajempia/kohdistamattomia ("-omics"-tekniikoita) lähestymistapoja. Tiedämme, että voi olla haastavaa löytää ennustavia markkereita tässä pienessä ja prospektiivisessa tutkimuksessa. Tässä projektissa ehdotamme kaksinkertaista lähestymistapaa tämän riskin minimoimiseksi. Toisaalta nykyaikaiset ja kohdistamattomat menetelmät toimivat ja erittäin herkkiä havaitsemaan vähän runsaasti proteiineja (SWATH MS) tai yksinkertaistetut protokollat ​​työskennellä vaikeiden näytteiden kanssa (hyvälaatuisen RNA:n tuottaminen eosinofiileistä on aina haastavaa, koska proteiineja on runsaasti. kuten EDN, RNase-perheen jäsen) ja vähentää teknistä varianssia (esim. nCounter nanoString) näytekoon lyhentämiseksi. Toisaalta hypoteesilähtöiset lähestymistavat (esim. virtaussytometria, RT-qPCR, ELISA), joiden etuna on suurempi uskottavuus, pienempi tyypin I (eli väärän löydön) ja II virheiden riski ja helppo replikointi tulevaisuudessa. tuloksista. Näitä kohdennettuja menetelmiä käytetään myös vahvistamaan vain kliinisesti merkityksellisiä (suuri vaikutuskoko) ja merkittäviä (p-arvo < 0,05) eroja, jotka on saatu kohdistamattomilla transkriptoimis-/proteomisilla lähestymistavoilla.
• Toinen mahdollinen rajoitus on eosinofiilien määrä, joka voi olla mahdollisesti alhainen joillakin potilailla mepolitsumabihoidon jälkeen (50 x 103 tai vähemmän). Siksi voi olla tarpeen puhdistaa enemmän kuin 1 tai 2 ml verta näillä potilailla, jotta saadaan tarpeeksi soluja proteomisten ja transkriptomisten kokeiden suorittamiseen. Olemme käsitelleet tätä asiaa tutkimuspöytäkirjassa ja hankkeen budjetissa.
• Lopuksi TripleTOF on erittäin herkkä massaspektrometri, joka on suunniteltu kaivamaan syvemmälle monimutkaisiin näytteisiin, kuten eosinofiiliproteomiin. Nykyisten massaspektrometrien korkea herkkyys yhdistettynä kaksiulotteisiin nanoLC-kaavioihin mahdollistaa suurempien proteiinien (> 1000) ja analyyttien havaitsemisen pitoisuuksilla attomolaarisella alueella (10-18), mikä riittää havaitsemaan vähän runsaasti solunsisäisiä proteiineja, kuten kemokiinit tai sytokiinit. Siten TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 ja IL-18 on havaittu nanoLC-MS/MS:llä (Q-TOF), mutta ei muita, kuten IL-5 tai IL-13 [69 ]. Tämä odotettu rajoitus johtuu peptidien läsnäolosta erittäin runsaista proteiineista (esim. eosinofiiliraeproteiineista), jotka estävät peptidien ionisaatiota vähäisistä proteiineista LC-MS/MS-sovelluksissa. Tämä johtaa runsaiden lajien, kuten Charcot-Leydenin kideproteiinin (CLC, galectin-10), yliedustukseen havaittujen proteiinien luettelossa, mikä on edelleen mielenkiintoinen tämän projektin kannalta, koska se tunnistaa eosinofiilit, joilla on säätelykyky. Kuitenkin näytteen monimutkaisuuden vähentämiseksi ja vähäisen proteiinien havaitsemisen parantamiseksi on olemassa erilaisia ​​​​depletio- (esim. ACN-poisto, ultrasuodatus, 1-DE) ja rikastusmenetelmiä (esim. CPLL:t), joita voimme käyttää havaitsemiseen. herkkyys. Valinnaisesti kohdennettuja lähestymistapoja, kuten high-multiplex-immunomäärityksiä (esim. Olink Immune Response-, Olink Inflammation- tai Olink Immuno-Oncology -paneelit; https://www.olink.com/) Niiden etuna on korkea havaitsemisherkkyys pienillä biologisten näytteiden (esim. solulysaattien) tilavuudella, vaikka se mahdollistaa vain 92 proteiinin biomarkkerin mittaamisen kerralla.