중증 호산구성 천식에 대한 메폴리주맙의 효과 (EMESEA)

가설

Hº1. 호산구 상의 특정 표면 분자의 수준 또는 메폴리주맙 치료 전에 이 백혈구 하위세트의 프로테옴에서 특정 단백질의 존재 또는 부재는 이 생물학적 반응의 예측/예후 마커로 사용될 수 있습니다.

Hº2. Mepolizumab은 활성화 상태, 이동 능력, 조절/이펙터 기능 또는 부분 집합 구성의 변화와 관련된 결과로 호산구의 여러 표면 또는 세포내 단백질의 풍부함을 변경합니다.

Hº3. 후기 발병 중증 호산구성 천식 환자는 IGF 계열(IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS)의 다른 구성원의 혈청 농도가 상승하고 메폴리주맙 치료는 이러한 수준을 감소시키고 반응 바이오마커로 작용합니다. 호산구 및 임상 악화.

목표 또는 연구 질문

OB(Aspirational objective): 유세포분석, transcriptomic 및 proteomic 기술을 사용하여 mepolizumab에 대한 반응의 예측/예후 바이오마커 발견.

• OB1.- 유세포 분석 기술을 사용하여 메폴리주맙 치료에 반응하여 호산구 및 호산구 하위 집단의 표면 마커의 변화를 확인합니다. 이 목표는 다음 산출물(DE)로 배포됩니다.

  • DE1.1: 15개의 건강한 대조군 선택
  • DE1.2: 후기 발병 중증 호산구성 천식 환자의 진단 및 기준을 충족하는 15명의 환자 선택, 메폴리주맙 투여 예정 및 사전 동의서 서명.
  • DE1.3: 인구통계학적, 임상적, 혈액학적 및 생화학적 정보가 포함된 건강한 대조군 및 천식 환자를 위한 초기 데이터베이스 생성.
  • DE1.4: 건강한 공여자(T0) 및 메폴리주맙 치료 환자(T0, T4, T16, T32)로부터 혈청(1 SST 튜브) 및 전혈 샘플(1-2 튜브)의 수집 및 처리.
  • DE1.5: 다중마커 패널 1(조절), 2(활성화) 및 3(호산구 하위 집합)을 사용한 유세포 분석 분석(아래 참조).
  • DE1.6: 시간 T4, T16 및 T32에서 생성된 임상, 혈액학, 생화학 및 유세포 분석 데이터로 데이터베이스를 완성하십시오. 최종 단변량 및 다변량 통계 분석.
  • DE1.7: 결과 공개.

• OB2.- 메폴리주맙을 사용한 치료에 반응하여 증가되거나 감소된 수준을 나타내는 호산구 전사체 내의 mRNA를 식별하기 위한 전사체 분석. 이 목표는 다음 산출물(DE)로 배포됩니다.

  • DE2.1: 호산구 분리 프로토콜을 설정하고 유세포 측정으로 세포 순도를 확인합니다.
  • DE2.2: 15명의 건강한 공여자(T0) 및 15명의 환자(T0, T4, T16, T32)로부터의 호산구 정제.
  • DE2.3: 호산구 용해물에서 총 RNA 추출, RNA의 품질 및 양 분석, -80ºC에서 보관.
  • DE2.4: 발견 기반/가설 생성 접근 방식. 사전 제작된 "nCounter® Human Myeloid"와 함께 nCounter® NanoString이라는 직접 다중 분자 측정 플랫폼을 통해 골수 세포의 모집, 활성화 및 이펙터 기능에 연결된 770개의 인간 단백질 코딩 mRNA 수준 평가 선천 면역 패널(v2)"(www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). 높은 경제적 비용으로 인해 연구의 이 부분은 건강한 기증자(T = 0)의 호산구 샘플과 환자의 두 시점(T = 0 및 T = 16)으로만 수행됩니다.
  • DE2.5: 획득한 데이터 처리 및 초기 통계 분석.
  • DE2.6: 확립된 정량적 기법을 사용한 nCounter® 데이터 및 가설 기반 접근 방식의 검증. nCounter® 연구에 따라 mepolizumab 치료에 대한 반응으로 가장 큰 변화를 나타내는 호산구의 mRNA에 대한 역전사 및 qPCR 분석을 수행합니다. 또한 FOXP3(조절 기능), CRLF2, ST2 또는 IL-7R(사이토카인 수용체; 활성화)과 같이 "nanoString Myeloid Innate Immunity" 패널에 포함되지 않은 일부 추가 mRNA가 분석됩니다. HPRT1 유전자는 이 RTqPCR 실험 세트에서 하우스키핑 유전자로 사용됩니다.
  • DE2.7: 단변량 및 다변량 통계 분석.
  • DE2.8: transcriptomic 결과의 출판.

• OB3.- 메폴리주맙을 사용한 치료에 반응하여 호산구 내에서 풍부한 풍부함을 갖는 단백질을 식별하기 위한 프로테오믹 프로파일링. 이 목표는 다음 산출물(DE)로 배포됩니다.

  • DE3.1: 호산구 용해, 원심분리에 의한 불용성 물질 제거, 단백질 정량화(BCA) 및 -80°C에서 세포 상청액 저장.
  • DE3.2: 액체 크로마토그래피(LC)-MS/MS 기술(Triple TOF 6600)을 이용한 DDA(Data Dependent Acquisition) 방법으로 총 단백질체 분석 프로토콜 개발
  • DE3.3: 테스트의 재현성을 확인하기 위해 생물학적 가변성(생물학적 복제) 및 기법(기술적 복제)을 확인합니다.
  • DE3.4: LC-MS/MS(TripleTOF)의 표준화된 조건을 유지하면서 가능한 한 많은 호산구 단백질로 SWATH(모든 이론적 질량 스펙트럼의 순차적 창 획득)용 라이브러리를 만듭니다.
  • DE3.5: 15명의 건강한 기증자와 15명의 환자(T0, T4, T16, T32)의 샘플에서 SWATH-MS 분석을 수행합니다("정보 의존 획득" 방법 또는 IDA; "표적화된 라벨 없는 프로테오믹스").
  • DE3.6: 획득한 데이터 처리 및 초기 통계 분석.
  • DE3.7: 다른 기술(예: 선택된 반응 모니터링/SRM, ELISA)로 얻은 바이오마커 패널 확인.
  • DE3.8: 최종 단일 및 다변수 통계 분석. 그룹 간 유의미한 차이(P < 0.05)와 최소 배수 변화 ≥ 1.5가 있는 단백질을 식별합니다.
  • DE3.9: 단백질체학 결과 공개

• OB4. 후기 발병 중증 호산구성 천식 환자가 혈청 샘플에서 높은 수준의 IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS를 나타내는지, mepolizumab의 반응이 이 마커의 수준에 따라 달라지는지, 이 생물학적으로 치료하면 내 농도가 감소하는지 확인하십시오. 이러한 IGF 계열 구성원의 혈청. 이 목표는 다음 산출물(DE)로 배포됩니다.

  • DE4.1: ELISA에 의한 IGF-1, IGF-BP3 및 IGF-ALS의 분석
  • DE4.2: 실험 데이터의 단변량 및 다변량 통계 분석
  • DE4.3: 결과 공개

결과 발표:

우리는 mepolizumab 투여 전후 환자의 임상 데이터 연구 결과로 스페인 호흡기 학회(SEPAR)와 유럽 호흡기 학회(ERS)에서 연구 첫 해 동안 커뮤니케이션을 발표하기 위해 노력할 것입니다. . 또한 우리는 1분기 저널에 3개의 출판물과 실험적 연구 결과로 나온 다른 2~3개의 회의 커뮤니케이션을 게시할 예정입니다.

연구 모집단 연구 모집단에는 갈리시아(Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo 및 Ourense), 스페인. 스크리닝 시 중증 호산구성 천식 환자의 진단은 아래에 설명된 여러 포함 기준 및 제외 기준을 기반으로 합니다[12].

포함 기준:

• ERS/ATS 기준[52]에 따른 조절되지 않는 중증 천식의 진단.
• 2회 이상(각 측정 사이에 4주 이상) 혈액 내 지속적인 호산구 증가증(>300 세포/μL).
• 전신 코르티코스테로이드 치료 및/또는 응급실(ED) 방문 및/또는 입원이 필요한 천식 조절 부족이 3일 이상 지속되는 기간으로 정의되는 빈번한 악화(연간 2회 이상).
• 정보에 입각한 동의서에 서명하고 모든 연구 방문 및 이에 수반되는 모든 절차를 준수하는 데 동의합니다.

제외 기준:

• 흡연력: 현재 흡연자 또는 10갑년 이상의 흡연력이 있는 이전 흡연자(갑년 수 = (일당 담배 수/20) x 흡연 기간). 이전 흡연자는 방문 1 이전에 적어도 6개월 동안 흡연을 중단한 참여자로 정의됩니다.
• 천식 이외의 임상적으로 중요한 폐 질환(예: 활동성 폐 감염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 기관지확장증, 폐섬유증, 낭포성 섬유증, 비만과 관련된 환기저하 증후군, 폐암, 알파 1 항트립신 결핍증, 원발성 섬모 운동이상증) 또는 폐 또는 전신 질환 진단을 받은 적이 있는 사람 , 상승된 말초 호산구 수(예: 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증/진균증, 처그-스트라우스 증후군, 과호산구성 증후군).
• 심혈관계, 위장관, 간장, 신장, 신경계, 근골격계, 감염성, 내분비계, 대사, 혈액학적, 정신과적 또는 연구자의 의견으로는 안정적이지 않은 주요 신체 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 장애.
• 악성종양: 현재 악성종양 또는 차도가 있는 이전 암 병력.
• 1차 방문 전 30일 이내에 항생제 또는 항바이러스제가 필요한 급성 상부 또는 하부 호흡기 감염.
• Xolair: 이전에 omalizumab(Xolair) 또는 다른 단클론 항체를 투여받은 참가자.
• 방문 1 [53] 전 30일 이내에 전신 코르티코스테로이드를 투여받은 참가자.
• 임신: 임신 중이거나 모유 수유 중인 참가자.
• 비만 등급 2 이상(BMI≥ 35kg/m2)(https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

표본의 크기

• T = 0에서의 분석만을 위한 건강한 대조군(n=15)의 코호트.

• 현재 처방된 약물에 대한 수정 없이 메폴리주맙 요법으로 시작하는 중증 호산구성 천식을 앓는 n=15 피험자의 코호트. 최초 연구 방문 후 4주(T4), 16주(T16) 및 32주(T32)에 후속 연구 방문(T=0).

  • 표본 크기에 대한 이론적 근거는 통계 섹션에 설명되어 있습니다.

예상 등록률 이 연구는 다기관 연구이므로 각 병원에서 매월(4주) 메폴리주맙 요법으로 시작하는 중증 호산구성 천식 환자 최소 2명의 등록률에 도달할 것으로 예상됩니다(총 = 매월 8명). 이는 15명의 피험자가 본 연구의 첫 36주 동안 메폴리주맙을 투여받도록 일정을 잡아 72주(1.5년)에 연구를 완료할 수 있는 충분한 시간을 가져야 함을 의미합니다. 또한 최소 90%의 피험자가 이 연구를 완료할 것으로 예상합니다.

예상 연구 시작일: 2020년 12월 예상 연구 완료일: 1.5년(72주)

연구 설계 및 방법

그림 2. 연구 설계. 이 그림은 연구의 임상 및 실험 부분 모두를 개략적인 방식으로 나타냅니다.

이것은 중증 호산구성 천식 환자에서 mepolizumab 요법에 대한 초기 반응(4주)과 후기 반응(16주 및 32주)을 모두 평가하기 위한 관찰, 종단, 전향적 및 다기관 연구입니다. 이 연구는 Dr. Francisco Javier González Barcala(CHUS의 Pneumology Service)가 이끌 것입니다. Barcala 박사는 1건의 임상 시험에서 국가 코디네이터였으며 각각 41건 및 19건의 임상 시험에서 수석 연구원 및 하위 연구원이었습니다. 또한 Barcala 박사는 7개 연구 프로젝트의 수석 연구원이자 다른 7개 프로젝트의 협력자였으며 주로 천식과 같은 호흡기 질환 분야에서 120개 이상의 관련 간행물(동료 검토 및 JCR 색인)을 발표했습니다.

이 연구에는 다학제적 천식 부서(Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). 특히 프로젝트 매니저 Dr. Salgado는 11개의 연구 프로젝트에 참여했으며 면역학, 생화학, 단백질체학 및 호흡기 질환 분야에 속하는 영향력 있는 저널에 28개의 연구 논문을 발표했습니다. 또한 이 프로젝트의 다른 참여자들은 기초 및 중개 연구 모두에서 각자의 분야에서 폭 넓은 경험을 가지고 있습니다. 그들은 드라입니다. 마리나 블랑코 아파리시오(Marina Blanco Aparicio), A Coruña 대학 병원 단지(CHUAC), Uxío Calvo 박사, Ferrol 대학 병원 단지(CHUF), Coral González 오렌세 대학 병원 단지(CHUO) , Vigo의 Alvaro Cunqueiro 병원의 Mar Mosteiro; Povisa-Vigo 병원의 Dolores Corbacho . RTqPCR, 유세포 분석 및 ELISA 분석뿐만 아니라 transcriptomic 및 proteomic 연구에서 샘플 준비를 수행하기 위해 12개월 동안 박사 전 단계의 연구원을 고용해야 합니다. 이 연구원은 Francisco Javier Salgado Castro 박사와 Juan José Nieto-Fontarigo 박사(CHUS 종합 천식 병동)의 감독을 받게 됩니다. Proteomics 실험은 Dra가 수행합니다. Sanitary Research Foundation of Santiago de Compostela(FIDIS)의 Proteomic Platform에서 일하는 Susana Belén Bravo López와 María García Vence. nCounter® 분석은 GENVIP 그룹(Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS에서 제공하는 서비스를 통해 수행됩니다.

연구 프로젝트는 최소 침습적(예: 기관지경 검사 없음)이지만 프로토콜은 스페인 갈리시아의 임상 연구 윤리 위원회에서 검토하고 승인해야 합니다. 후기 발병 중증 천식 진단 기준을 충족하고 메폴리주맙을 투여받을 예정이며 사전 동의서에 서명한 15명의 환자만이 본 연구에 등록됩니다. 다른 임상 팀이 동일한 프로토콜을 따를 것입니다. 인구통계학적, 임상적, 혈액학적, 생화학적 변수가 데이터베이스에 포함될 것입니다. 일반적인 알레르겐에 대한 피부 찌름 테스트 및 알레르겐 특정 IgE(ImmunoCAP, Thermo Fisher)의 존재를 사용하여 알레르기 민감성을 확인합니다. 폐 기능 매개변수(1초 강제 호기량(FEV1), 강제 폐활량(FVC) 및 FEV1/FVC 비율)도 분석됩니다. 폐활량 측정은 기관지 확장제 사용 전후에 수행됩니다. 천식 제어 테스트(ACT) 및 천식 삶의 질 설문지(AQLQ) 설문지가 수행됩니다. 천식 환자는 질병의 안정적인 단계(즉, 샘플 수집 전 최소 4주 동안 악화 없음). 악화는 표준 임상 지침에 따라 관리됩니다. 환자(n=15)는 4주 간격으로 메폴리주맙 100 mg 피하 주사를 받고 혈액 및 혈청 샘플(2-3 EDTA 튜브; 1 SST 튜브)은 T=0, 4, 16 및 32주에 채취됩니다. 치료에 대한 초기 반응(4주)과 후기 반응(16주 및 32주)을 모두 평가하기 위해.

행동 양식

• 튜브: EDTA(전혈) 및 SST(혈청)

• 호산구 정화

  • 호산구는 Miltenyi 인간 호산구 분리 키트(카탈로그 #130-104-466) 또는 EasySep™ 인간 호산구 분리 키트(카탈로그 #17956)를 사용하여 전혈(헤파린 튜브)에서 분리할 수 있습니다. 이 백혈구. 우리는 적어도 1.0-4.0 정도를 예상합니다. ~20 ml 혈액에서 x 106 세포, 높은 생존율 및 순도(>95%).

• ELISA 연구.

  • 혈청 샘플 수집: IGF-ALS(GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 웰), IGF-1(Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, 카탈로그 #DY291) 및 IGF-BP3(Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, 카탈로그 번호 DY675).

• 호산구로부터의 전체 RNA 정제 및 nCounter 나노스트링 분석(발견 기반/가설 생성 접근법):

  • 건강한 대조군(T=0)과 환자(T=0, 4, 16 및 32주)의 정제된 호산구는 -80ºC에서 RNAlater 솔루션(Ambion, Paisley, UK)에 보관됩니다. Total RNA는 RNeasy Mini kit(Qiagen)으로 분리하여 RNA 품질 및 농도 확인(Nanodrop) 후 -80ºC에서 보관합니다.
  • nCounter® 플랫폼(nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology)은 최대 800개의 RNA, DNA 또는 단백질 표적을 정량화할 수 있는 다중 방법론입니다. mRNA 분자와 관련하여 이 기술은 모든 mRNA를 2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드에 대한 용액 내 혼성화를 기반으로 합니다. 비오티닐화된 mRNA 특이적 프로브와 mRNA 특이적 올리고뉴클레오티드는 형광을 생성하는 6가지 형광색소(4가지 다른 색상)의 순차적 조합을 포함합니다. 검출되는 특정 mRNA를 식별하는 바코드. 초과된 두 프로브가 모두 제거되면 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 혼성화된 복합체가 캡처되고 nCounter 기기가 이러한 "바코드"를 읽을 수 있도록 카트리지에 정렬됩니다. 이러한 단계를 수행하기 위해 nCounter 플랫폼은 혼성화 복합체의 정제 및 카트리지 표면에 대한 고정화를 수행하는 Prep Station과 이를 식별하고 계수하는 스캐너인 Digital Analyzer(DA)의 두 가지 기기로 구성됩니다. 각 샘플에 대해 캡처된 바코드. 따라서 이 정량 분석은 mRNA-cDNA 변환(RT) 또는 DNA 증폭(qPCR)과 같은 다른 요구 사항 없이 어려운 샘플(예: 호산구)에서 각 miRNA를 개별적으로 정량화(절대 정량화, 개수)할 수 있으므로 데이터 가변성 감소(https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). 또한, 입력 물질의 양이 적고(25 ng-300 ng mRNA) FFPE 유래 RNA, 총 RNA, fragmented RNA, cell lysate 및 sorted cell에서 파생될 수 있습니다. 그 후, nCounter 데이터가 정규화되고, 배경 잡음이 차감되고, 추출 효율성을 설명하기 위해 추가 보정이 수행됩니다(miRNA 추출 전에 정의된 양으로 샘플에 추가될 스파이크인 miRNA의 발현을 기반으로 계산됨). ). 정규화는 R NanoStringNorm 패키지를 사용하여 수행됩니다. 정규화 후, 데이터의 log2 변환이 이루어지고 이어서 LIMMA Bioconductor 패키지를 통해 분석되어 mepolizumab 처리 시 차등 풍부도를 나타내는 mRNA를 식별합니다. 이 분석은 24시간 이상 걸리지 않습니다.

• RTqPCR 연구(가설 기반 접근법):

  • 메폴리주맙으로 치료받은 환자의 호산구(CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) 및 호산구의 조절 기능(FOXP3)의 알라민 매개 활성화와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 분석하기 위해 총 RNA가 cDNA로 전사됩니다. (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) -80ºC에서 보관합니다. qPCR(QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen)은 LightCycler® 96 기기(Roche Life Science)에서 수행되며 FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R 및 HPRT1 유전자(내인성 대조군)의 발현을 분석하는 데 사용됩니다.

• 유세포 분석 연구(가설 기반 접근법):

  • 건강한 대조군(n=15; T0) 및 메폴리주맙 투여 환자(n=15; T0, T4, T16, T32)의 EDTA 처리 말초 혈액 샘플.

  • 100 μL/튜브의 전체 말초 혈액(EDTA)을 특정 및 이소형 일치 제어 항체(BD)로 라벨링합니다. FACSlyse(BD)로 적혈구 용해. FACSCalibur 유세포 분석기(BD)를 사용한 분석. FSC/SSC를 사용하여 과립구를 선택합니다. 그런 다음 호중구에서 호산구를 분리하기 위해 SSC 대 CCR3(FITC). 관문 호산구:

    • 멀티마커 패널 1(호산구의 조절 단백질): CD16 및 갈렉틴-1/10의 측정[41-44].
    • 다중마커 패널 2(호산구의 활성화 수용체): CD48(건강한 대조군(HC)에 비해 중등도-중증 천식이 있는 총 호산구에서 감소됨[당사 연구, 54]), CD44 및 CD11b의 측정.
    • Multimarker 패널 3(호산구 하위 집합): Siglec-8, CD62L(L-selectin) 및 IL-5Rα의 발현을 기반으로 한 하위 집합 분석[40].

• 호산구 프로테옴의 분석(발견 기반/가설 생성 접근법):

  • proteomic 분석을 수행하려면 50 x 103 세포만큼 필요합니다. 약 1mL의 혈액에서 약 50-400 x 103 세포를 예상합니다.
  • 분리된 호산구(50 x 103 세포)는 원심분리에 의해 수집되고, 세척되고, 단백분해효소 억제제가 있는 용해 완충액에 재현탁됩니다. 그 후, 불용성 물질은 원심분리에 의해 제거되고 세포 상층액은 -80°C에 보관됩니다.
  • 호산구의 경우 총 프로테옴 특성화는 LC-MSMS 시스템에서 DDA 방법을 사용하여 트립신 소화 후에 이루어집니다. 이 접근법을 위해 우리는 15명의 건강한 기증자와 15명의 환자(T0, T4, T16, T32)의 샘플을 사용할 것입니다. 선택된 단백질은 1% FDR(Global False Discovery Rate) 이상을 보고한 단백질만 됩니다[55, 56].
  • 5개 연구 그룹(치료 후 시간 T0, T4, T16 및 T32의 건강한 기증자 및 환자)의 단백질 "풀"을 사용하여 5-6 밴드(1-DE)로 나누고 각 밴드에서 단백질을 추출합니다. 밴드, 해당 펩타이드를 생성하고 이를 MS/MS로 분석하여 많은 수의 단백질이 포함된 SWATH용 라이브러리를 생성한 다음 정량화를 수행합니다. 일단 라이브러리가 만들어지고 LC-MS/MS(TripleTOF)의 표준화된 조건을 유지하면, 우리는 샘플에서 SWATH-MS 분석("정보 의존 획득" 방법 또는 IDA; "Targeted label-free proteomics")을 수행할 것입니다. 15명의 건강한 기증자와 15명의 환자(T0, T4, T16, T32). 이 분석을 통해 연구 그룹 간에 상당한 차이가 있는 단백질을 식별할 수 있습니다. 선택한 단백질은 P<0.05이고 접힘 변화가 ≥1.5인 단백질만 선택됩니다[56-59].

연구 종점:

연구에 등록한 모든 개인의 인구통계학적 데이터는 기본 시점에서 얻을 것입니다. 또한 천식 이력, 폐 기능 매개 변수, 피부 찌름 테스트, 알레르겐 특이 IgE, AQLQ 점수, ACT 점수, 악화 횟수 및 프레드니손 소비를 포함한 여러 데이터가 수집됩니다. T0, 4, 16 및 32에서 다음과 같은 폐렴 서비스를 방문하는 동안 mepolizumab으로 치료받은 환자를 추적합니다. 여기에는 폐 기능(FEV1, FEV1/FVC), 생화학적 및 혈액학적 매개변수의 측정이 포함됩니다.

말초 혈액 및 혈청 샘플을 수집하고 호산구를 T0, T4, T16 및 T32에서 자기 정제하고 유세포 분석, RTqPCR, 단백질 분석 및 면역 분석을 수행합니다. 모든 실험 변수(예: proteomic 분석에서 호산구 단백질의 양, 호산구 활성화 마커 등)는 이러한 변수의 연관성을 평가하기 위해 임상 매개변수(예: 폐 기능, 천식 조절, 악화 횟수)와 상관관계가 있습니다. 치료에 대한 반응과 함께. 다음 기준 중 하나가 충족되면 메폴리주맙에 대한 긍정적인 반응을 고려할 것입니다.

• 적절한 천식 조절을 얻기 위해 ACT ≥20[60], 또는/ 최소한으로 중요한 차이를 나타내는 ≥3점의 변화.
• 연간 악화율을 48% 감소시키기 위해. 악화는 mepolizumab 임상시험에서 반영된 것과 유사하게 3 이상 동안 전신 코르티코스테로이드 치료 또는 예정되지 않은 의학적 상담이 필요한 증상의 증가로 정의된다[20, 61].
• 천식 악화로 인한 연간 병원 입원률이 임상 시험에 반영된 것과 유사하게 50% 감소합니다[62].
• 전신 코르티코스테로이드의 연간 중간 용량을 50% 감소시키기 위해 [63].

• 1차 종료점 연구:

  • 혈청 내 IGF-1, IGF-BP3 및 IGF-ALS 수준
  • Transcriptomic (nanoString)/mRNA 발현 데이터: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • 단백질 데이터
  • 유세포 분석 데이터: CD16, 갈렉틴-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L 및 IL-5Rα의 발현

• 2차 종점 연구:

  • 폐 기능 매개변수(FEV1, FEV1/FVC)
  • 혈액학적 매개변수(예: 호산구 수).
  • 기타 임상 및 생화학적 변수(예: IgE 또는 기타 면역글로불린).
  • 악화 횟수, 프레드니손 소비, ACT 점수, AQLQ 점수.

통계 계획 또는 데이터 분석:

Graph Pad Prism은 그래픽을 만드는 데 사용됩니다. IBM SPSS, Statistics 22.0 또는 R.이 통계 연구에 사용됩니다. 분석하는 동안 USC 통계 및 운영 연구 분야(Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

샘플 크기 샘플 크기(N)의 계산은 G*Power 3.1.9.4 [64]를 사용하여 수행되었습니다. 이러한 분석 중에 α(0.05), 검정력(1-β, 0.95), 측정 횟수(T0, T4, T16 및 T32) 및 효과 크기(f = 0.4; 더 임상적으로 관련된 결과를 제공하는 큰 효과 크기). 출력 N은 15이고 임계 F= 2.82705입니다.

임상, 유세포분석 및 전사체 데이터용. HC와 T0(치료 전)의 환자 사이의 횡단면 비교는 정규 분포를 따르며 분산의 동질성을 갖는 경우 t-테스트를 ​​사용하여 수행됩니다. 비정규 분산 변수의 경우 Mann-Whitney U 테스트를 사용합니다. 메폴리주맙(종단 연구; T0, T4, T16 및 T32)을 사용한 치료에 반응하는 상이한 연구 변수의 변화를 RM-ANOVA를 사용하여 테스트할 것이다. 다변량 분석(예: PCA, 감독되지 않은 클러스터링) 및 기능 강화 분석은 유세포 분석 및 무엇보다도 transcriptomic 데이터를 사용하여 수행됩니다.

전체 프로테옴 특성화 및 정량적 SWATH 분석을 위해 데이터베이스 검색을 위한 ParagonTM 알고리즘과 데이터 그룹화를 위한 ProgroupTM이 있는 ABSciex의 ProteinPilotTM 5.0.1 소프트웨어를 사용할 것입니다. 데이터는 Human 특정 Uniprot 데이터베이스를 사용하여 검색됩니다. 잘못된 발견률은 전체 잘못된 발견률이 1% 이상인 결과만 표시하는 비선형 피팅 방법을 사용하여 수행됩니다[65].

기능 분석은 다른 오픈 액세스 소프트웨어에 의해 수행됩니다. 기능 강화 및 상호 작용 네트워크 분석을 위한 FunRich(기능 강화 분석 도구)(http://funrich.org/index.html). 통계를 위해 FunRich는 초기하 테스트, BH 및 Bonferroni를 사용합니다[66, 67]. 유전자 온톨로지 농축 및 단백질-단백질 상호 작용, 네트워크를 위해 DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) 또는 GO(http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis)를 사용할 것입니다. 구축 및 클러스터링, String(https://string-db.org/)을 사용합니다. 또는 Cytoscape 3.7(https://cytoscape.org/) [68].

SWATH 데이터의 경우 MarkerView 소프트웨어는 주성분 분석(PCA)을 사용하여 샘플 전체에서 데이터를 비교하는 다변량 통계 분석을 제공합니다. 각 단백질의 평균 MS 피크 면적은 각 샘플의 SWATH-MS의 복제물에서 파생된 후 에 대해 파생된 모든 전이의 평균 면적 합계를 기준으로 샘플 간 비교를 위해 MarkerView 소프트웨어를 사용하여 Student's t-test 분석을 수행합니다. 각 단백질. t-테스트는 각 변수가 두 그룹을 얼마나 잘 구분하는지 나타내며 P-값으로 보고됩니다. 라이브러리의 경우, 1.5 상향 조절 또는 하향 조절된 단백질이 있는 차별적으로 풍부한 단백질 세트(p-값 <0.05)가 선택됩니다.

제한 사항

• 이전에 논평한 바와 같이, 연구 전반기(36주) 동안 15명의 피험자가 메폴리주맙을 투여받을 예정입니다. 우리는 적어도 90%의 피험자가 이 연구를 완료할 것으로 기대합니다. 그러나 환자 이탈 및 불순응(또는 불순응)은 임상 연구에서 흔히 발생하는 현상입니다. 이 경우 샘플 크기는 비례하여 부풀려집니다.
• 현재 프로젝트는 mepolizumab에 반응하는 분자 바이오마커의 발견에 대한 연구로 제안되었습니다. 이러한 종류의 연구는 표적/가설 기반 또는 광범위/비표적("오믹스" 기술) 접근 방식을 통해 채택될 수 있습니다. 우리는 이 소규모의 전향적/개념 증명 연구에서 예측 마커를 찾는 것이 어려울 수 있음을 알고 있습니다. 현재 프로젝트에서 우리는 이 위험을 최소화하기 위해 이중 접근법을 제안합니다. 한편으로는 현대적이고 비표적화된 방법론이 작동하고 저농도 단백질(SWATH MS)을 검출하기 위해 매우 민감하거나 어려운 샘플로 작업하기 위한 단순화된 프로토콜(호산구에서 우수한 품질의 RNA 생성은 풍부한 단백질의 존재로 인해 항상 어렵습니다. RNase 제품군의 구성원인 EDN과 같은) 샘플 크기를 줄이기 위해 기술적 분산(예: nCounter nanoString)을 줄입니다. 반면에 가설 기반 접근법(예: 유세포 분석법, RT-qPCR, ELISA)은 더 큰 신뢰도, 유형 I(즉, 잘못된 발견) 및 II 오류의 위험이 적고 향후 복제가 쉽다는 장점이 있습니다. 결과. 이러한 표적 방법론은 또한 비표적 전사체/단백체 접근법으로 얻은 임상적으로 관련이 있고(높은 효과 크기) 유의미한(p-값 < 0.05) 차이만 확인하는 데 사용될 것입니다.
• 또 다른 잠재적인 제한은 메폴리주맙(50 x 103 이하)으로 치료한 후 일부 환자에서 잠재적으로 낮을 수 있는 호산구의 수입니다. 따라서 proteomic 및 transcriptomic 실험을 수행하기에 충분한 세포를 얻기 위해서는 해당 환자에서 1 또는 2 mL 이상의 혈액을 정화해야 할 수 있습니다. 연구 프로토콜과 프로젝트 예산에서 이 문제를 고려했습니다.
• 마지막으로 TripleTOF는 호산구 프로테옴과 같은 복잡한 샘플을 더 깊이 파고들도록 설계된 고감도 질량 분석기입니다. nanoLC의 2차원 체계와 결합된 현재 질량 분석기의 높은 감도는 더 많은 수의 단백질(>1000)과 아토몰라 범위(10-18)의 농도에서 분석물을 검출할 수 있게 하여 케모카인 또는 사이토카인과 같은 풍부하지 않은 세포내 단백질을 검출하기에 충분합니다. 따라서 TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 및 IL-18은 nanoLC-MS/MS(Q-TOF)에 의해 검출되었지만 IL-5 또는 IL-13과 같은 다른 것들은 검출되지 않았습니다[69 ]. 이러한 예상되는 제한은 LC-MS/MS 응용 분야에서 풍부하지 않은 단백질의 펩티드 이온화를 억제하는 매우 풍부한 단백질(예: 호산구 과립 단백질)의 펩티드 존재로 인한 것입니다. 이로 인해 Charcot-Leyden 결정 단백질(CLC, galectin-10)과 같은 풍부한 종의 검출된 단백질 목록에 과잉 표시가 나타나며, 이는 조절 능력이 있는 호산구를 식별하기 때문에 현재 프로젝트에서 여전히 흥미롭습니다. 그러나 샘플 복잡성을 줄이고 저농도 단백질의 검출을 개선하기 위해 검출을 얻기 위해 사용할 수 있는 다양한 고갈(예: ACN 고갈, 한외여과, 1-DE) 및 농축 방법(예: CPLL)이 있습니다. 감광도. 선택적으로 고다중 면역 분석법(예: Olink 면역 반응, Olink 염증 또는 Olink 면역 종양 패널, https://www.olink.com/)과 같은 표적 접근법 한 번에 92개의 단백질 바이오마커만 측정할 수 있지만 적은 양의 생물학적 시료(예: 세포 용해물)로 높은 검출 감도를 얻을 수 있다는 장점이 있습니다.