Virkning af Mepolizumab på svær eosinofil astma (EMESEA)

Hypoteser

Hº1. Niveauerne af visse overflademolekyler på eosinofiler eller tilstedeværelsen eller fraværet af visse proteiner i proteomet af denne leukocytundergruppe forud for mepolizumab-behandling kan bruges som prædiktive/prognostiske markører for respons på denne biologiske.

Hº2. Mepolizumab ændrer mængden af ​​adskillige overflade- eller intracellulære proteiner i eosinofiler som et resultat relateret til ændringer i deres aktiveringsstatus, migrationsevne, regulatorisk/effektorfunktion eller undergruppesammensætning.

Hº3. Sen-debuterende svære eosinofile astmatikere har forhøjelser i serumkoncentrationen af ​​forskellige medlemmer af IGF-familien (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS), og mepolizumab-behandling reducerer disse niveauer og opfører sig som en respons-biomarkør sammen med antallet af eosinofiler og kliniske eksacerbationer.

Mål eller forskningsspørgsmål

OB (Aspirationsmål): Opdagelse af prædiktive/prognostiske biomarkører for respons på mepolizumab ved hjælp af flowcytometri, transkriptomiske og proteomiske teknologier.

• OB1.- At identificere ændringer i overflademarkører for eosinofiler og eosinofile subpopulationer som respons på behandling med mepolizumab ved hjælp af flowcytometriteknikker. Dette mål er fordelt i følgende leverancer (DE):

  • DE1.1: Udvalg af 15 sunde kontroller
  • DE1.2: Diagnose af sent opståede patienter med svær eosinofil astma og udvælgelse af 15 patienter, der opfylder kriterierne, er planlagt til at modtage mepolizumab og underskrive det informerede samtykke.
  • DE1.3: Generering af den indledende database for raske kontroller og astmapatienter med demografisk, klinisk, hæmatologisk og biokemisk information.
  • DE1.4: Indsamling og behandling af serum (1 SST-rør) og fuldblodsprøver (1-2 rør) fra raske donorer (T0) og mepolizumab-behandlede patienter (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Flowcytometri-assays med multimarkørpaneler 1 (regulatorisk), 2 (aktivering) og 3 (eosinofile undergrupper) (se nedenfor).
  • DE1.6: Fuldfør databasen med kliniske, hæmatologiske, biokemiske og flowcytometridata genereret på tidspunkterne T4, T16 og T32. Afsluttende uni- og multivariant statistisk analyse.
  • DE1.7: Offentliggørelse af resultater.

• OB2.- Transkriptomisk analyse til identifikation af mRNA'er i det eosinofile transkriptom, der viser forhøjede eller reducerede niveauer som respons på behandling med mepolizumab. Dette mål er fordelt i følgende leverancer (DE):

  • DE2.1: Opsæt en eosinofil isolationsprotokol og kontroller cellens renhed ved flowcytometri.
  • DE2.2: Oprensning af eosinofiler fra 15 raske donorer (T0) og 15 patienter (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Total RNA-ekstraktion fra eosinofile lysater, assay af kvalitet og kvantitet af RNA og opbevaring ved -80ºC.
  • DE2.4: Opdagelsesbaseret/hypotesegenererende tilgang. Evaluering af niveauerne af 770 humane proteinkodende mRNA'er knyttet til rekrutterings-, aktiverings- og effektorfunktionerne af myeloide celler ved hjælp af en direkte multiplekset molekylær måleplatform ved navn nCounter® NanoString) i kombination med en præfabrikeret "nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). På grund af de høje økonomiske omkostninger vil denne del af undersøgelsen kun blive udført med eosinofilprøver fra raske donorer (T = 0) og to tidspunkter hos patienter (T = 0 og T = 16).
  • DE2.5: Behandling af de opnåede data og indledende statistisk analyse.
  • DE2.6: Validering af nCounter®-data og hypotesedrevet tilgang med en etableret kvantitativ teknik. Udfør retrotranskriptions- og qPCR-analyser af de mRNA'er i eosinofiler, der viser de største abundansændringer som respons på mepolizumab-behandling ifølge nCounter®-studiet. Derudover vil nogle yderligere mRNA'er, der ikke er inkluderet i panelet "nanoString Myeloid Innate Immunity", såsom FOXP3 (regulatorisk funktion), CRLF2, ST2 eller IL-7R (cytokinreceptorer; aktivering), blive analyseret. HPRT1-genet vil blive brugt som et husholdningsgen i dette sæt af RTqPCR-eksperimenter.
  • DE2.7: Uni- og multivariant statistiske analyser.
  • DE2.8: Offentliggørelse af transkriptomiske resultater.

• OB3.- Proteomisk profilering for at identificere proteiner med differentiel overflod inden for eosinofile som respons på behandling med mepolizumab. Dette mål er fordelt i følgende leverancer (DE):

  • DE3.1: Lysis af eosinofiler, fjernelse af uopløseligt materiale ved centrifugering, proteinkvantificering (BCA) og lagring af cellesupernatanter ved -80°C.
  • DE3.2: Udvikl en total proteomanalyseprotokol med en Data Dependent Acquisition (DDA) metode ved hjælp af en væskekromatografi (LC)-MS/MS teknologi (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Tjek den biologiske variabilitet (biologiske replikationer) og teknik (tekniske replikaer) for at kontrollere reproducerbarheden af ​​testene.
  • DE3.4: Vedligeholdelse af de standardiserede betingelser for LC-MS / MS (TripleTOF), opret et bibliotek for SWATH (sekventiel vinduesopsamling af alle teoretiske massespektre) med så mange eosinofile proteiner som muligt.
  • DE3.5: Udfør SWATH-MS-analyse i prøver fra 15 raske donorer og 15 patienter (T0, T4, T16, T32) ("informationsafhængig indsamlingsmetode eller IDA; "Targeted label-free proteomics").
  • DE3.6: Behandling af de opnåede data og indledende statistisk analyse.
  • DE3.7: Kontrol af panelet af biomarkører opnået med en anden teknologi (f.eks. udvalgt reaktionsovervågning / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Endelig uni- og multivariant statistisk analyse. Identificer proteiner med signifikante forskelle mellem grupper (P < 0,05) og mindst en foldændring ≥ 1,5.
  • DE3.9: Offentliggørelse af proteomiske resultater

• OB4. Tjek, om sent opståede svære eosinofile astmatikere udviser forhøjede niveauer af IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS i serumprøver, hvis responsen af ​​mepolizumab afhænger af niveauerne af disse markører, og hvis behandling med denne biologiske reducerer koncentrationen i serum fra disse IGF-familiemedlemmer. Dette mål er fordelt i følgende leverancer (DE):

  • DE4.1: Analyse af IGF-1, IGF-BP3 og IGF-ALS ved ELISA
  • DE4.2: Uni- og multivariant statistisk analyse af eksperimentelle data
  • DE4.3: Offentliggørelse af resultater

Offentliggørelse af resultater:

Vi vil bestræbe os på at præsentere en meddelelse i løbet af det første år af undersøgelsen på en spansk åndedrætskongres (SEPAR) såvel som på den europæiske åndedrætskongres (ERS), der er et resultat af undersøgelsen af ​​de kliniske data fra patienter før og efter administration af mepolizumab . Derudover forventer vi at publicere 3 publikationer i Q1-tidsskrifter samt andre 2 eller 3 kongresmeddelelser som følge af eksperimentelle undersøgelser.

Undersøgelsespopulation Undersøgelsespopulationen vil omfatte raske kontroller (dvs. forsøgspersoner uden astma, allergi, systemiske sygdomme eller planlagt til mindre operationer) og sent opståede patienter med svær eosinofil astma, som vil blive rekrutteret fra forskellige områder i Galicien (Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo og Ourense), Spanien. Diagnose af patienter med svær eosinofil astma ved screening vil være baseret på flere inklusionskriterier og eksklusionskriterier, som vi beskriver nedenfor [12].

Inklusionskriterier:

• Diagnose af svær ukontrolleret astma i henhold til ERS/ATS kriterier [52].
• Vedvarende eosinofili i blod (>300 celler/μL) ved ≥ to lejligheder (mere end 4 uger mellem hver måling).
• Hyppige eksacerbationer (≥ to om året), defineret som en periode på ≥ 3 dage med manglende astmakontrol, der kræver behandling med systemiske kortikosteroider og/eller et akutmodtagelsesbesøg og/eller hospitalsindlæggelse.
• Underskrift af informeret samtykke og accepterer at overholde alle undersøgelsens besøg og alle de procedurer, som dette medfører.

Ekskluderingskriterier:

• Rygehistorie: Nuværende rygere eller tidligere rygere med en rygehistorie på ≥10 pakkeår (antal pakkeår = (antal cigaretter pr. dag/20) x antal år, der er røget). En tidligere ryger er defineret som en deltager, der holder op med at ryge mindst 6 måneder før besøg 1.
• Klinisk vigtig lungesygdom bortset fra astma (f. aktiv lungeinfektion, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), bronkiektasi, lungefibrose, cystisk fibrose, hypoventilationssyndrom forbundet med fedme, lungekræft, alfa 1-anti-trypsin-mangel og primær ciliær dyskinesi) eller nogensinde blevet diagnosticeret med lunge- eller systemisk sygdom , bortset fra astma, der er forbundet med forhøjede perifere eosinofiltal (f.eks. allergisk bronkopulmonal aspergillose/mykose, Churg-Strauss syndrom, hypereosinofilt syndrom).
• Enhver lidelse, herunder, men ikke begrænset til, kardiovaskulær, gastrointestinal, lever-, nyre-, neurologisk, muskuloskeletale, infektiøse, endokrine, metaboliske, hæmatologiske, psykiatriske eller større fysiske svækkelse, som ikke er stabil efter efterforskerens mening.
• Malignitet: En aktuel malignitet eller tidligere historie med kræft i remission.
• Akutte øvre eller nedre luftvejsinfektioner, der kræver antibiotika eller antiviral medicin inden for 30 dage før besøget 1.
• Xolair: Deltagere, der tidligere har modtaget omalizumab (Xolair) eller et andet monoklonalt antistof.
• Deltagere, der har modtaget systemiske kortikosteroider inden for 30 dage før besøg 1 [53].
• Graviditet: Deltagere, der er gravide eller ammer.
• Fedmeklasse 2 eller højere (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Prøvestørrelse

• Kohorte af raske kontroller (n=15) kun til analyse ved T = 0.

• Kohorte af n=15 forsøgspersoner med svær eosinofil astma, der starter med mepolizumab-behandling uden ændring af deres aktuelt ordinerede medicin. Opfølgende studiebesøg 4 (T4), 16 (T16) og 32 (T32) uger efter det oprindelige studiebesøg (T=0).

  • Begrundelsen for stikprøvestørrelsen er forklaret i det statistiske afsnit.

Forventet indskrivningsrate Da dette vil være et multicenterstudie, forventer vi at nå en indskrivningsrate på mindst 2 svære eosinofile astmatikere begyndende med mepolizumabbehandling pr. måned (4 uger) på hvert hospital (Total = 8 pr. måned). Dette betyder, at de 15 forsøgspersoner skal planlægges til at modtage mepolizumab i løbet af de første 36 uger af denne undersøgelse, idet de har tilstrækkelig tid til at gennemføre undersøgelsen på 72 uger (1,5 år). Vi forventer også, at mindst 90 % af forsøgspersonerne gennemfører denne undersøgelse.

Estimeret studiestartdato: december 2020 Estimeret studieafslutningsdato: 1,5 år (72 uger)

Studiedesign og metoder

Figur 2. Undersøgelsesdesign. Denne figur repræsenterer på en skematisk måde både den kliniske og den eksperimentelle del af undersøgelsen.

Dette er en observationel, longitudinel, prospektiv og multicenterundersøgelse til at evaluere både det tidlige respons (4 uger) og det sene respons (16 og 32 uger) på mepolizumab-behandling hos svære eosinofile astmatikere. Undersøgelsen vil blive ledet af Dr. Francisco Javier González Barcala (Pneumology Service ved CHUS). Dr. Barcala var national koordinator i ét klinisk forsøg samt hovedinvestigator og sub-investigator i henholdsvis 41 og 19 kliniske forsøg. Derudover har Dr. Barcala været hovedforsker af 7 forskningsprojekter, samarbejdspartner i andre 7 projekter og udgivet mere end 120 relevante publikationer (peer-reviewed og JCR-indekseret) inden for luftvejssygdomme, primært astma.

Undersøgelsen involverer også andre medlemmer af den multidisciplinære astmaenhed (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Især projektlederen Dr. Salgado har været involveret i 11 forskningsprojekter, har 28 forskningsartikler i højtydende tidsskrifter, der tilhører områderne immunologi, biokemi, proteomik og luftvejssygdomme. Derudover har de øvrige deltagere i dette projekt en bred erfaring inden for deres respektive områder, både grundforskning og translationel forskning. De er Dra. Marina Blanco Aparicio, ansvarlig for Astma-enheden på University Hospital Complex of A Coruña (CHUAC), Dr. Uxío Calvo, på University Hospital Complex of Ferrol (CHUF), og Coral González på University Hospital Complex of Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro på Hospital Alvaro Cunqueiro i Vigo; Dolores Corbacho på Hospital Povisa-Vigo. Det vil være nødvendigt at ansætte en forsker i prædoktoral fase i 12 måneder til at udføre prøveforberedelse i transkriptomiske og proteomiske undersøgelser samt RTqPCR, flowcytometri og ELISA assays. Denne forsker vil være under supervision af Dr. Francisco Javier Salgado Castro og Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplinary Astma Unit, CHUS). Proteomics eksperimenter vil blive udført af Dra. Susana Belén Bravo López og María García Vence, der arbejder på Proteomic Platform ved Sanitary Research Foundation i Santiago de Compostela (FIDIS). nCounter®-analysen vil blive udført gennem en service, der tilbydes af GENVIP-gruppen (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Forskningsprojektet vil være minimalt invasivt (f.eks. ingen bronkoskopiske undersøgelser), men protokollen skal gennemgås og godkendes af Ethics Committee of Clinical Research i Galicien, Spanien. Kun femten patienter, der opfylder kriterierne for sen-debut af svær astmadiagnose, er planlagt til at modtage mepolizumab og underskriver det informerede samtykke, vil blive tilmeldt denne undersøgelse. Den samme protokol vil blive fulgt af de forskellige kliniske teams. Demografiske, såvel som kliniske, hæmatologiske og biokemiske variabler vil blive inkluderet i en database. Hudpriktest for almindelige allergener og tilstedeværelsen af ​​allergenspecifik IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) vil blive brugt til at kontrollere for allergisk sensibilisering. Lungefunktionsparametre (forceret ekspiratorisk volumen i 1. sekund (FEV1), forceret vitalkapacitet (FVC) og FEV1/FVC-forhold) vil også blive analyseret. Spirometri vil blive udført før og efter brug af en bronkodilatator. Astmakontroltesten (ACT) og Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) spørgeskemaet vil blive udført. Astmatikere skal være i en stabil fase af sygdommen (dvs. fravær af eksacerbationer i mindst 4 uger før prøvetagning). Eksacerbationer vil blive håndteret i overensstemmelse med standard kliniske retningslinjer. Patienter (n=15) vil modtage 100 mg subkutan injektion af mepolizumab med 4 ugers mellemrum, og blod- og serumprøver (2-3 EDTA-rør; 1 SST-rør) vil blive udtaget ved T=0, 4, 16 og 32 uger, for at evaluere både tidlig respons (4 uger) og sen respons (16 og 32 uger) på behandlingen.

Metoder

• Rør: EDTA (komplet blod) og SST (serum)

• Oprensning af eosinofiler

  • Eosinofiler kan isoleres fra fuldblod (heparinrør) ved hjælp af Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (Katalog #130-104-466) eller EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (Katalog #17956), begge negative udvælgelsesprocedurer, der giver uberørte undergrupper disse leukocytter. Vi forventer omkring mindst 1,0-4,0 x 106 celler fra ~20 ml blod, men også høj levedygtighed og renhed (>95%).

• ELISA undersøgelser.

  • Serumprøvesamling: Måling af IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 brønd), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY291) og IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY675) ved hjælp af ELISA.

• Total RNA-oprensning fra eosinofiler og nCounter nanoString-analyse (opdagelsesbaseret/hypotesegenererende tilgang):

  • Oprensede eosinofiler fra raske kontroller (T=0) og patienter (T=0, 4, 16 og 32 uger) vil blive opbevaret ved -80ºC i RNAlater-opløsning (Ambion, Paisley, UK). Total RNA vil blive isoleret ved hjælp af et RNeasy Mini kit (Qiagen) og opbevaret ved -80ºC efter kontrol af RNA kvalitet og koncentration (Nanodrop).
  • nCounter®-platformen (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) er en multipleksmetodologi, der tillader kvantificering af op til 800 RNA-, DNA- eller proteinmål. Med hensyn til mRNA-molekyler er denne teknologi baseret på hybridisering i opløsning af hvert mRNA til to komplementære oligonukleotider: en biotinyleret mRNA-specifik probe og et mRNA-specifikt oligonukleotid, der indeholder en sekventiel kombination af seks fluorokromer (fire forskellige farver), der skaber en fluorescerende stregkode, der identificerer det specifikke mRNA, der detekteres. Når overskuddet af begge prober er fjernet, indfanges de hybridiserede komplekser gennem en biotin-streptavidin-interaktion og justeres på patronen for at nCounter-instrumentet kan læse disse "stregkoder". For at udføre disse trin består nCounter-platformen af ​​to instrumenter, Prep Station, som udfører oprensningen af ​​de hybridiserede komplekser og deres immobilisering på overfladen af ​​en patron, og Digital Analyzer (DA), en scanner, der identificerer og tæller stregkoder fanget for hver prøve. Denne kvantitative analyse Derfor kan hvert miRNA kvantificeres individuelt (absolut kvantificering; tæller) fra vanskelige prøver (f.eks. eosinofiler) uden behov for andre krav, såsom mRNA-cDNA-konvertering (RT) eller DNA-amplifikation (qPCR), hvilket fører til mindre datavariabilitet (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Derudover er mængden af ​​inputmateriale lav (25 ng-300 ng mRNA) og kan afledes fra FFPE-afledt RNA, totalt RNA, fragmenteret RNA, cellelysater og sorterede celler. Bagefter vil nCounter-data blive normaliseret, baggrundsstøj trækkes fra, og yderligere korrektion udføres for at tage højde for effektiviteten af ​​ekstraktionen (beregnet baseret på ekspressionen af ​​spike-in miRNA'er, der vil blive tilføjet til prøven i en defineret mængde før miRNA-ekstraktionen ). Normaliseringer vil blive udført ved hjælp af R NanoStringNorm-pakken. Efter normalisering vil en log2-transformation af dataene blive foretaget og efterfølgende analyseret ved hjælp af LIMMA Bioconductor-pakken for at identificere de mRNA'er, der udviser en differentiel overflod ved mepolizumab-behandling. Denne analyse vil ikke tage længere end 24 timer.

• RTqPCR undersøgelser (hypotesedrevet tilgang):

  • For at analysere niveauerne af mRNA'er, der koder for proteiner relateret til alarmin-medieret aktivering af eosinofiler (CRLF2, ST2, IL-7Ra/CD127) og med den regulerende funktion af eosinofiler (FOXP3) fra patienter behandlet med mepolizumab, vil total RNA blive transskriberet til cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) og opbevaret ved -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) udføres i et LightCycler® 96-instrument (Roche Life Science) og bruges til at analysere ekspressionen af ​​FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R og HPRT1-genet (endogen kontrol).

• Flowcytometriundersøgelser (hypotesedrevet tilgang):

  • EDTA-behandlede perifere blodprøver fra raske kontroller (n=15; T0) og mepolizumab-behandlede patienter (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Mærk 100 μL/rør med fuld perifert blod (EDTA) med både specifikke og isotype-matchede kontrolantistoffer (BD). Lyse røde blodlegemer med FACSlyse (BD). Analyse med et FACSCalibur flowcytometer (BD). Brug FSC/SSC til at vælge granulocytter; derefter SSC vs CCR3 (FITC) for at adskille eosinofiler fra neutrofiler. Gate eosinofiler:

    • Multimarkørpanel 1 (Regulatoriske proteiner i eosinofiler): Måling af CD16 og galectiner-1/10 [41-44].
    • Multimarkørpanel 2 (Aktiveringsreceptorer i eosinofiler): Måling af CD48 (reduceret i det samlede antal eosinofiler med moderat-alvorlig astma sammenlignet med raske kontroller (HC) [vores undersøgelser, 54]), CD44 og CD11b.
    • Multimarkørpanel 3 (Eosinophils undersæt): Analyse af undergrupper baseret på ekspressionen af ​​Siglec-8, CD62L(L-selectin) og IL-5Ra [40].

• Analyse af eosinofil proteom (opdagelsesbaseret/hypotesegenererende tilgang):

  • Så meget som 50 x 103 celler vil være nødvendige for at udføre proteomiske assays. Vi forventer omkring 50-400 x 103 celler fra ~1 ml blod.
  • Isolerede eosinofiler (50 x 103 celler) vil blive opsamlet ved centrifugering, vasket og resuspenderet i lysisbuffer med proteinaseinhibitorer. Derefter vil uopløseligt materiale blive fjernet ved centrifugering og cellesupernatanter opbevaret ved -80°C.
  • For eosinofiler vil total proteomkarakterisering blive foretaget efter trypsinfordøjelse ved hjælp af en DDA-metode i et LC-MSMS-system. Til denne tilgang vil vi bruge prøver fra 15 raske donorer og 15 patienter (T0, T4, T16, T32). De udvalgte proteiner vil kun være dem, der rapporterede en 1% global falsk opdagelsesrate (FDR) eller bedre [55, 56].
  • Protein-"puljer" fra de 5 undersøgelsesgrupper (raske donorer og patienter på tidspunktet T0, T4, T16 og T32 efter behandling) vil blive brugt, idet de opdeles (1-DE) i 5-6 bånd, og proteinerne ekstraheres fra hver bånd, genererer de tilsvarende peptider og analyserer dem ved MS/MS for at producere et bibliotek for SWATH med et højt antal proteiner, hvorpå kvantificeringen derefter vil blive udført. Når biblioteket er lavet og vedligeholder de standardiserede betingelser for LC-MS / MS (TripleTOF), vil vi udføre en SWATH-MS-analyse ("informationsafhængig erhvervelse"-metode eller IDA; "Targeted label-free proteomics") i prøver fra 15 raske donorer og 15 patienter (T0, T4, T16, T32). Denne analyse vil lade os identificere proteiner med betydelige forskelle mellem undersøgelsesgrupperne. De udvalgte proteiner vil kun være dem med en P<0,05 og en foldændring ≥1,5 [56-59].

Undersøgelsens endepunkter:

Demografiske data for alle personer, der er indskrevet i undersøgelsen, vil blive indhentet ved basal. Derudover vil der blive indsamlet adskillige data, herunder astmahistorie, lungefunktionsparametre, hudpriktest, allergenspecifik IgE, AQLQ-score, ACT-score, antallet af eksacerbationer og forbrug af prednison. Under de følgende besøg i pneumologitjenesten på T0, 4, 16 og 32 vil patienter behandlet med mepolizumab blive fulgt op. Dette omfatter målinger af lungefunktion (FEV1, FEV1/FVC), biokemiske og hæmatologiske parametre.

Perifere blod- og serumprøver vil blive indsamlet, og eosinofiler vil blive magnetisk oprenset ved T0, T4, T16 og T32, og flowcytometri, RTqPCR og proteomiske analyser samt immunoassays vil blive udført. Alle de eksperimentelle variabler (f.eks. mængden af ​​eosinofile proteiner i proteomiske assays, eosinofile aktiveringsmarkører, …) vil blive korreleret med kliniske parametre (f.eks. lungefunktion, astmakontrol, antal eksacerbationer) for at vurdere sammenhængen mellem disse variabler med respons på behandlingen. Vi vil overveje en positiv reaktion på mepolizumab, hvis et af følgende kriterier er opfyldt:

• For at opnå tilstrækkelig astmakontrol ACT ≥20 [60], eller/en ændring på ≥3 point, hvilket repræsenterer en minimalt vigtig forskel.
• For at opnå en reduktion i den årlige frekvens af eksacerbationer på 48%. Forværring er defineret som stigningen i symptomer, der kræver behandling med systemiske kortikosteroider i ≥3, eller en uplanlagt lægekonsultation, svarende til den, der afspejles i kliniske forsøg med mepolizumab [20, 61].
• Få en 50 % reduktion i den årlige frekvens for hospitalsindlæggelser på grund af astmaforværring, svarende til det, der afspejles i kliniske forsøg [62].
• At opnå en reduktion i den gennemsnitlige årlige dosis af systemiske kortikosteroider på 50 % [63].

• Undersøg primære endepunkter:

  • IGF-1, IGF-BP3 og IGF-ALS niveauer i serum
  • Transkriptomiske (nanoString)/mRNA-ekspressionsdata: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomiske data
  • Flowcytometridata: Ekspression af CD16, galectiner-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L og IL-5Ra

• Undersøg sekundære endepunkter:

  • Lungefunktionsparametre (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hæmatologiske parametre (f.eks. antal eosinofiler).
  • Andre kliniske og biokemiske variabler (f.eks. IgE eller andre immunglobuliner).
  • Antal eksacerbationer, prednisonforbrug, ACT-score, AQLQ-score.

Statistisk plan eller dataanalyse:

Graph Pad Prism vil blive brugt til at skabe grafik. IBM SPSS, Statistics 22.0 eller R. vil blive brugt til den statistiske undersøgelse. Under analyserne vil vi blive assisteret af USC Statistics and Operational Research-området (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Prøvestørrelse Beregningen af ​​stikprøvestørrelse (N) er udført ved at bruge G*Power 3.1.9.4 [64]. Under disse analyser beregner vi N nødvendigt at få statistisk signifikans i en F-test (ANOVA: Gentagne mål, indenfor faktorer), givet α (0,05), effekt (1-β, 0,95), antallet af målinger (T0, T4, T16 og T32), og effektstørrelsen (f = 0,4; stor effektstørrelse, hvilket giver mere klinisk relevante resultater). Output N var 15, med en kritisk F= 2,82705.

Til klinisk, flowcytometri og transkriptomiske data. Tværsnitssammenligninger mellem HC og patienter i T0 (før behandling) efter en normalfordeling og med homogenitet af varianser vil blive foretaget ved at bruge t-test. For ikke-normalfordelte variabler vil vi bruge Mann-Whitney U-test. Ændringer i de forskellige undersøgelsesvariabler som respons på behandling med mepolizumab (langsgående undersøgelse; T0, T4, T16 og T32) vil blive testet med RM-ANOVA. Multivariat analyse (f.eks. PCA, uovervåget clustering) samt funktionel berigelsesanalyse vil blive udført med flowcytometri og frem for alt transkriptomiske data.

Til total proteom karakterisering og kvantitativ SWATH analyse Vi vil bruge ProteinPilotTM 5.0.1 software fra ABSciex, som har algoritmen ParagonTM til databasesøgning og ProgroupTM til datagruppering. Data vil blive søgt ved hjælp af en Human-specifik Uniprot-database. Falsk opdagelsesrate vil blive udført ved hjælp af en ikke-lineær tilpasningsmetode, der kun viser de resultater, der rapporterede en global falsk opdagelsesrate på 1 % eller bedre [65].

Funktionel analyse vil blive udført af forskellig open-access software. FunRich (Functional Enrichment analyseværktøj) til funktionel berigelse og interaktionsnetværksanalyse (http://funrich.org/index.html). Til statistik bruger FunRich hypergeometrisk test, BH og Bonferroni [66, 67]. Vi vil bruge DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) eller GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) til genontologiberigelse og til protein-protein-interaktion, netværk konstruktion og klyngedannelse, vil vi bruge String (https://string-db.org/) eller Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

For SWATH-data vil MarkerView-softwaren give os en multivariat statistisk analyse ved hjælp af principal komponentanalyse (PCA) til at sammenligne dataene på tværs af prøverne. Det gennemsnitlige MS-topareal for hvert protein vil blive afledt fra replikaterne af SWATH-MS for hver prøve efterfulgt af Students t-testanalyse ved hjælp af MarkerView-softwaren til sammenligning mellem prøverne baseret på de gennemsnitlige arealsummer af alle overgange afledt for hvert protein. T-testen vil indikere, hvor godt hver variabel adskiller de to grupper, rapporteret som en P-værdi. For biblioteket vil dets sæt af differentielt rigelige proteiner (p-værdi <0,05) med 1,5 opregulerede eller nedregulerede proteiner blive udvalgt.

Begrænsninger

• Som tidligere nævnt vil 15 forsøgspersoner være planlagt til at modtage mepolizumab i løbet af første halvdel af undersøgelsen (36 uger). Vi forventer, at mindst 90 % af forsøgspersonerne gennemfører denne undersøgelse. Patientfrafald og manglende overholdelse (eller manglende overholdelse) er dog almindelige hændelser i kliniske undersøgelser. I et sådant tilfælde vil prøvestørrelsen blive proportionalt oppustet.
• Dette projekt er blevet foreslået som en undersøgelse af opdagelsen af ​​molekylære biomarkører som reaktion på mepolizumab. Denne form for undersøgelser kan gå ombord gennem målrettede/hypotesedrevne eller bredere/ikke-målrettede ("-omics"-teknologier) tilgange. Vi er klar over, at det kan være udfordrende at finde prædiktive markører i denne lille og prospektive/proof of concept-undersøgelse. I dette projekt foreslår vi en dobbelt tilgang for at minimere denne risiko. På den ene side, moderne og umålrettede metoder til at fungere og meget følsomme til at detektere lav-abundant proteiner (SWATH MS) eller forenklede protokoller til at arbejde med vanskelige prøver (generering af god kvalitet RNA fra eosinofiler er altid udfordrende på grund af tilstedeværelsen af ​​rigelige proteiner ligesom EDN, et medlem af RNase-familien) og reducere teknisk varians (f.eks. nCounter nanoString) for at forkorte stikprøvestørrelser. På den anden side hypotesedrevne tilgange (f.eks. flowcytometri, RT-qPCR, ELISA), med fordelene ved større troværdighed, mindre risiko for type I (dvs. falsk opdagelse) og II fejl og let fremtidig replikation af resultater. Disse målrettede metoder vil også blive brugt til kun at bekræfte klinisk relevante (høj effekt-størrelse) og signifikante (p-værdi < 0,05) forskelle opnået med ikke-målrettede transkriptomiske/proteomiske tilgange.
• En anden potentiel begrænsning er antallet af eosinofiler, som potentielt kan være lavt hos nogle patienter efter behandling med mepolizumab (50 x 103 eller lavere). Derfor kan det være nødvendigt at rense mere end 1 eller 2 ml blod hos disse patienter for at opnå nok celler til at udføre de proteomiske og transkriptomiske eksperimenter. Vi har overvejet dette spørgsmål i undersøgelsesprotokollen og i projektets budget.
• Endelig er TripleTOF et meget følsomt massespektrometer designet til at grave dybere ned i komplekse prøver som det eosinofile proteom. Den høje følsomhed af nuværende massespektrometre kombineret med todimensionelle skemaer af nanoLC tillader påvisning af højere antal proteiner (>1000) og analytter ved koncentrationer i det attomolære område (10-18), nok til at detektere lavt rigelige intracellulære proteiner som kemokiner eller cytokiner. Således er TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 og IL-18 blevet påvist af nanoLC-MS/MS (Q-TOF), men ikke andre som IL-5 eller IL-13 [69 ]. Denne forventede begrænsning skyldes tilstedeværelsen af ​​peptider fra meget rigelige proteiner (f.eks. eosinofile granulaproteiner), der undertrykker ioniseringen af ​​peptider fra lavt rigelige proteiner i LC-MS/MS-applikationer. Dette fører til overrepræsentationen i listen over påviste proteiner af rigelige arter såsom Charcot-Leyden krystalproteinet (CLC, galectin-10), som stadig er interessant for det nuværende projekt, da identificerer eosinofiler med regulatoriske kapaciteter. For at reducere prøvekompleksiteten og forbedre påvisningen af ​​proteiner med lav overflod er der imidlertid forskellige udtømning (f.eks. ACN-depletering, ultrafiltrering, 1-DE) og berigelsesmetoder (f.eks. CPLL'er), som vi kunne bruge til at opnå detektion følsomhed. Eventuelt målrettede tilgange såsom høj-multipleks immunoassays (f.eks. Olink Immune Response, Olink Inflammation eller Olink Immuno-Oncology paneler; https://www.olink.com/) har fordelen af ​​en høj detektionsfølsomhed med lavt volumen af ​​biologiske prøver (f.eks. cellelysater), selvom det kun tillader måling af 92 proteinbiomarkører på én gang.