Efeito do mepolizumabe na asma eosinofílica grave (EMESEA)

hipóteses

Hº1. Os níveis de certas moléculas de superfície em eosinófilos ou a presença ou ausência de certas proteínas no proteoma deste subconjunto de leucócitos antes do tratamento com mepolizumabe podem ser usados ​​como marcadores preditivos/prognósticos de resposta a este biológico.

Hº2. Mepolizumab altera a abundância de várias proteínas de superfície ou intracelulares em eosinófilos como um resultado relacionado a mudanças em seu status de ativação, capacidade migratória, função regulatória/efetora ou composição de subconjunto.

Hº3. Asmáticos eosinofílicos graves de início tardio apresentam elevações na concentração sérica de diferentes membros da família IGF (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) e o tratamento com mepolizumabe reduz esses níveis e se comporta como um biomarcador de resposta junto com o número de eosinófilos e exacerbações clínicas.

Objetivos ou questões de pesquisa

OB (objetivo aspiracional): Descoberta de biomarcadores preditivos/prognósticos de resposta ao mepolizumabe usando tecnologias de citometria de fluxo, transcriptômica e proteômica.

• OB1.- Identificar mudanças nos marcadores de superfície de eosinófilos e subpopulações de eosinófilos em resposta ao tratamento com mepolizumabe usando técnicas de citometria de fluxo. Este objetivo está distribuído nas seguintes entregas (DE):

  • DE1.1: Seleção de 15 controles saudáveis
  • DE1.2: Diagnóstico de pacientes com asma eosinofílica grave de início tardio e seleção de 15 pacientes que atendem aos critérios, agendados para receber mepolizumabe e assinam o consentimento informado.
  • DE1.3: Geração do banco de dados inicial para controles saudáveis ​​e pacientes com asma com informações demográficas, clínicas, hematológicas e bioquímicas.
  • DE1.4: Coleta e processamento de soro (1 tubo SST) e amostras de sangue total (1-2 tubos) de doadores saudáveis ​​(T0) e pacientes tratados com mepolizumabe (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Ensaios de citometria de fluxo com painéis multimarcadores 1 (regulatório), 2 (ativação) e 3 (subconjuntos de eosinófilos) (ver abaixo).
  • DE1.6: Completar o banco de dados com dados clínicos, hematológicos, bioquímicos e de citometria de fluxo gerados nos tempos T4, T16 e T32. Análise estatística final uni e multivariada.
  • DE1.7: Publicação de resultados.

• OB2.- Análise transcriptômica para identificar mRNAs dentro do transcriptoma eosinófilo exibindo níveis aumentados ou reduzidos em resposta ao tratamento com mepolizumab. Este objetivo está distribuído nas seguintes entregas (DE):

  • DE2.1: Configure um protocolo de isolamento de eosinófilos e verifique a pureza celular por citometria de fluxo.
  • DE2.2: Purificação de eosinófilos de 15 doadores saudáveis ​​(T0) e 15 pacientes (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Extração de RNA total de lisados ​​de eosinófilos, análise da qualidade e quantidade de RNA e armazenamento a -80ºC.
  • DE2.4: Abordagem baseada na descoberta/geração de hipóteses. Avaliação dos níveis de 770 mRNAs codificadores de proteínas humanas ligados ao recrutamento, ativação e funções efetoras de células mielóides por meio de uma plataforma de medição molecular multiplexada direta chamada nCounter® NanoString) em combinação com um pré-fabricado "nCounter® Human Myeloid Painel de imunidade inata (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Devido ao alto custo econômico, esta parte do estudo será realizada apenas com amostras de eosinófilos de doadores saudáveis ​​(T = 0) e dois momentos em pacientes (T = 0 e T = 16).
  • DE2.5: Tratamento dos dados obtidos e análise estatística inicial.
  • DE2.6: Validação de dados nCounter® e abordagem baseada em hipóteses com uma técnica quantitativa estabelecida. Realize análises de retrotranscrição e qPCR desses mRNAs em eosinófilos exibindo as maiores mudanças de abundância em resposta ao tratamento com mepolizumabe de acordo com o estudo nCounter®. Além disso, alguns mRNAs adicionais não incluídos no painel "nanoString Myeloid Innate Immunity", como FOXP3 (função reguladora), CRLF2, ST2 ou IL-7R (receptores de citocina; ativação), serão analisados. O gene HPRT1 será usado como um gene de manutenção neste conjunto de experimentos de RTqPCR.
  • DE2.7: Análises estatísticas uni e multivariadas.
  • DE2.8: Publicação dos resultados transcriptômicos.

• OB3.- Perfil proteômico para identificar proteínas com abundância diferencial dentro dos eosinófilos em resposta ao tratamento com mepolizumab. Este objetivo está distribuído nas seguintes entregas (DE):

  • DE3.1: Lise de eosinófilos, remoção de material insolúvel por centrifugação, quantificação de proteínas (BCA) e armazenamento dos sobrenadantes celulares a -80°C.
  • DE3.2: Desenvolver um protocolo de análise de proteoma total com um método de Aquisição Dependente de Dados (DDA) usando uma tecnologia de cromatografia líquida (LC)-MS / MS (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Verificar a variabilidade biológica (replicações biológicas) e técnica (réplicas técnicas) para verificar a reprodutibilidade dos testes.
  • DE3.4: Mantendo as condições padronizadas de LC-MS/MS (TripleTOF), crie uma biblioteca para SWATH (janela sequencial de aquisição de todos os espectros de massa teóricos) com o maior número possível de proteínas de eosinófilos.
  • DE3.5: Realizar análise SWATH-MS em amostras de 15 doadores saudáveis ​​e 15 pacientes (T0, T4, T16, T32) (método de "aquisição dependente de informação" ou IDA; "Proteômica direcionada sem marcação").
  • DE3.6: Tratamento dos dados obtidos e análise estatística inicial.
  • DE3.7: Verificação do painel de biomarcadores obtidos com uma tecnologia diferente (por exemplo, Monitoramento de reação selecionada / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Análise estatística final uni e multivariada. Identifique as proteínas com diferenças significativas entre os grupos (P < 0,05) e pelo menos uma mudança de dobra ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publicação de resultados proteômicos

• OB4. Verificar se asmáticos eosinofílicos graves de início tardio apresentam níveis elevados de IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS em amostras de soro, se a resposta do mepolizumabe depende dos níveis desses marcadores e se o tratamento com esse biológico reduz a concentração em soro destes membros da família IGF. Este objetivo está distribuído nas seguintes entregas (DE):

  • DE4.1: Análise de IGF-1, IGF-BP3 e IGF-ALS por ELISA
  • DE4.2: Análise estatística uni e multivariada de dados experimentais
  • DE4.3: Publicação de resultados

Publicação dos resultados:

Nos esforçaremos para apresentar uma comunicação durante o primeiro ano do estudo em um Congresso Respiratório Espanhol (SEPAR) e também no Congresso Respiratório Europeu (ERS) resultante do estudo dos dados clínicos de pacientes antes e após a administração de mepolizumabe . Além disso, esperamos publicar 3 publicações em revistas Q1, bem como outras 2 ou 3 comunicações de congressos resultantes de estudos experimentais.

População em estudo A população em estudo incluirá controlos saudáveis ​​(ou seja, indivíduos sem asma, alergia, doenças sistémicas ou agendados para pequenas cirurgias) e doentes com asma eosinofílica grave de início tardio, que serão recrutados em diferentes áreas da Galiza (Santiago de Compostela, A Corunha, Lugo, Vigo e Ourense), Espanha. O diagnóstico de pacientes com asma eosinofílica grave na triagem será baseado em vários critérios de inclusão e exclusão que descrevemos abaixo [12].

Critério de inclusão:

• Diagnóstico de asma grave não controlada de acordo com os critérios ERS/ATS [52].
• Eosinofilia persistente no sangue (>300 células/μL) em ≥ duas ocasiões (mais de 4 semanas entre cada medição).
• Exacerbações frequentes (≥ duas por ano), definidas como um período de ≥ 3 dias de falta de controle da asma que requer tratamento com corticosteroides sistêmicos e/ou visita ao pronto-socorro (DE) e/ou hospitalização.
• Assinatura do consentimento informado e concorda em cumprir todas as visitas do estudo e todos os procedimentos que isso implica.

Critério de exclusão:

• Histórico tabágico: fumantes atuais ou ex-fumantes com histórico tabágico ≥10 anos-maço (número de anos-maço = (número de cigarros por dia/20) x número de anos fumados). Um ex-fumante é definido como um participante que parou de fumar pelo menos 6 meses antes da Visita 1.
• Doença pulmonar clinicamente importante além da asma (por exemplo, infecção pulmonar ativa, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), bronquiectasia, fibrose pulmonar, fibrose cística, síndrome de hipoventilação associada à obesidade, câncer de pulmão, deficiência de alfa 1 antitripsina e discinesia ciliar primária) ou já foi diagnosticado com doença pulmonar ou sistêmica , além da asma, que estão associados a contagens periféricas elevadas de eosinófilos (p. aspergilose/micose broncopulmonar alérgica, síndrome de Churg-Strauss, síndrome hipereosinofílica).
• Qualquer distúrbio, incluindo, mas não limitado a, comprometimento cardiovascular, gastrointestinal, hepático, renal, neurológico, musculoesquelético, infeccioso, endócrino, metabólico, hematológico, psiquiátrico ou físico grave que não seja estável na opinião do investigador.
• Malignidade: Uma malignidade atual ou história prévia de câncer em remissão.
• Infecções respiratórias agudas superiores ou inferiores que requerem antibióticos ou medicação antiviral dentro de 30 dias antes da Visita 1.
• Xolair: Participantes que receberam omalizumab (Xolair) ou outro anticorpo monoclonal anteriormente.
• Participantes que receberam corticosteroides sistêmicos dentro de 30 dias antes da Visita 1 [53].
• Gravidez: Participantes que estão grávidas ou amamentando.
• Obesidade classe 2 ou superior (IMC≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Tamanho da amostra

• Coorte de controles saudáveis ​​(n=15) apenas para análise em T = 0.

• Coorte de n=15 indivíduos com asma eosinofílica grave que iniciaram a terapia com mepolizumabe sem modificações em seus medicamentos atualmente prescritos. Visitas de estudo de acompanhamento em 4 (T4), 16 (T16) e 32 (T32) semanas após a visita de estudo original (T=0).

  • A justificativa para o tamanho da amostra é explicada na seção estatística.

Taxa antecipada de inclusão Como este será um estudo multicêntrico, esperamos atingir uma taxa de inscrição de pelo menos 2 asmáticos eosinofílicos graves iniciando a terapia com mepolizumabe por mês (4 semanas) em cada hospital (total = 8 por mês). Isso significa que os 15 indivíduos devem ser agendados para receber mepolizumabe ao longo das primeiras 36 semanas deste estudo, tendo tempo suficiente para concluir o estudo em 72 semanas (1,5 anos). Também esperamos que pelo menos 90% dos indivíduos concluam este estudo.

Data estimada de início do estudo: dezembro de 2020 Data estimada de conclusão do estudo: 1,5 anos (72 semanas)

Projeto de estudo e métodos

Figura 2. Desenho do estudo. Esta figura representa de forma esquemática tanto a parte clínica quanto a parte experimental do estudo.

Este é um estudo observacional, longitudinal, prospectivo e multicêntrico para avaliar a resposta precoce (4 semanas) e a resposta tardia (16 e 32 semanas) à terapia com mepolizumabe em asmáticos eosinofílicos graves. O estudo será dirigido pelo Dr. Francisco Javier González Barcala (Serviço de Pneumologia do CHUS). Dr. Barcala foi coordenador nacional em um ensaio clínico, bem como investigador principal e subinvestigador em 41 e 19 ensaios clínicos, respectivamente. Além disso, o Dr. Barcala foi investigador principal de 7 projetos de pesquisa, colaborador em outros 7 projetos e publicou mais de 120 publicações relevantes (revisadas por pares e indexadas pelo JCR) no campo de doenças respiratórias, principalmente asma.

O estudo também envolve outros membros da Unidade Multidisciplinar de Asma (Dra. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Em particular, o Gerente de Projeto Dr. Salgado esteve envolvido em 11 projetos de pesquisa, tem 28 artigos de pesquisa em revistas de alto impacto pertencentes às áreas de Imunologia, Bioquímica, Proteômica e Doenças Respiratórias. Além disso, os demais participantes deste projeto possuem ampla experiência em suas respectivas áreas, tanto pesquisa básica quanto translacional. Eles são Dra. Marina Blanco Aparicio, responsável pela Unidade de Asma do Complexo Hospitalar Universitário da Corunha (CHUAC), Dr. Uxío Calvo, do Complexo Hospitalar Universitário de Ferrol (CHUF), e Coral González do Complexo Hospitalar Universitário de Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro no Hospital Alvaro Cunqueiro de Vigo; Dolores Corbacho no Hospital Povisa-Vigo . Será necessária a contratação de um pesquisador em fase de pré-doutorado por 12 meses para realizar o preparo de amostras em estudos transcriptômicos e proteômicos, bem como os ensaios de RTqPCR, citometria de fluxo e ELISA. Este pesquisador estará sob a supervisão do Dr. Francisco Javier Salgado Castro e do Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Unidade Multidisciplinar de Asma, CHUS). Os experimentos de proteômica serão conduzidos pela Dra. Susana Belén Bravo López e María García Vence, que trabalham na Plataforma Proteômica da Fundação de Pesquisas Sanitárias de Santiago de Compostela (FIDIS). A análise do nCounter® será realizada por meio de um serviço oferecido pelo grupo GENVIP (Grupo de Genética, Vacinas e Infecções em Pediatria; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

O projeto de pesquisa será minimamente invasivo (por exemplo, sem exames broncoscópicos), mas o protocolo precisa ser revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Galiza, Espanha. Apenas quinze pacientes que atendem aos critérios de diagnóstico de asma grave de início tardio, estão programados para receber mepolizumabe e assinam o consentimento informado serão incluídos neste estudo. O mesmo protocolo será seguido pelas diferentes equipas clínicas. Variáveis ​​demográficas, bem como clínicas, hematológicas e bioquímicas serão incluídas em um banco de dados. O teste cutâneo para alérgenos comuns e a presença de IgE específica para alérgenos (ImmunoCAP, Thermo Fisher) serão usados ​​para verificar se há sensibilização alérgica. Parâmetros de função pulmonar (volume expiratório forçado no 1º segundo (VEF1), capacidade vital forçada (CVF) e relação VEF1/CVF) também serão analisados. A espirometria será realizada antes e após o uso de broncodilatador. Serão realizados o Asthma Control Test (ACT) e o Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ). Os asmáticos devem estar em uma fase estável da doença (ou seja, ausência de exacerbações por pelo menos 4 semanas antes da coleta da amostra). As exacerbações serão tratadas de acordo com as diretrizes clínicas padrão. Os pacientes (n=15) receberão injeção subcutânea de 100 mg de mepolizumabe em intervalos de 4 semanas, e amostras de sangue e soro (2-3 tubos de EDTA; 1 tubo de SST) serão retiradas em T=0, 4, 16 e 32 semanas, para avaliar a resposta precoce (4 semanas) e a resposta tardia (16 e 32 semanas) ao tratamento.

Métodos

• Tubos: EDTA (sangue completo) e SST (soro)

• purificação de eosinófilos

  • Os eosinófilos podem ser isolados do sangue total (tubos de heparina) usando o kit de isolamento de eosinófilos humanos Miltenyi (nº de catálogo 130-104-466) ou o kit de isolamento de eosinófilos humanos EasySep™ (nº de catálogo 17956), ambos procedimentos de seleção negativa que produzem subconjuntos intocados de esses leucócitos. Esperamos cerca de pelo menos 1,0-4,0 x 106 células de ~20 ml de sangue, mas também alta viabilidade e pureza (>95%).

• estudos ELISA.

  • Coleta de amostra de soro: Medição de IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 well), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, catálogo #DY291) e IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, catálogo #DY675) por meio de ELISA.

• Purificação de RNA total de eosinófilos e análise nCounter nanoString (abordagem baseada em descoberta/geração de hipóteses):

  • Eosinófilos purificados de controles saudáveis ​​(T=0) e pacientes (T=0, 4, 16 e 32 semanas) serão armazenados a -80ºC em solução de RNAlater (Ambion, Paisley, UK). O RNA total será isolado por meio do kit RNeasy Mini (Qiagen) e armazenado a -80ºC após verificação da qualidade e concentração do RNA (Nanodrop).
  • A plataforma nCounter® (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) é uma metodologia multiplex que permite a quantificação de até 800 alvos de RNA, DNA ou proteína. No que diz respeito às moléculas de mRNA, esta tecnologia baseia-se na hibridização em solução de cada mRNA a dois oligonucleótidos complementares: uma sonda específica de mRNA biotinilada e um oligonucleótido específico de mRNA contendo uma combinação sequencial de seis fluorocromos (quatro cores diferentes) que criam uma coloração fluorescente código de barras que identifica o mRNA específico que está sendo detectado. Uma vez removido o excesso de ambas as sondas, os complexos hibridizados são capturados através de uma interação biotina-estreptavidina e alinhados no cartucho para que o instrumento nCounter possa ler esses "códigos de barras". Para realizar essas etapas, a plataforma nCounter é composta por dois instrumentos o Prep Station, que realiza a purificação dos complexos hibridizados e sua imobilização na superfície de um cartucho, e o Digital Analyzer (DA), um scanner que identifica e conta os códigos de barras capturados para cada amostra. Esta análise quantitativa Portanto, cada miRNA pode ser quantificado individualmente (quantificação absoluta; contagens) de amostras difíceis (por exemplo, eosinófilos) sem a necessidade de outros requisitos, como conversão de mRNA-cDNA (RT) ou amplificação de DNA (qPCR), levando a menos variabilidade de dados (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Além disso, a quantidade de material de entrada é baixa (25 ng-300 ng mRNA) e pode ser derivada de RNA derivado de FFPE, RNA total, RNA fragmentado, lisados ​​​​celulares e células classificadas. Posteriormente, os dados do nCounter serão normalizados, o ruído de fundo subtraído e correções adicionais serão realizadas para contabilizar a eficiência da extração (calculada com base na expressão de miRNAs spike-in que serão adicionados à amostra em uma quantidade definida antes da extração do miRNA ). As normalizações serão feitas usando o pacote R NanoStringNorm. Após a normalização, uma transformação log2 dos dados será feita e posteriormente analisada por meio do pacote LIMMA Bioconductor para identificar os mRNAs que exibem uma abundância diferencial após o tratamento com mepolizumab. Esta análise não levará mais de 24 horas.

• Estudos de RTqPCR (abordagem baseada em hipóteses):

  • Para analisar os níveis de mRNAs que codificam proteínas relacionadas com a ativação de eosinófilos mediada por alarmina (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) e com a função reguladora de eosinófilos (FOXP3) de pacientes tratados com mepolizumabe, o RNA total será transcrito em cDNA (Kit de Transcrição QuantiTect Rev.; Qiagen) e armazenados a -80ºC. A qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) será realizada em LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) e utilizada para analisar a expressão de FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R e o gene HPRT1 (controle endógeno).

• Estudos de citometria de fluxo (abordagem orientada por hipóteses):

  • Amostras de sangue periférico tratadas com EDTA de controles saudáveis ​​(n=15; T0) e pacientes tratados com mepolizumabe (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Rotule 100 μL/tubo de sangue periférico total (EDTA) com anticorpos de controle (BD) específicos e com correspondência de isotipo. Lise dos glóbulos vermelhos com FACSlyse (BD). Análise com um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD). Use FSC/SSC para selecionar granulócitos; então SSC vs CCR3 (FITC) para separar eosinófilos de neutrófilos. Eosinófilos de portão:

    • Painel multimarcador 1 (Proteínas reguladoras em eosinófilos): Medição de CD16 e galectinas-1/10 [41-44].
    • Painel multimarcador 2 (Receptores de ativação em eosinófilos): Medição de CD48 (reduzido no total de eosinófilos com asma moderada a grave em comparação com controles saudáveis ​​(HC) [nossos estudos, 54]), CD44 e CD11b.
    • Painel multimarcador 3 (subconjuntos de eosinófilos): Análise de subconjuntos com base na expressão de Siglec-8, CD62L(L-selectina) e IL-5Rα [40].

• Análise do proteoma de eosinófilos (abordagem baseada em descoberta/geradora de hipóteses):

  • Até 50 x 103 células serão necessárias para realizar ensaios proteômicos. Esperamos cerca de 50-400 x 103 células de aproximadamente 1 mL de sangue.
  • Eosinófilos isolados (50 x 103 células) serão coletados por centrifugação, lavados e ressuspensos em tampão de lise com inibidores de proteinase. Em seguida, o material insolúvel será removido por centrifugação e os sobrenadantes celulares armazenados a -80°C.
  • Para os eosinófilos será feita a caracterização do proteoma total após digestão com tripsina pelo método DDA em sistema LC-MSMS. Para esta abordagem usaremos amostras de 15 doadores saudáveis ​​e 15 pacientes (T0, T4, T16, T32). As proteínas selecionadas serão apenas aquelas que relataram uma taxa de descoberta falsa global de 1% (FDR) ou melhor [55, 56].
  • Serão utilizados "pools" de proteínas dos 5 grupos de estudo (doadores saudáveis ​​e pacientes nos tempos T0, T4, T16 e T32 após o tratamento), dividindo-os (1-DE) em 5-6 bandas, extraindo as proteínas de cada banda, gerando os peptídeos correspondentes e analisando-os por MS/MS para produzir uma biblioteca para SWATH com um alto número de proteínas, sobre a qual será realizada a quantificação. Uma vez feita a biblioteca e mantendo as condições padronizadas de LC-MS/MS (TripleTOF), faremos uma análise SWATH-MS (método "Information-dependent Acquisition" ou IDA; "Targeted Label-Free Proteomics") em amostras de 15 doadores saudáveis ​​e 15 pacientes (T0, T4, T16, T32). Este ensaio nos permitirá identificar proteínas com diferenças significativas entre os grupos de estudo. As proteínas selecionadas serão apenas aquelas com P<0,05 e fold change ≥1,5 [56-59].

Pontos finais do estudo:

Os dados demográficos de todos os indivíduos inscritos no estudo serão obtidos no basal. Além disso, vários dados serão coletados, incluindo histórico de asma, parâmetros de função pulmonar, teste cutâneo, IgE alérgeno-específico, escore AQLQ, escore ACT, número de exacerbações e consumo de prednisona. Nas visitas seguintes ao serviço de Pneumologia nos T0, 4, 16 e 32, serão acompanhados os doentes tratados com mepolizumab. Isso inclui medições da função pulmonar (FEV1, FEV1/FVC), parâmetros bioquímicos e hematológicos.

Amostras de sangue periférico e soro serão coletadas e os eosinófilos serão purificados magneticamente, em T0, T4, T16 e T32, e serão realizadas citometria de fluxo, RTqPCR, análises proteômicas e imunoensaios. Todas as variáveis ​​experimentais (por exemplo, abundância de proteínas eosinófilas em ensaios proteômicos, marcadores de ativação de eosinófilos, …) serão correlacionadas com parâmetros clínicos (por exemplo, função pulmonar, controle da asma, número de exacerbações) para avaliar a associação dessas variáveis com a resposta ao tratamento. Consideraremos uma resposta favorável ao mepolizumabe se um dos seguintes critérios for atendido:

• Para obter controle adequado da asma ACT ≥20 [60], ou/ uma alteração ≥3 pontos representando uma diferença minimamente importante.
• Conseguir uma redução na taxa anual de exacerbações de 48%. A exacerbação é definida como o aumento dos sintomas que requerem tratamento com corticosteroides sistêmicos por ≥3 ou uma consulta médica não agendada, semelhante ao refletido nos ensaios clínicos com mepolizumabe [20, 61].
• Obtenha uma redução de 50% na taxa anual de internações hospitalares devido à exacerbação da asma, semelhante à refletida nos ensaios clínicos [62].
• Conseguir uma redução na dose média anual de corticosteroides sistêmicos de 50% [63].

• Endpoints primários do estudo:

  • Níveis de IGF-1, IGF-BP3 e IGF-ALS no soro
  • Dados de expressão transcriptômica (nanoString)/mRNA: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • dados proteômicos
  • Dados de citometria de fluxo: Expressão de CD16, galectinas-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L e IL-5Rα

• Desfechos secundários do estudo:

  • Parâmetros de função pulmonar (FEV1, FEV1/FVC)
  • Parâmetros hematológicos (por exemplo, número de eosinófilos).
  • Outras variáveis ​​clínicas e bioquímicas (por exemplo, IgE ou outras imunoglobulinas).
  • Número de exacerbações, consumo de prednisona, pontuação do ACT, pontuação do AQLQ.

Plano estatístico ou análise de dados:

Graph Pad Prism será usado para criar gráficos. IBM SPSS, Statistics 22.0 ou R. será usado para o estudo estatístico. Durante as análises, contaremos com o auxílio da área de Estatística e Pesquisa Operacional da USC (Dra. Rosa Maria Cruzeiras Casais).

Tamanho da amostra O cálculo do tamanho da amostra (N) foi realizado usando G*Power 3.1.9.4 [64]. Durante essas análises, calculamos o N necessário para obter significância estatística em um teste F (ANOVA: medidas repetidas, dentro dos fatores), dado α (0,05), potência (1-β, 0,95), o número de medições (T0, T4, T16 e T32) e o tamanho do efeito (f = 0,4; tamanho de efeito grande, que fornece resultados clinicamente mais relevantes). A saída N foi 15, com um F crítico = 2,82705.

Para dados clínicos, de citometria de fluxo e transcriptômicos. Comparações transversais entre HC e pacientes em T0 (antes do tratamento) seguindo uma distribuição normal e com homogeneidade de variâncias serão feitas usando o teste t. Para variáveis ​​distribuídas não normais, usaremos o teste U de Mann-Whitney. Alterações nas diferentes variáveis ​​do estudo em resposta ao tratamento com mepolizumabe (estudo longitudinal; T0, T4, T16 e T32) serão testadas usando RM-ANOVA. A análise multivariada (por exemplo, PCA, agrupamento não supervisionado), bem como a análise de enriquecimento funcional serão realizadas com citometria de fluxo e, acima de tudo, dados transcriptômicos.

Para a caracterização total do proteoma e análise quantitativa de SWATH, utilizaremos o software ProteinPilotTM 5.0.1 da ABSciex que possui o algoritmo ParagonTM para busca de banco de dados e ProgroupTM para agrupamento de dados. Os dados serão pesquisados ​​usando um banco de dados Uniprot específico para humanos. A taxa de descoberta falsa será realizada usando um método de ajuste não linear exibindo apenas os resultados que relataram uma taxa de descoberta falsa global de 1% ou melhor [65].

A análise funcional será realizada por diferentes softwares de acesso aberto. FunRich (ferramenta de análise de enriquecimento funcional) para enriquecimento funcional e análise de rede de interação (http://funrich.org/index.html). Para estatísticas, o FunRich usa o teste hipergeométrico, BH e Bonferroni [66, 67]. Usaremos DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) ou GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) para enriquecimento de ontologia gênica e para interação proteína-proteína, rede construção e agrupamento, usaremos String (https://string-db.org/) ou Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

Para dados SWATH, o software MarkerView nos fornecerá uma análise estatística multivariada usando a análise de componentes principais (PCA) para comparar os dados entre as amostras. A área média do pico MS de cada proteína será derivada das réplicas do SWATH-MS de cada amostra, seguida pela análise do teste t de Student usando o software MarkerView para comparação entre as amostras com base nas somas das áreas médias de todas as transições derivadas para cada proteína. O teste t indicará quão bem cada variável distingue os dois grupos, relatado como um valor P. Para a biblioteca, será selecionado seu conjunto de proteínas diferencialmente abundantes (p-valor <0,05) com 1,5 proteínas up-regulated ou down-regulated.

Limitações

• Conforme comentado anteriormente, 15 indivíduos serão escalados para receber mepolizumabe durante a primeira metade do estudo (36 semanas). Esperamos que pelo menos 90% dos indivíduos concluam este estudo. No entanto, abandonos de pacientes e não adesão (ou não adesão) são eventos comuns em estudos clínicos. Nesse caso, o tamanho da amostra será inflado proporcionalmente.
• O presente projeto foi proposto como um estudo da descoberta de biomarcadores moleculares em resposta ao mepolizumabe. Esse tipo de estudo pode ser abordado por meio de abordagens direcionadas/orientadas por hipóteses ou mais amplas/não direcionadas (tecnologias "ômicas"). Estamos cientes de que pode ser um desafio encontrar marcadores preditivos neste estudo pequeno e prospectivo/de prova de conceito. No presente projeto propomos uma dupla abordagem para minimizar este risco. Por um lado, metodologias modernas e não direcionadas para trabalhar e altamente sensíveis para detectar proteínas pouco abundantes (SWATH MS) ou protocolos simplificados para trabalhar com amostras difíceis (a geração de RNA de boa qualidade a partir de eosinófilos é sempre um desafio devido à presença de proteínas abundantes como EDN, um membro da família RNase) e reduzir a variação técnica (por exemplo, nCounter nanoString) para reduzir os tamanhos das amostras. Por outro lado, abordagens baseadas em hipóteses (por exemplo, citometria de fluxo, RT-qPCR, ELISA), com as vantagens de maior credibilidade, menor risco de erros do tipo I (ou seja, falsa descoberta) e II e fácil replicação futura de resultados. Essas metodologias direcionadas também serão usadas para confirmar apenas as diferenças clinicamente relevantes (alto tamanho do efeito) e significativas (p-valor < 0,05) obtidas com abordagens transcriptômicas/proteômicas não direcionadas.
• Outra limitação potencial é o número de eosinófilos, que pode ser potencialmente baixo em alguns pacientes após o tratamento com mepolizumabe (50 x 103 ou menos). Portanto, pode ser necessário purificar mais de 1 ou 2 mL de sangue nesses pacientes para obter células suficientes para realizar os experimentos proteômicos e transcriptômicos. Consideramos esta questão no protocolo do estudo e no orçamento do projeto.
• Finalmente, o TripleTOF é um espectrômetro de massa altamente sensível projetado para aprofundar amostras complexas como o proteoma de eosinófilos. A alta sensibilidade dos espectrômetros de massa atuais combinada com esquemas bidimensionais de nanoLC permite a detecção de números maiores de proteínas (>1000) e analitos em concentrações na faixa attomolar (10-18), suficientes para detectar proteínas intracelulares de baixa abundância como quimiocinas ou citocinas. Assim, TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 e IL-18 foram detectados por nanoLC-MS/MS (Q-TOF), mas não outros como IL-5 ou IL-13 [69 ]. Essa limitação esperada se deve à presença de peptídeos de proteínas altamente abundantes (por exemplo, proteínas de grânulos de eosinófilos) que suprimem a ionização de peptídeos de proteínas pouco abundantes em aplicações de LC-MS/MS. Isso leva à super-representação na lista de proteínas detectadas de espécies abundantes, como a proteína cristalina de Charcot-Leyden (CLC, galectina-10), que ainda é interessante para o presente projeto, pois identifica eosinófilos com capacidades reguladoras. No entanto, a fim de reduzir a complexidade da amostra e melhorar a detecção de proteínas de baixa abundância, existem diferentes métodos de depleção (por exemplo, depleção de ACN, ultrafiltração, 1-DE) e enriquecimento (por exemplo, CPLLs) que podemos usar para obter a detecção sensibilidade. Opcionalmente, abordagens direcionadas, como imunoensaios high-multiplex (por exemplo, os painéis Olink Immune Response, Olink Inflammation ou Olink Immuno-Oncology; https://www.olink.com/) têm a vantagem de uma alta sensibilidade de detecção com baixo volume de amostras biológicas (por exemplo, lisados ​​​​celulares), embora só permita a medição de 92 biomarcadores de proteínas de uma só vez.