Effekt av Mepolizumab på svår eosinofil astma (EMESEA)

Hypoteser

Hº1. Nivåerna av vissa ytmolekyler på eosinofiler eller närvaron eller frånvaron av vissa proteiner i proteomet av denna leukocytundergrupp före mepolizumabbehandling kan användas som prediktiva/prognostiska markörer för svar på denna biologiska.

Hº2. Mepolizumab förändrar förekomsten av flera yt- eller intracellulära proteiner i eosinofiler som ett resultat relaterat till förändringar i deras aktiveringsstatus, migreringsförmåga, reglerande/effektorfunktion eller undergruppssammansättning.

Hº3. Sen debuterande svår eosinofila astmatiker har förhöjda serumkoncentrationer hos olika medlemmar av IGF-familjen (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) och mepolizumabbehandling minskar dessa nivåer och beter sig som en respons-biomarkör tillsammans med antalet eosinofiler och kliniska exacerbationer.

Mål eller forskningsfrågor

OB (Aspirational Objective): Upptäckt av prediktiva/prognostiska biomarkörer för respons på mepolizumab med hjälp av flödescytometri, transkriptomisk och proteomisk teknologi.

• OB1.- Att identifiera förändringar i ytmarkörer för eosinofiler och eosinofilsubpopulationer som svar på behandling med mepolizumab med hjälp av flödescytometritekniker. Detta mål är fördelat i följande resultat (DE):

  • DE1.1: Urval av 15 friska kontroller
  • DE1.2: Diagnos av sent debuterande patienter med svår eosinofil astma och urval av 15 patienter som uppfyller kriterierna, är planerade att få mepolizumab och underteckna det informerade samtycket.
  • DE1.3: Generering av den initiala databasen för friska kontroller och astmapatienter med demografisk, klinisk, hematologisk och biokemisk information.
  • DE1.4: Insamling och bearbetning av serum (1 SST-rör) och helblodsprover (1-2 rör) från friska donatorer (T0) och mepolizumab-behandlade patienter (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Flödescytometrianalyser med multimarkörpaneler 1 (regulatorisk), 2 (aktivering) och 3 (eosinofilundergrupper) (se nedan).
  • DE1.6: Komplettera databasen med kliniska, hematologiska, biokemiska och flödescytometridata genererade vid tidpunkterna T4, T16 och T32. Slutlig uni- och multivariant statistisk analys.
  • DE1.7: Publicering av resultat.

• OB2.- Transkriptomisk analys för att identifiera mRNA inom det eosinofila transkriptomet som uppvisar förhöjda eller reducerade nivåer som svar på behandling med mepolizumab. Detta mål är fördelat i följande resultat (DE):

  • DE2.1: Sätt upp ett eosinofilisoleringsprotokoll och kontrollera cellens renhet med flödescytometri.
  • DE2.2: Rening av eosinofiler från 15 friska donatorer (T0) och 15 patienter (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Total RNA-extraktion från eosinofillysat, analys av kvalitet och kvantitet av RNA och lagring vid -80ºC.
  • DE2.4: Upptäcktsbaserat/hypotesgenererande tillvägagångssätt. Utvärdering av nivåerna av 770 humana proteinkodande mRNA kopplade till rekrytering, aktivering och effektorfunktioner av myeloidceller med hjälp av en direkt multiplexerad molekylär mätplattform som heter nCounter® NanoString) i kombination med en förtillverkad "nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). På grund av den höga ekonomiska kostnaden kommer denna del av studien endast att utföras med eosinofilprover från friska donatorer (T = 0) och två tidpunkter hos patienter (T = 0 och T = 16).
  • DE2.5: Bearbetning av erhållen data och initial statistisk analys.
  • DE2.6: Validering av nCounter®-data och hypotesdrivet tillvägagångssätt med en etablerad kvantitativ teknik. Utför retrotranskriptions- och qPCR-analyser av de mRNA i eosinofiler som visar de största förändringarna i överflöd som svar på mepolizumab-behandling enligt nCounter®-studien. Dessutom kommer några ytterligare mRNA som inte ingår i panelen "nanoString Myeloid Innate Immunity", såsom FOXP3 (regulatorisk funktion), CRLF2, ST2 eller IL-7R (cytokinreceptorer; aktivering), att analyseras. HPRT1-genen kommer att användas som en hushållsgen i denna uppsättning RTqPCR-experiment.
  • DE2.7: Uni- och multivarianta statistiska analyser.
  • DE2.8: Publicering av transkriptomiska resultat.

• OB3.- Proteomisk profilering för att identifiera proteiner med differentiell överflöd inom eosinofilerna som svar på behandling med mepolizumab. Detta mål är fördelat i följande resultat (DE):

  • DE3.1: Lysering av eosinofiler, avlägsnande av olösligt material genom centrifugering, proteinkvantifiering (BCA) och lagring av cellsupernatanter vid -80°C.
  • DE3.2: Utveckla ett totalt proteomanalysprotokoll med en Data Dependent Acquisition (DDA) metod med hjälp av en vätskekromatografi (LC)-MS / MS-teknologi (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Kontrollera den biologiska variabiliteten (biologiska replikationer) och tekniken (tekniska repliker) för att kontrollera testernas reproducerbarhet.
  • DE3.4: Upprätthålla de standardiserade villkoren för LC-MS / MS (TripleTOF), skapa ett bibliotek för SWATH (sekventiell fönsterinsamling av alla teoretiska masspektra) med så många eosinofila proteiner som möjligt.
  • DE3.5: Utför SWATH-MS-analys i prover från 15 friska donatorer och 15 patienter (T0, T4, T16, T32) ("informationsberoende förvärvsmetod eller IDA; "Targeted label-free proteomics").
  • DE3.6: Bearbetning av erhållen data och initial statistisk analys.
  • DE3.7: Kontroll av panelen med biomarkörer som erhållits med en annan teknologi (t.ex. vald reaktionsövervakning / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Slutlig uni- och multivariant statistisk analys. Identifiera proteiner med signifikanta skillnader mellan grupper (P < 0,05) och minst en fold förändring ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publicering av proteomiska resultat

• OB4. Kontrollera om sent debuterande svår eosinofila astmatiker uppvisar förhöjda nivåer av IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS i serumprover, om svaret av mepolizumab beror på nivåerna av dessa markörer, och om behandling med denna biologiska sänker koncentrationen i serum från dessa IGF-familjemedlemmar. Detta mål är fördelat i följande resultat (DE):

  • DE4.1: Analys av IGF-1, IGF-BP3 och IGF-ALS genom ELISA
  • DE4.2: Uni- och multivariant statistisk analys av experimentella data
  • DE4.3: Publicering av resultat

Publicering av resultat:

Vi kommer att sträva efter att presentera ett meddelande under det första året av studien i en spansk andningskongress (SEPAR) såväl som i den europeiska andningskongressen (ERS) som är resultatet av studien av kliniska data från patienter före och efter administrering av mepolizumab . Dessutom förväntar vi oss att publicera 3 publikationer i tidskrifter under första kvartalet samt andra 2 eller 3 kongressmeddelanden som är resultatet av experimentella studier.

Studiepopulation Studiepopulationen kommer att inkludera friska kontroller (d.v.s. försökspersoner utan astma, allergi, systemiska sjukdomar eller planerade för mindre operationer) och sent debuterande patienter med svår eosinofil astma, som kommer att rekryteras från olika områden i Galicien (Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo och Ourense), Spanien. Diagnos av patienter med svår eosinofil astma vid screening kommer att baseras på flera inklusionskriterier och uteslutningskriterier som vi beskriver nedan [12].

Inklusionskriterier:

• Diagnos av svår okontrollerad astma enligt ERS/ATS-kriterier [52].
• Ihållande eosinofili i blod (>300 celler/μL) vid ≥ två tillfällen (mer än 4 veckor mellan varje mätning).
• Frekventa exacerbationer (≥ två per år), definieras som en period på ≥ 3 dagar av bristande astmakontroll som kräver behandling med systemiska kortikosteroider och/eller ett akutmottagningsbesök och/eller sjukhusvistelse.
• Underskrift av informerat samtycke och samtycker till att följa alla besök i studien och alla procedurer som detta innebär.

Exklusions kriterier:

• Rökningshistoria: Aktuella rökare eller före detta rökare med en rökhistorik på ≥10 förpackningsår (antal förpackningsår = (antal cigaretter per dag/20) x antal år rökta). En före detta rökare definieras som en deltagare som slutat röka minst 6 månader före besök 1.
• Andra kliniskt viktiga lungsjukdomar än astma (t. aktiv lunginfektion, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), bronkiektasi, lungfibros, cystisk fibros, hypoventilationssyndrom associerat med fetma, lungcancer, alfa 1-anti-trypsinbrist och primär ciliär dyskinesi) eller någonsin diagnostiserats med lungsjukdom eller systemisk sjukdom , andra än astma, som är associerade med förhöjda perifera eosinofiler (t.ex. allergisk bronkopulmonell aspergillos/mykos, Churg-Strauss syndrom, hypereosinofilt syndrom).
• Alla störningar, inklusive, men inte begränsat till, kardiovaskulära, gastrointestinala, lever-, njur-, neurologiska, muskuloskeletala, infektiösa, endokrina, metaboliska, hematologiska, psykiatriska eller större fysiska nedsättningar som inte är stabila enligt utredarens åsikt.
• Malignitet: En aktuell malignitet eller tidigare historia av cancer i remission.
• Akuta övre eller nedre luftvägsinfektioner som kräver antibiotika eller antiviral medicin inom 30 dagar före besöket 1.
• Xolair: Deltagare som tidigare har fått omalizumab (Xolair) eller annan monoklonal antikropp.
• Deltagare som har fått systemiska kortikosteroider inom 30 dagar före besök 1 [53].
• Graviditet: Deltagare som är gravida eller ammar.
• Fetmaklass 2 eller högre (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Provstorlek

• Kohort av friska kontroller (n=15) endast för analys vid T = 0.

• Kohort av n=15 försökspersoner med svår eosinofil astma som börjar med mepolizumabbehandling utan modifiering av deras för närvarande ordinerade mediciner. Uppföljande studiebesök vid 4 (T4), 16 (T16) och 32 (T32) veckor efter det ursprungliga studiebesöket (T=0).

  • Bakgrunden till urvalsstorleken förklaras i statistikavsnittet.

Förväntad inskrivningstakt Eftersom detta kommer att vara en multicenterstudie, förväntar vi oss att nå en inskrivningsfrekvens på minst 2 allvarliga eosinofila astmatiker som börjar med mepolizumabbehandling per månad (4 veckor) på varje sjukhus (Totalt = 8 per månad). Detta innebär att de 15 försökspersonerna bör schemaläggas för att få mepolizumab under de första 36 veckorna av denna studie, med tillräckligt med tid för att slutföra studien på 72 veckor (1,5 år). Vi förväntar oss också att minst 90 % av försökspersonerna slutför denna studie.

Beräknat studiestartdatum: december 2020 Beräknat studieslutdatum: 1,5 år (72 veckor)

Studiedesign och metoder

Figur 2. Studiedesign. Denna figur representerar på ett schematiskt sätt både den kliniska och den experimentella delen av studien.

Detta är en observationell, longitudinell, prospektiv och multicenterstudie för att utvärdera både det tidiga svaret (4 veckor) och det sena svaret (16 och 32 veckor) på mepolizumabbehandling hos svår eosinofila astmatiker. Studien kommer att ledas av Dr Francisco Javier González Barcala (Pneumology Service vid CHUS). Dr Barcala var nationell koordinator i en klinisk prövning samt huvudprövare och underprövare i 41 respektive 19 kliniska prövningar. Dr Barcala har dessutom varit huvudutredare för 7 forskningsprojekt, samarbetspartner i andra 7 projekt och publicerat mer än 120 relevanta publikationer (peer-reviewed och JCR-indexerade) inom området luftvägssjukdomar, främst astma.

Studien involverar också andra medlemmar av den multidisciplinära astmaenheten (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr Juan José Nieto Fontarigo). Speciellt har projektledaren Dr. Salgado varit involverad i 11 forskningsprojekt, har 28 forskningsartiklar i högtryckstidskrifter som tillhör områdena immunologi, biokemi, proteomik och respiratoriska sjukdomar. Dessutom har de andra deltagarna i detta projekt en bred erfarenhet inom sina respektive områden, både grundforskning och translationell forskning. De är Dra. Marina Blanco Aparicio, ansvarig för astmaenheten vid University Hospital Complex of A Coruña (CHUAC), Dr. Uxío Calvo, vid University Hospital Complex of Ferrol (CHUF), och Coral González vid University Hospital Complex of Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro vid sjukhuset Alvaro Cunqueiro i Vigo; Dolores Corbacho på sjukhuset Povisa-Vigo. Det kommer att bli nödvändigt att anställa en forskare i predoktoralfasen under 12 månader för att utföra provberedning i transkriptomiska och proteomiska studier samt RTqPCR, flödescytometri och ELISA-analyser. Denna forskare kommer att stå under ledning av Dr Francisco Javier Salgado Castro och Dr Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplinary Asthma Unit, CHUS). Proteomicsexperiment kommer att utföras av Dra. Susana Belén Bravo López och María García Vence, som arbetar på Proteomic Platform vid Sanitary Research Foundation i Santiago de Compostela (FIDIS). nCounter®-analysen kommer att utföras genom en tjänst som erbjuds av GENVIP-gruppen (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Forskningsprojektet kommer att vara minimalt invasivt (t.ex. inga bronkoskopiska undersökningar) men protokollet måste granskas och godkännas av Ethics Committee of Clinical Research i Galicien, Spanien. Endast femton patienter som uppfyller kriterierna för diagnos av allvarlig astma med sent debut, är schemalagda att få mepolizumab och undertecknar det informerade samtycket kommer att inkluderas i denna studie. Samma protokoll kommer att följas av de olika kliniska teamen. Demografiska, såväl som kliniska, hematologiska och biokemiska variabler kommer att inkluderas i en databas. Hudstickstest för vanliga allergener och närvaron av allergenspecifikt IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) kommer att användas för att kontrollera allergisk sensibilisering. Lungfunktionsparametrar (tvingad utandningsvolym i 1:a sekunden (FEV1), forcerad vitalkapacitet (FVC) och FEV1/FVC-förhållande) kommer också att analyseras. Spirometri kommer att utföras före och efter användning av en luftrörsvidgare. Astmakontrolltestet (ACT) och frågeformuläret Astma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) kommer att utföras. Astmatiker måste vara i en stabil fas av sjukdomen (dvs. frånvaro av exacerbationer i minst 4 veckor före provtagning). Exacerbationer kommer att hanteras i enlighet med vanliga kliniska riktlinjer. Patienter (n=15) kommer att få 100 mg subkutan injektion av mepolizumab med 4 veckors intervall, och blod- och serumprover (2-3 EDTA-rör; 1 SST-rör) kommer att tas ut vid T=0, 4, 16 och 32 veckor, för att utvärdera både tidig respons (4 veckor) och sen respons (16 och 32 veckor) på behandlingen.

Metoder

• Rör: EDTA (fullständigt blod) och SST (serum)

• Rening av eosinofiler

  • Eosinofiler kan isoleras från helblod (heparinrör) med Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (katalog #130-104-466) eller EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (katalog #17956), båda negativa urvalsprocedurer som ger orörda undergrupper dessa leukocyter. Vi räknar med runt minst 1,0-4,0 x 106 celler från ~20 ml blod, men också hög viabilitet och renhet (>95%).

• ELISA-studier.

  • Serumprovtagning: Mätning av IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 brunnar), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY291) och IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY675) med hjälp av ELISA.

• Total RNA-rening från eosinofiler och nCounter nanoString-analys (upptäcktsbaserad/hypotesgenererande metod):

  • Renade eosinofiler från friska kontroller (T=0) och patienter (T=0, 4, 16 och 32 veckor) kommer att förvaras vid -80ºC i RNAlater-lösning (Ambion, Paisley, Storbritannien). Totalt RNA kommer att isoleras med hjälp av ett RNeasy Mini-kit (Qiagen) och lagras vid -80ºC efter kontroll av RNA-kvalitet och -koncentration (Nanodrop).
  • nCounter®-plattformen (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) är en multiplexmetod som möjliggör kvantifiering av upp till 800 RNA-, DNA- eller proteinmål. När det gäller mRNA-molekyler är denna teknologi baserad på hybridisering i lösning av varje mRNA till två komplementära oligonukleotider: en biotinylerad mRNA-specifik sond och en mRNA-specifik oligonukleotid som innehåller en sekventiell kombination av sex fluorokromer (fyra olika färger) som skapar en fluorescerande streckkod som identifierar det specifika mRNA som detekteras. När överskottet av båda proberna har tagits bort, fångas de hybridiserade komplexen in genom en biotin-streptavidin-interaktion och riktas in på patronen för att nCounter-instrumentet ska kunna läsa dessa "streckkoder". För att utföra dessa steg består nCounter-plattformen av två instrument, Prep Station, som utför rening av de hybridiserade komplexen och deras immobilisering på ytan av en patron, och Digital Analyzer (DA), en skanner som identifierar och räknar streckkoder fångas för varje prov. Denna kvantitativa analys Därför kan varje miRNA kvantifieras individuellt (absolut kvantifiering; räkningar) från svåra prover (t.ex. eosinofiler) utan behov av andra krav såsom mRNA-cDNA-omvandling (RT) eller DNA-amplifiering (qPCR), vilket leder till mindre datavariabilitet (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Dessutom är mängden ingående material låg (25 ng-300 ng mRNA) och kan härledas från FFPE-härlett RNA, totalt RNA, fragmenterat RNA, cellysat och sorterade celler. Efteråt kommer nCounter-data att normaliseras, bakgrundsbrus subtraheras och ytterligare korrigering utförs för att ta hänsyn till effektiviteten av extraktionen (beräknad baserat på uttrycket av spike-in miRNA som kommer att läggas till provet i en definierad mängd före miRNA-extraktionen ). Normaliseringar kommer att göras med R NanoStringNorm-paketet. Efter normalisering kommer en log2-transformation av data att göras och sedan analyseras med hjälp av LIMMA Bioconductor-paketet för att identifiera de mRNA som uppvisar en differentiell överflöd vid mepolizumab-behandling. Denna analys tar inte längre än 24 timmar.

• RTqPCR-studier (hypotesdriven metod):

  • För att analysera nivåerna av mRNA som kodar för proteiner relaterade till alarmin-medierad aktivering av eosinofiler (CRLF2, ST2, IL-7Ra/CD127) och med den reglerande funktionen av eosinofiler (FOXP3) från patienter behandlade med mepolizumab, kommer totalt RNA att transkriberas till cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) och förvaras vid -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) kommer att utföras i ett LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) och användas för att analysera uttrycket av FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R och HPRT1-genen (endogen kontroll).

• Flödescytometristudier (hypotesdrivet tillvägagångssätt):

  • EDTA-behandlade perifera blodprover från friska kontroller (n=15; T0) och mepolizumab-behandlade patienter (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Märk 100 μL/rör med hel perifert blod (EDTA) med både specifika och isotypmatchade kontrollantikroppar (BD). Lys av röda blodkroppar med FACSlyse (BD). Analys med en FACSCalibur flödescytometer (BD). Använd FSC/SSC för att välja granulocyter; sedan SSC vs CCR3 (FITC) för att separera eosinofiler från neutrofiler. Gate eosinofiler:

    • Multimarkörpanel 1 (Regulatoriska proteiner i eosinofiler): Mätning av CD16 och galectiner-1/10 [41-44].
    • Multimarkörpanel 2 (Aktiveringsreceptorer i eosinofiler): Mätning av CD48 (reducerad i totala antalet eosinofiler med måttlig-svår astma jämfört med friska kontroller (HC) [våra studier, 54]), CD44 och CD11b.
    • Multimarkörpanel 3 (Eosinofiler undergrupper): Analys av undergrupper baserad på uttrycket av Siglec-8, CD62L(L-selektin) och IL-5Ra [40].

• Analys av eosinofil proteom (upptäcktsbaserad/hypotesgenererande metod):

  • Så mycket som 50 x 103 celler kommer att behövas för att utföra proteomiska analyser. Vi förväntar oss cirka 50-400 x 103 celler från ~1 ml blod.
  • Isolerade eosinofiler (50 x 103 celler) kommer att samlas upp genom centrifugering, tvättas och återsuspenderas i lysbuffert med proteinashämmare. Därefter kommer olösligt material att avlägsnas genom centrifugering och cellsupernatanter förvaras vid -80°C.
  • För eosinofiler kommer total proteomkarakterisering att göras efter trypsindigestion med en DDA-metod i ett LC-MSMS-system. För detta tillvägagångssätt kommer vi att använda prover från 15 friska donatorer och 15 patienter (T0, T4, T16, T32). De valda proteinerna kommer endast att vara de som rapporterade en 1% global falsk upptäcktsfrekvens (FDR) eller bättre [55, 56].
  • Protein "pooler" från de 5 studiegrupperna (friska givare och patienter vid tidpunkten T0, T4, T16 och T32 efter behandling) kommer att användas, dela upp dem (1-DE) i 5-6 band, extrahera proteinerna från varje bandet, genererar motsvarande peptider och analyserar dem med MS/MS för att producera ett bibliotek för SWATH med ett stort antal proteiner, på vilket sedan kvantifieringen kommer att utföras. När biblioteket har skapats och bibehåller de standardiserade villkoren för LC-MS / MS (TripleTOF), kommer vi att utföra en SWATH-MS-analys ("informationsberoende förvärvsmetod eller IDA; "Targeted label-free proteomics") i prover från 15 friska donatorer och 15 patienter (T0, T4, T16, T32). Denna analys låter oss identifiera proteiner med betydande skillnader mellan studiegrupperna. De valda proteinerna kommer endast att vara de med P<0,05 och en veckförändring ≥1,5 [56-59].

Studiens slutpunkter:

Demografiska data för alla individer som är inskrivna i studien kommer att erhållas vid basal. Dessutom kommer flera data att samlas in, inklusive astmahistoria, lungfunktionsparametrar, hudpricktest, allergenspecifikt IgE, AQLQ-poäng, ACT-poäng, antal exacerbationer och konsumtion av prednison. Under de följande besöken på pneumologitjänsten på T0, 4, 16 och 32 kommer patienter som behandlas med mepolizumab att följas upp. Detta inkluderar mätningar av lungfunktion (FEV1, FEV1/FVC), biokemiska och hematologiska parametrar.

Perifera blod- och serumprover kommer att samlas in, och eosinofiler kommer att magnetiskt renas, vid T0, T4, T16 och T32, och flödescytometri, RTqPCR och proteomanalyser, samt immunanalyser, kommer att utföras. Alla experimentella variabler (t.ex. förekomsten av eosinofila proteiner i proteomiska analyser, eosinofilaktiveringsmarkörer, ...) kommer att korreleras med kliniska parametrar (t.ex. lungfunktion, astmakontroll, antal exacerbationer) för att bedöma sambandet mellan dessa variabler med svaret på behandlingen. Vi kommer att överväga ett positivt svar på mepolizumab om något av följande kriterier är uppfyllt:

• För att erhålla adekvat astmakontroll ACT ≥20 [60], eller/en förändring på ≥3 poäng, vilket representerar en minimalt viktig skillnad.
• För att uppnå en minskning av den årliga exacerbationstakten med 48 %. Exacerbation definieras som ökningen av symtom som kräver behandling med systemiska kortikosteroider för ≥3, eller en oplanerad medicinsk konsultation, liknande den som återspeglas i kliniska prövningar med mepolizumab [20, 61].
• Få en 50 % minskning av den årliga frekvensen av sjukhusinläggningar på grund av astmaexacerbation, liknande den som återspeglas i kliniska prövningar [62].
• Att uppnå en minskning av den årliga mediandosen av systemiska kortikosteroider med 50 % [63].

• Studera primära effektmått:

  • IGF-1, IGF-BP3 och IGF-ALS nivåer i serum
  • Transkriptomiska (nanoString)/mRNA-expressionsdata: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomisk data
  • Flödescytometridata: Uttryck av CD16, galectiner-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L och IL-5Ra

• Studera sekundära slutpunkter:

  • Lungfunktionsparametrar (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hematologiska parametrar (t.ex. antal eosinofiler).
  • Andra kliniska och biokemiska variabler (t.ex. IgE eller andra immunglobuliner).
  • Antal exacerbationer, prednisonkonsumtion, ACT-poäng, AQLQ-poäng.

Statistisk plan eller dataanalys:

Graph Pad Prism kommer att användas för att skapa grafik. IBM SPSS, Statistics 22.0 eller R. kommer att användas för den statistiska studien. Under analyserna kommer vi att få hjälp av USC Statistics and Operational Research-området (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Provstorlek Beräkningen av provstorlek (N) har utförts med hjälp av G*Power 3.1.9.4 [64]. Under dessa analyser beräknar vi N nödvändig för att få statistisk signifikans i ett F-test (ANOVA: Upprepade mätningar, inom faktorer), givet α (0,05), effekt (1-β, 0,95), antalet mätningar (T0, T4, T16 och T32), och effektstorleken (f = 0,4; stor effektstorlek, vilket ger mer kliniskt relevanta resultat). Utsignalen N var 15, med ett kritiskt F= 2,82705.

För klinisk, flödescytometri och transkriptomiska data. Tvärsnittsjämförelser mellan HC och patienter i T0 (före behandling) efter en normalfördelning och med homogenitet av varianser kommer att göras genom att använda t-test. För icke-normalfördelade variabler kommer vi att använda Mann-Whitney U-test. Förändringar i de olika studievariablerna som svar på behandling med mepolizumab (longitudinell studie; T0, T4, T16 och T32) kommer att testas med RM-ANOVA. Multivariat analys (t.ex. PCA, oövervakad klustring) såväl som funktionell anrikningsanalys kommer att utföras med flödescytometri och framför allt transkriptomiska data.

För total proteomkarakterisering och kvantitativ SWATH-analys kommer vi att använda ProteinPilotTM 5.0.1 mjukvara från ABSciex som har algoritmen ParagonTM för databassökning och ProgroupTM för datagruppering. Data kommer att sökas med hjälp av en Human-specifik Uniprot-databas. Falsk upptäcktsfrekvens kommer att utföras med en icke-linjär anpassningsmetod som visar endast de resultat som rapporterade en 1% global falsk upptäcktsfrekvens eller bättre [65].

Funktionsanalys kommer att utföras av olika program med öppen tillgång. FunRich (Functional Enrichment analysis tool) för funktionell berikning och interaktionsnätverksanalys (http://funrich.org/index.html). För statistik använder FunRich hypergeometriskt test, BH och Bonferroni [66, 67]. Vi kommer att använda DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) eller GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) för genontologiberikning och för protein-proteininteraktion, nätverk konstruktion och klustring kommer vi att använda String (https://string-db.org/) eller Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

För SWATH-data kommer MarkerView-mjukvaran att ge oss en multivariat statistisk analys med användning av principal component analysis (PCA) för att jämföra data över proverna. Den genomsnittliga MS-topparean för varje protein kommer att härledas från replikaten av SWATH-MS för varje prov följt av Students t-testanalys med hjälp av MarkerView-mjukvaran för jämförelse mellan proverna baserat på de genomsnittliga areasummorna för alla övergångar härledda för varje protein. T-testet kommer att indikera hur väl varje variabel skiljer de två grupperna åt, rapporterat som ett P-värde. För biblioteket kommer dess uppsättning av differentiellt rikliga proteiner (p-värde <0,05) med 1,5 uppreglerade eller nedreglerade proteiner att väljas.

Begränsningar

• Som tidigare kommenterats kommer 15 försökspersoner att få mepolizumab under första halvan av studien (36 veckor). Vi förväntar oss att minst 90 % av försökspersonerna slutför denna studie. Patientavhopp och bristande efterlevnad (eller bristande efterlevnad) är dock vanliga händelser i kliniska studier. I ett sådant fall kommer provstorleken att ökas proportionellt.
• Det aktuella projektet har föreslagits som en studie av upptäckten av molekylära biomarkörer som svar på mepolizumab. Den här typen av studier kan gå ombord genom riktade/hypotesdrivna eller bredare/oriktade ("-omics"-teknologier) tillvägagångssätt. Vi är medvetna om att det kan vara utmanande att hitta prediktiva markörer i denna lilla och prospektiva/proof of concept-studie. I detta projekt föreslår vi ett dubbelt tillvägagångssätt för att minimera denna risk. Å ena sidan, moderna och oriktade metoder för att fungera och mycket känsliga för att upptäcka proteiner i låg mängd (SWATH MS) eller förenklade protokoll för att arbeta med svåra prover (generering av RNA av god kvalitet från eosinofiler är alltid utmanande på grund av närvaron av rikligt med proteiner som EDN, en medlem av RNase-familjen) och minska teknisk varians (t.ex. nCounter nanoString) för att förkorta urvalsstorlekarna. Å andra sidan, hypotesdrivna tillvägagångssätt (t.ex. flödescytometri, RT-qPCR, ELISA), med fördelarna av en större trovärdighet, mindre risk för typ I (d.v.s. falsk upptäckt) och II-fel och lätt till framtida replikering resultat. Dessa målinriktade metoder kommer också att användas för att bekräfta endast kliniskt relevanta (hög effektstorlek) och signifikanta (p-värde < 0,05) skillnader erhållna med oriktade transkriptomiska/proteomiska tillvägagångssätt.
• En annan potentiell begränsning är antalet eosinofiler, som potentiellt kan vara lågt hos vissa patienter efter behandling med mepolizumab (50 x 103 eller lägre). Därför kan det vara nödvändigt att rena mer än 1 eller 2 ml blod hos dessa patienter för att uppnå tillräckligt med celler för att utföra de proteomiska och transkriptomiska experimenten. Vi har beaktat denna fråga i studieprotokollet och i projektets budget.
• Slutligen är TripleTOF en mycket känslig masspektrometer utformad för att gräva djupare in i komplexa prover som eosinofilproteomet. Den höga känsligheten hos nuvarande masspektrometrar kombinerat med tvådimensionella scheman för nanoLC tillåter detektering av högre antal proteiner (>1000) och analyter vid koncentrationer i det attomolära området (10-18), tillräckligt för att detektera låga mängder av intracellulära proteiner som kemokiner eller cytokiner. Således har TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 och IL-18 detekterats av nanoLC-MS/MS (Q-TOF), men inte andra som IL-5 eller IL-13 [69 ]. Denna förväntade begränsning beror på närvaron av peptider från mycket rikliga proteiner (t.ex. eosinofila granulproteiner) som undertrycker joniseringen av peptider från proteiner med låg mängd i LC-MS/MS-applikationer. Detta leder till överrepresentationen i listan över upptäckta proteiner av rikliga arter som Charcot-Leyden kristallprotein (CLC, galectin-10), vilket fortfarande är intressant för det aktuella projektet eftersom identifierar eosinofiler med regulatorisk kapacitet. Men för att minska provets komplexitet och förbättra detektionen av proteiner med låg förekomst, finns det olika utarmning (t.ex. ACN-utarmning, ultrafiltrering, 1-DE) och anrikningsmetoder (t.ex. CPLL) som vi kan använda för att få upptäckt känslighet. Valfritt, riktade tillvägagångssätt som hög-multiplex immunoanalyser (t.ex. Olink Immune Response, Olink Inflammation eller Olink Immuno-Oncology paneler; https://www.olink.com/) har fördelen av en hög detektionskänslighet med låg volym av biologiska prover (t.ex. cellysat), även om det bara tillåter mätning av 92 proteinbiomarkörer på en gång.