Effect van Mepolizumab op ernstig eosinofiel astma (EMESEA)

Hypothesen

Hº1. De niveaus van bepaalde oppervlaktemoleculen op eosinofielen of de aan- of afwezigheid van bepaalde eiwitten in het proteoom van deze leukocytensubgroep voorafgaand aan behandeling met mepolizumab kunnen worden gebruikt als voorspellende/prognostische markers van respons op dit biologische middel.

Hº2. Mepolizumab verandert de overvloed aan verschillende oppervlakte- of intracellulaire eiwitten in eosinofielen als gevolg van veranderingen in hun activeringsstatus, migratievermogen, regulerende/effectorfunctie of samenstelling van de subgroep.

Hº3. Ernstige eosinofiele astmapatiënten met late aanvang hebben verhoogde serumconcentraties van verschillende leden van de IGF-familie (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) en behandeling met mepolizumab verlaagt deze niveaus en gedraagt ​​zich als een respons-biomarker samen met het eosinofielen en klinische exacerbaties.

Doelstellingen of onderzoeksvragen

OB (Aspirational objective): Ontdekking van voorspellende/prognostische biomarkers van respons op mepolizumab met behulp van flowcytometrie, transcriptomische en proteomische technologieën.

• OB1.- Het identificeren van veranderingen in oppervlaktemarkers van eosinofielen en subpopulaties van eosinofielen als reactie op behandeling met mepolizumab met behulp van flowcytometrietechnieken. Deze doelstelling is verdeeld in de volgende deliverables (DE):

  • DE1.1: Selectie van 15 gezonde controles
  • DE1.2: Diagnose van laat optredende patiënten met ernstig eosinofiel astma en selectie van 15 patiënten die aan de criteria voldoen, die mepolizumab zullen krijgen en de geïnformeerde toestemming ondertekenen.
  • DE1.3: Genereren van de initiële database voor gezonde controles en astmapatiënten met demografische, klinische, hematologische en biochemische informatie.
  • DE1.4: Verzameling en verwerking van serum (1 SST-buisje) en volbloedmonsters (1-2 buisjes) van gezonde donoren (T0) en met mepolizumab behandelde patiënten (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Flowcytometrie-assays met multimarkerpanels 1 (regelgevend), 2 (activering) en 3 (eosinofielensubsets) (zie hieronder).
  • DE1.6: Voltooi de database met klinische, hematologische, biochemische en flowcytometrische gegevens die zijn gegenereerd op tijdstippen T4, T16 en T32. Definitieve uni- en multivariante statistische analyse.
  • DE1.7: Publicatie van resultaten.

• OB2.- Transcriptomische analyse om mRNA's in het eosinofiele transcriptoom te identificeren die verhoogde of verlaagde niveaus vertonen als reactie op behandeling met mepolizumab. Deze doelstelling is verdeeld in de volgende deliverables (DE):

  • DE2.1: Stel een isolatieprotocol voor eosinofielen op en controleer de celzuiverheid door middel van flowcytometrie.
  • DE2.2: Zuivering van eosinofielen van 15 gezonde donoren (T0) en 15 patiënten (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Totale RNA-extractie uit eosinofielenlysaten, bepaling van kwaliteit en kwantiteit van RNA en opslag bij -80ºC.
  • DE2.4: Op ontdekking gebaseerde/hypothese-genererende benadering. Evaluatie van de niveaus van 770 humane eiwitcoderende mRNA's gekoppeld aan de rekrutering, activering en effectorfuncties van myeloïde cellen door middel van een direct gemultiplext moleculair meetplatform genaamd nCounter® NanoString) in combinatie met een vooraf gemaakte "nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Vanwege de hoge economische kosten zal dit deel van de studie alleen worden uitgevoerd met eosinofielenmonsters van gezonde donoren (T = 0) en twee tijdstippen bij patiënten (T = 0 en T = 16).
  • DE2.5: Verwerking van de verkregen gegevens en initiële statistische analyse.
  • DE2.6: Validatie van nCounter®-gegevens en hypothesegestuurde aanpak met een gevestigde kwantitatieve techniek. Voer retrotranscriptie- en qPCR-analyses uit van die mRNA's in eosinofielen die volgens de nCounter®-studie de grootste veranderingen in overvloed vertonen als reactie op behandeling met mepolizumab. Bovendien zullen enkele aanvullende mRNA's die niet zijn opgenomen in het "nanoString Myeloid Innate Immunity"-panel, zoals FOXP3 (regulerende functie), CRLF2, ST2 of IL-7R (cytokinereceptoren; activering), worden geanalyseerd. Het HPRT1-gen zal worden gebruikt als huishoudgen in deze reeks RTqPCR-experimenten.
  • DE2.7: Uni- en multivariante statistische analyses.
  • DE2.8: Publicatie van transcriptomische resultaten.

• OB3.- Proteomische profilering om eiwitten te identificeren met verschillende hoeveelheden in de eosinofielen als reactie op behandeling met mepolizumab. Deze doelstelling is verdeeld in de volgende deliverables (DE):

  • DE3.1: Lysis van eosinofielen, verwijdering van onoplosbaar materiaal door centrifugatie, eiwitkwantificering (BCA) en opslag van celsupernatanten bij -80°C.
  • DE3.2: Ontwikkel een protocol voor totale proteoomanalyse met een Data Dependent Acquisition (DDA)-methode met behulp van vloeistofchromatografie (LC)-MS/MS-technologie (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Controleer de biologische variabiliteit (biologische replicaties) en techniek (technische replica's) om de reproduceerbaarheid van de tests te controleren.
  • DE3.4: Behoud van de gestandaardiseerde omstandigheden van LC-MS / MS (TripleTOF), creëer een bibliotheek voor SWATH (sequentiële vensterverwerving van alle theoretische massaspectra) met zoveel mogelijk eosinofiele eiwitten.
  • DE3.5: Voer SWATH-MS-analyse uit in monsters van 15 gezonde donoren en 15 patiënten (T0, T4, T16, T32) ("informatieafhankelijke acquisitie"-methode of IDA; "Targeted label-free proteomics").
  • DE3.6: Verwerking van de verkregen gegevens en initiële statistische analyse.
  • DE3.7: Controle van het panel van biomarkers verkregen met een andere technologie (bijv. Selected reaction monitoring / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Definitieve uni- en multivariante statistische analyse. Identificeer eiwitten met significante verschillen tussen groepen (P < 0,05) en ten minste een vouwverandering ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publicatie van proteomische resultaten

• OB4. Controleer of laat optredende ernstige eosinofiele astmapatiënten verhoogde niveaus van IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS in serummonsters vertonen, of de respons van mepolizumab afhangt van de niveaus van deze markers, en of behandeling met dit biologische middel de concentratie in serum van deze leden van de IGF-familie. Deze doelstelling is verdeeld in de volgende deliverables (DE):

  • DE4.1: Analyse van IGF-1, IGF-BP3 en IGF-ALS door ELISA
  • DE4.2: Uni- en multivariante statistische analyse van experimentele gegevens
  • DE4.3: Publicatie van resultaten

Publicatie van resultaten:

We zullen ernaar streven om tijdens het eerste jaar van de studie een mededeling te presenteren op een Spaans Respiratoir Congres (SEPAR) en op het Europees Respiratoir Congres (ERS) als resultaat van de studie van de klinische gegevens van patiënten voor en na de toediening van mepolizumab . Daarnaast verwachten we 3 publicaties in Q1-tijdschriften te publiceren, evenals andere 2 of 3 congrescommunicatie die voortvloeit uit experimentele studies.

Studiepopulatie De onderzoekspopulatie zal bestaan ​​uit gezonde controles (d.w.z. proefpersonen zonder astma, allergie, systemische ziekten of gepland voor kleine operaties) en patiënten met ernstig eosinofiel astma met late aanvang, die zullen worden geworven uit verschillende gebieden van Galicië (Santiago de Compostela, A Coruña, Lugo, Vigo en Ourense), Spanje. Diagnose van ernstige eosinofiele astmapatiënten bij screening zal gebaseerd zijn op verschillende inclusiecriteria en exclusiecriteria die we hieronder beschrijven [12].

Inclusiecriteria:

• Diagnose van ernstig ongecontroleerd astma volgens ERS/ATS-criteria [52].
• Persisterende eosinofilie in bloed (>300 cellen/μl) bij ≥ twee gelegenheden (meer dan 4 weken tussen elke meting).
• Frequente exacerbaties (≥ twee per jaar), gedefinieerd als een periode van ≥ 3 dagen waarin de astma niet onder controle is, waarvoor behandeling met systemische corticosteroïden en/of een bezoek aan de spoedeisende hulp (SEH) en/of ziekenhuisopname nodig is.
• Ondertekening van geïnformeerde toestemming en akkoord om te voldoen aan alle bezoeken van de studie en alle procedures die dit met zich meebrengt.

Uitsluitingscriteria:

• Rookgeschiedenis: Huidige rokers of voormalige rokers met een rookgeschiedenis van ≥10 pakjaren (aantal pakjaren = (aantal sigaretten per dag/20) x aantal jaren gerookt). Een ex-roker wordt gedefinieerd als een deelnemer die minimaal 6 maanden voorafgaand aan Bezoek 1 is gestopt met roken.
• Klinisch belangrijke longziekte anders dan astma (bijv. actieve longinfectie, chronische obstructieve longziekte (COPD), bronchiëctasie, longfibrose, cystische fibrose, hypoventilatiesyndroom geassocieerd met obesitas, longkanker, alfa-1-antitrypsinedeficiëntie en primaire ciliaire dyskinesie) of ooit gediagnosticeerd met pulmonale of systemische ziekte , anders dan astma, die gepaard gaan met verhoogde perifere eosinofielentellingen (bijv. allergische bronchopulmonale aspergillose/mycose, syndroom van Churg-Strauss, hypereosinofiel syndroom).
• Elke aandoening, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, cardiovasculaire, gastro-intestinale, lever-, nier-, neurologische, musculoskeletale, infectieuze, endocriene, metabole, hematologische, psychiatrische of ernstige lichamelijke beperkingen die naar de mening van de onderzoeker niet stabiel zijn.
• Maligniteit: een huidige maligniteit of een voorgeschiedenis van kanker in remissie.
• Acute bovenste of onderste luchtweginfecties die antibiotica of antivirale medicatie vereisen binnen 30 dagen voorafgaand aan het bezoek 1.
• Xolair: deelnemers die eerder omalizumab (Xolair) of een ander monoklonaal antilichaam hebben gekregen.
• Deelnemers die binnen 30 dagen voor bezoek 1 systemische corticosteroïden hebben gekregen [53].
• Zwangerschap: deelnemers die zwanger zijn of borstvoeding geven.
• Obesitas klasse 2 of hoger (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Steekproefgrootte

• Cohort van gezonde controles (n=15) alleen voor analyse bij T=0.

• Cohort van n=15 proefpersonen met ernstig eosinofiel astma die beginnen met mepolizumab-therapie zonder aanpassing van hun momenteel voorgeschreven medicatie. Vervolgstudiebezoeken op 4 (T4), 16 (T16) en 32 (T32) weken na het oorspronkelijke studiebezoek (T=0).

  • De grondgedachte voor de steekproefomvang wordt uitgelegd in het statistische gedeelte.

Verwachte inschrijvingsgraad Aangezien dit een multicentrische studie zal zijn, verwachten we een inschrijvingsgraad van ten minste 2 ernstige eosinofiele astmapatiënten die beginnen met mepolizumab-therapie per maand (4 weken) in elk ziekenhuis (Totaal = 8 per maand). Dit betekent dat de 15 proefpersonen tijdens de eerste 36 weken van dit onderzoek mepolizumab moeten krijgen, zodat ze voldoende tijd hebben om het onderzoek in 72 weken (1,5 jaar) af te ronden. We verwachten ook dat ten minste 90% van de proefpersonen dit onderzoek afrondt.

Geschatte startdatum studie: december 2020 Geschatte einddatum studie: 1,5 jaar (72 weken)

Studie ontwerp en methoden

Figuur 2. Studieopzet. Deze figuur geeft op schematische wijze zowel het klinische als het experimentele deel van de studie weer.

Dit is een observationeel, longitudinaal, prospectief en multicenter onderzoek om zowel de vroege respons (4 weken) als de late respons (16 en 32 weken) op mepolizumab-therapie bij ernstige eosinofiele astmapatiënten te evalueren. De studie zal worden geleid door Dr. Francisco Javier González Barcala (Pneumology Service bij CHUS). Dr. Barcala was nationaal coördinator in één klinische studie en hoofdonderzoeker en subonderzoeker in respectievelijk 41 en 19 klinische studies. Daarnaast was Dr. Barcala hoofdonderzoeker van 7 onderzoeksprojecten, medewerker in 7 andere projecten, en publiceerde hij meer dan 120 relevante publicaties (collegiaal getoetst en JCR-geïndexeerd) op het gebied van luchtwegaandoeningen, voornamelijk astma.

Bij het onderzoek zijn ook andere leden van de Multidisciplinaire Astma-eenheid betrokken (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Met name de projectmanager Dr. Salgado is betrokken geweest bij 11 onderzoeksprojecten, heeft 28 onderzoekspapers in tijdschriften met een hoge impact op het gebied van immunologie, biochemie, proteomica en ademhalingsziekten. Bovendien hebben de andere deelnemers aan dit project een brede ervaring in hun respectievelijke domeinen, zowel fundamenteel als translationeel onderzoek. Ze zijn Dr. Marina Blanco Aparicio, verantwoordelijk voor de Astma-afdeling van het Universitair Ziekenhuiscomplex van A Coruña (CHUAC), Dr. Uxío Calvo, van het Universitair Ziekenhuiscomplex van Ferrol (CHUF), en Coral González van het Universitair Ziekenhuiscomplex van Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro in ziekenhuis Alvaro Cunqueiro van Vigo; Dolores Corbacho in het ziekenhuis Povisa-Vigo. Er zal een onderzoeker in de predoctorale fase gedurende 12 maanden moeten worden aangeworven om staalvoorbereiding uit te voeren in transcriptomische en proteomische studies, evenals de RTqPCR-, flowcytometrie- en ELISA-assays. Deze onderzoeker zal onder supervisie staan ​​van Dr. Francisco Javier Salgado Castro en Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplinaire Astma-eenheid, CHUS). Proteomics-experimenten zullen worden uitgevoerd door Dra. Susana Belén Bravo López en María García Vence, die werken bij het Proteomic Platform bij de Sanitary Research Foundation van Santiago de Compostela (FIDIS). De nCounter®-analyse zal worden uitgevoerd via een dienst die wordt aangeboden door de GENVIP-groep (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Het onderzoeksproject zal minimaal invasief zijn (bijv. geen bronchoscopische onderzoeken), maar het protocol moet worden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie voor klinisch onderzoek van Galicië, Spanje. Slechts vijftien patiënten die voldoen aan de criteria voor de diagnose van ernstige astma met late aanvang, die volgens de planning mepolizumab zullen krijgen en die de geïnformeerde toestemming ondertekenen, zullen in deze studie worden opgenomen. Hetzelfde protocol zal gevolgd worden door de verschillende klinische teams. Demografische, maar ook klinische, hematologische en biochemische variabelen zullen worden opgenomen in een database. Huidpriktest voor veel voorkomende allergenen en de aanwezigheid van allergeenspecifiek IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) zal worden gebruikt om te controleren op allergische sensibilisatie. Longfunctieparameters (geforceerd expiratoir volume in de 1e seconde (FEV1), geforceerde vitale capaciteit (FVC) en FEV1/FVC-ratio) zullen ook worden geanalyseerd. Voor en na gebruik van een bronchodilatator wordt spirometrie uitgevoerd. De Astma Controle Test (ACT) en de Astma Kwaliteit van Leven Vragenlijst (AQLQ) vragenlijst zullen worden uitgevoerd. Astmapatiënten moeten zich in een stabiele fase van de ziekte bevinden (d.w.z. afwezigheid van exacerbaties gedurende ten minste 4 weken vóór monsterafname). Exacerbaties zullen worden behandeld in overeenstemming met standaard klinische richtlijnen. Patiënten (n=15) krijgen een subcutane injectie van 100 mg mepolizumab met tussenpozen van 4 weken, en bloed- en serummonsters (2-3 EDTA-buisjes; 1 SST-buisje) worden teruggetrokken op T=0, 4, 16 en 32 weken. om zowel de vroege respons (4 weken) als de late respons (16 en 32 weken) op de behandeling te evalueren.

methoden

• Buizen: EDTA (volledig bloed) en SST (serum)

• Eosinofielen zuivering

  • Eosinofielen kunnen worden geïsoleerd uit volbloed (heparinebuisjes) met behulp van de Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (Catalogus #130-104-466) of de EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (Catalogus #17956), beide negatieve selectieprocedures die onaangeroerde subsets van deze leukocyten. We verwachten rond de 1.0-4.0 x 106 cellen uit ∼20 ml bloed, maar ook hoge levensvatbaarheid en zuiverheid (>95%).

• ELISA-onderzoeken.

  • Verzameling van serummonsters: meting van IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 well), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, catalogus #DY291) en IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, catalogus #DY675) door middel van ELISA.

• Totale RNA-zuivering van eosinofielen en nCounter nanoString-analyse (op ontdekking gebaseerde/hypothese-genererende benadering):

  • Gezuiverde eosinofielen van gezonde controles (T=0) en patiënten (T=0, 4, 16 en 32 weken) zullen worden bewaard bij -80ºC in RNAlater-oplossing (Ambion, Paisley, UK). Totaal RNA wordt geïsoleerd door middel van een RNeasy Mini kit (Qiagen) en bewaard bij -80ºC na controle van de RNA kwaliteit en concentratie (Nanodrop).
  • Het nCounter®-platform (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) is een multiplexmethodologie die de kwantificering van maximaal 800 RNA-, DNA- of eiwitdoelen mogelijk maakt. Wat mRNA-moleculen betreft, is deze technologie gebaseerd op de in-oplossing hybridisatie van elk mRNA tot twee complementaire oligonucleotiden: een gebiotinyleerde mRNA-specifieke probe en een mRNA-specifieke oligonucleotide die een sequentiële combinatie van zes fluorochromen (vier verschillende kleuren) bevat die een fluorescerend streepjescode die het specifieke mRNA identificeert dat wordt gedetecteerd. Zodra de overmaat van beide sondes is verwijderd, worden de gehybridiseerde complexen opgevangen door een biotine-streptavidine-interactie en uitgelijnd op een patroon zodat het nCounter-instrument die "streepjescodes" kan lezen. Om deze stappen uit te voeren, bestaat het nCounter-platform uit twee instrumenten: het Prep Station, dat de zuivering van de gehybridiseerde complexen en hun immobilisatie op het oppervlak van een cartridge uitvoert, en de Digital Analyzer (DA), een scanner die de streepjescodes vastgelegd voor elk monster. Deze kwantitatieve analyse Daarom kan elk miRNA afzonderlijk worden gekwantificeerd (absolute kwantificering; tellingen) van moeilijke monsters (bijv. eosinofielen) zonder dat andere vereisten zoals mRNA-cDNA-conversie (RT) of DNA-amplificatie (qPCR) minder gegevensvariabiliteit (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Bovendien is de hoeveelheid invoermateriaal laag (25 ng-300 ng mRNA) en kan het worden afgeleid van FFPE-afgeleid RNA, totaal RNA, gefragmenteerd RNA, cellysaten en gesorteerde cellen. Daarna worden nCounter-gegevens genormaliseerd, achtergrondruis afgetrokken en verdere correctie uitgevoerd om rekening te houden met de efficiëntie van de extractie (berekend op basis van de expressie van spike-in miRNA's die in een gedefinieerde hoeveelheid aan het monster zullen worden toegevoegd vóór de miRNA-extractie ). Normalisaties worden uitgevoerd met behulp van het R NanoStringNorm-pakket. Na normalisatie zal een log2-transformatie van de gegevens worden gemaakt en vervolgens worden geanalyseerd door middel van het LIMMA Bioconductor-pakket om die mRNA's te identificeren die een differentiële overvloed vertonen bij behandeling met mepolizumab. Deze analyse duurt niet langer dan 24 uur.

• RTqPCR-onderzoeken (Hypothese-gedreven aanpak):

  • Om de niveaus van mRNA's te analyseren die coderen voor eiwitten die verband houden met door alarm gemedieerde activering van eosinofielen (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) en met de regulerende functie van eosinofielen (FOXP3) van patiënten die met mepolizumab worden behandeld, zal totaal RNA worden getranscribeerd in cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) en bewaard bij -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) wordt uitgevoerd in een LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) en gebruikt om de expressie van FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R en het HPRT1-gen (endogene controle) te analyseren.

• Flowcytometrie-onderzoeken (hypothesegestuurde benadering):

  • Met EDTA behandelde perifere bloedmonsters van gezonde controles (n=15; T0) en met mepolizumab behandelde patiënten (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Label 100 μL/buis vol perifeer bloed (EDTA) met zowel specifieke als isotype-gematchte controle-antilichamen (BD). Lysis van rode bloedcellen met FACSlyse (BD). Analyse met een FACSCalibur flowcytometer (BD). Gebruik FSC/SSC om granulocyten te selecteren; vervolgens SSC versus CCR3 (FITC) om eosinofielen van neutrofielen te scheiden. Poort eosinofielen:

    • Multimarker panel 1 (Regulerende eiwitten in eosinofielen): Meting van CD16 en galectines-1/10 [41-44].
    • Multimarker-paneel 2 (Activeringsreceptoren in eosinofielen): Meting van CD48 (verminderd in totale eosinofielen met matig-ernstig astma in vergelijking met gezonde controles (HC) [onze studies, 54]), CD44 en CD11b.
    • Multimarker-paneel 3 (subsets van eosinofielen): analyse van subsets op basis van de expressie van Siglec-8, CD62L (L-selectine) en IL-5Rα [40].

• Analyse van eosinofiel proteoom (op ontdekking gebaseerde/hypothese-genererende benadering):

  • Er zijn maar liefst 50 x 103 cellen nodig om proteomische assays uit te voeren. We verwachten ongeveer 50-400 x 103 cellen uit ∼1 ml bloed.
  • Geïsoleerde eosinofielen (50 x 103 cellen) zullen worden verzameld door centrifugatie, gewassen en opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer met proteïnaseremmers. Daarna wordt onoplosbaar materiaal verwijderd door centrifugeren en worden celsupernatanten bewaard bij -80°C.
  • Voor eosinofielen zal de karakterisering van het totale proteoom gemaakt worden na digestie met trypsine met behulp van een DDA-methode in een LC-MSMS-systeem. Voor deze aanpak gebruiken we monsters van 15 gezonde donoren en 15 patiënten (T0, T4, T16, T32). De geselecteerde eiwitten zullen alleen die zijn die een 1% Global false discovery rate (FDR) of beter rapporteerden [55, 56].
  • Eiwitpools van de 5 onderzoeksgroepen (gezonde donoren en patiënten op tijd T0, T4, T16 en T32 na behandeling) zullen worden gebruikt, waarbij ze (1-DE) worden verdeeld in 5-6 banden, waarbij de eiwitten uit elk worden geëxtraheerd. band, het genereren van de overeenkomstige peptiden en het analyseren ervan door MS / MS om een ​​bibliotheek voor SWATH te produceren met een groot aantal eiwitten, waarop vervolgens de kwantificering zal worden uitgevoerd. Zodra de bibliotheek is gemaakt en de gestandaardiseerde omstandigheden van LC-MS / MS (TripleTOF) worden gehandhaafd, zullen we een SWATH-MS-analyse uitvoeren ("informatieafhankelijke acquisitie" -methode of IDA; "Targeted label-free proteomics") in monsters van 15 gezonde donoren en 15 patiënten (T0, T4, T16, T32). Met deze test kunnen we eiwitten identificeren met significante verschillen tussen de onderzoeksgroepen. De geselecteerde eiwitten zijn alleen die met een P<0,05 en een vouwverandering ≥1,5 [56-59].

Studie eindpunten:

Demografische gegevens van alle personen die aan het onderzoek deelnemen, zullen tegen basaal worden verkregen. Daarnaast zullen verschillende gegevens worden verzameld, waaronder astmageschiedenis, longfunctieparameters, huidpriktest, allergeenspecifiek IgE, AQLQ-score, ACT-score, het aantal exacerbaties en het gebruik van prednison. Tijdens de volgende bezoeken aan de dienst Pneumologie op T0, 4, 16 en 32 zullen de met mepolizumab behandelde patiënten worden opgevolgd. Dit omvat metingen van de longfunctie (FEV1, FEV1/FVC), biochemische en hematologische parameters.

Perifere bloed- en serummonsters zullen worden verzameld en eosinofielen zullen magnetisch worden gezuiverd op T0, T4, T16 en T32, en er zullen flowcytometrie, RTqPCR en proteomische analyses, evenals immunoassays worden uitgevoerd. Alle experimentele variabelen (bv. de overvloed aan eosinofiele eiwitten in proteomische assays, markers voor eosinofielenactivatie, …) zullen gecorreleerd worden met klinische parameters (bv. longfunctie, astmacontrole, aantal exacerbaties) om de associatie van deze variabelen te beoordelen met de respons op de behandeling. We zullen een gunstige reactie op mepolizumab overwegen als aan een van de volgende criteria is voldaan:

• Om adequate astmacontrole te verkrijgen ACT ≥20 [60], of/ een verandering van ≥3 punten vertegenwoordigt een minimaal belangrijk verschil.
• Een vermindering van het jaarlijkse aantal exacerbaties met 48% bereiken. Exacerbatie wordt gedefinieerd als de toename van symptomen waarvoor behandeling met systemische corticosteroïden nodig is voor ≥3, of een ongepland medisch consult, vergelijkbaar met wat wordt weerspiegeld in klinische studies met mepolizumab [20, 61].
• Krijg een vermindering van 50% van het jaarlijkse aantal ziekenhuisopnames als gevolg van astma-exacerbatie, vergelijkbaar met wat wordt weerspiegeld in klinische onderzoeken [62].
• Een verlaging van de mediane jaarlijkse dosis systemische corticosteroïden met 50% bereiken [63].

• Bestudeer primaire eindpunten:

  • IGF-1-, IGF-BP3- en IGF-ALS-waarden in serum
  • Transcriptomische (nanoString)/mRNA-expressiegegevens: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomische gegevens
  • Flowcytometriegegevens: expressie van CD16, galectines-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L en IL-5Rα

• Bestudeer secundaire eindpunten:

  • Longfunctieparameters (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hematologische parameters (bijv. eosinofielengetal).
  • Andere klinische en biochemische variabelen (bijv. IgE of andere immunoglobulinen).
  • Aantal exacerbaties, prednisonverbruik, ACT-score, AQLQ-score.

Statistisch plan of data-analyse:

Graph Pad Prism wordt gebruikt om afbeeldingen te maken. IBM SPSS, Statistics 22.0 of R. wordt gebruikt voor de statistische studie. Bij de analyses worden we bijgestaan ​​door de afdeling Statistiek en Operationeel Onderzoek van het USC (dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Steekproefomvang De berekening van de steekproefomvang (N) is uitgevoerd met G*Power 3.1.9.4 [64]. Tijdens deze analyses berekenen we N nodig om statistische significantie te krijgen in een F-test (ANOVA: Herhaalde metingen, binnen factoren), gegeven α (0,05), power (1-β, 0,95), het aantal metingen (T0, T4, T16 en T32), en de effectgrootte (f = 0,4; grote effectgrootte, wat meer klinisch relevante resultaten geeft). De output N was 15, met een kritische F= 2.82705.

Voor klinische, flowcytometrie en transcriptomische gegevens. Cross-sectionele vergelijkingen tussen HC en patiënten in T0 (vóór behandeling) volgens een normale verdeling en met homogeniteit van varianties zullen worden gemaakt met behulp van t-test. Voor niet-normaal verdeelde variabelen gebruiken we de Mann-Whitney U-test. Veranderingen in de verschillende studievariabelen als reactie op behandeling met mepolizumab (longitudinale studie; T0, T4, T16 en T32) zullen worden getest met behulp van RM-ANOVA. Multivariate analyse (bijv. PCA, unsupervised clustering) en functionele verrijkingsanalyse zullen worden uitgevoerd met flowcytometrie, en bovenal transcriptomische data.

Voor totale proteoomkarakterisering en kwantitatieve SWATH-analyse zullen we ProteinPilotTM 5.0.1-software van ABSciex gebruiken, die het algoritme ParagonTM heeft voor het zoeken in databases en ProgroupTM voor het groeperen van gegevens. Gegevens worden doorzocht met behulp van een Human-specifieke Uniprot-database. Het percentage valse ontdekkingen zal worden uitgevoerd met behulp van een niet-lineaire aanpassingsmethode die alleen de resultaten weergeeft die een globaal percentage valse ontdekkingen van 1% of beter rapporteerden [65].

Functionele analyse zal worden uitgevoerd door verschillende open-access software. FunRich (Functional Enrichment analysis tool) voor functionele verrijking en interactienetwerkanalyse (http://funrich.org/index.html). Voor statistieken gebruikt FunRich hypergeometrische test, BH en Bonferroni [66, 67]. We zullen DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) of GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) gebruiken voor genontologieverrijking en voor eiwit-eiwitinteractie, netwerk constructie en clustering, we zullen String gebruiken (https://string-db.org/) of Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

Voor SWATH-gegevens geeft MarkerView-software ons een multivariate statistische analyse met behulp van principale-componentenanalyse (PCA) om de gegevens van de monsters te vergelijken. Het gemiddelde MS-piekgebied van elk eiwit zal worden afgeleid uit de replica's van de SWATH-MS van elk monster, gevolgd door Student's t-testanalyse met behulp van de MarkerView-software voor vergelijking tussen de monsters op basis van de gemiddelde oppervlaktesommen van alle overgangen die zijn afgeleid voor elk eiwit. De t-toets geeft aan hoe goed elke variabele de twee groepen onderscheidt, gerapporteerd als een P-waarde. Voor de bibliotheek zal de set van differentieel overvloedige eiwitten (p-waarde <0,05) met 1,5 opwaarts gereguleerde of neerwaarts gereguleerde eiwitten worden geselecteerd.

Beperkingen

• Zoals eerder opgemerkt, zullen 15 proefpersonen tijdens de eerste helft van het onderzoek (36 weken) mepolizumab krijgen. We verwachten dat ten minste 90% van de proefpersonen dit onderzoek afrondt. Uitval van patiënten en niet-naleving (of niet-naleving) zijn echter veelvoorkomende gebeurtenissen in klinische studies. In dat geval wordt de steekproefomvang proportioneel vergroot.
• Het huidige project is voorgesteld als een studie van de ontdekking van moleculaire biomarkers als reactie op mepolizumab. Dit soort onderzoeken kan worden gevolgd via gerichte/hypothesegestuurde of bredere/ongerichte ("-omics"-technologieën) benaderingen. We zijn ons ervan bewust dat het een uitdaging kan zijn om voorspellende markers te vinden in deze kleine en prospectieve/proof of concept-studie. In het huidige project stellen we een dubbele aanpak voor om dit risico te minimaliseren. Enerzijds moderne en niet-gerichte methodologieën om te werken en zeer gevoelig om weinig overvloedige eiwitten te detecteren (SWATH MS) of vereenvoudigde protocollen om met moeilijke monsters te werken (het genereren van RNA van goede kwaliteit uit eosinofielen is altijd een uitdaging vanwege de aanwezigheid van overvloedige eiwitten zoals EDN, een lid van de RNase-familie) en technische variantie verminderen (bijv. nCounter nanoString) om de steekproefomvang te verkorten. Aan de andere kant, hypothesegestuurde benaderingen (bijv. Flowcytometrie, RT-qPCR, ELISA), met de voordelen van een grotere geloofwaardigheid, minder risico op type I (d.w.z. valse ontdekking) en II-fouten, en gemakkelijke toekomstige replicatie van resultaten. Deze gerichte methodologieën zullen ook worden gebruikt om alleen klinisch relevante (hoge effectgrootte) en significante (p-waarde < 0,05) verschillen te bevestigen die zijn verkregen met niet-gerichte transcriptomische/proteomische benaderingen.
• Een andere mogelijke beperking is het aantal eosinofielen, dat bij sommige patiënten mogelijk laag zou kunnen zijn na behandeling met mepolizumab (50 x 103 of lager). Daarom kan het nodig zijn om meer dan 1 of 2 ml bloed bij die patiënten te zuiveren om voldoende cellen te verkrijgen om de proteomische en transcriptomische experimenten uit te voeren. We hebben hierover nagedacht in het onderzoeksprotocol en in de begroting van het project.
• Ten slotte is de TripleTOF een zeer gevoelige massaspectrometer die is ontworpen om dieper in complexe monsters zoals het eosinofiele proteoom te graven. De hoge gevoeligheid van de huidige massaspectrometers in combinatie met tweedimensionale schema's van nanoLC maakt de detectie mogelijk van grotere aantallen eiwitten (>1000) en analyten bij concentraties in het attomolaire bereik (10-18), genoeg om weinig overvloedige intracellulaire eiwitten zoals chemokines of cytokines te detecteren. Zo zijn TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 en IL-18 gedetecteerd door nanoLC-MS/MS (Q-TOF), maar niet door anderen zoals IL-5 of IL-13 [69 ]. Deze verwachte beperking is te wijten aan de aanwezigheid van peptiden van zeer overvloedige eiwitten (bijv. eosinofiele granule-eiwitten) die de ionisatie van peptiden van weinig voorkomende eiwitten in LC-MS/MS-toepassingen onderdrukken. Dit leidt tot de oververtegenwoordiging in de lijst van gedetecteerde eiwitten van veel voorkomende soorten zoals het Charcot-Leyden kristaleiwit (CLC, galectine-10), wat nog steeds interessant is voor het huidige project aangezien het eosinofielen identificeert met regulerende capaciteiten. Om de complexiteit van het monster te verminderen en de detectie van weinig voorkomende eiwitten te verbeteren, zijn er echter verschillende uitputtingsmethoden (bijv. ACN-uitputting, ultrafiltratie, 1-DE) en verrijkingsmethoden (bijv. CPLL's) die we zouden kunnen gebruiken om detectie te verkrijgen gevoeligheid. Optioneel gerichte benaderingen zoals high-multiplex immunoassays (bijv. de Olink Immune Response, Olink Inflammation of Olink Immuno-Oncology panels; https://www.olink.com/) hebben het voordeel van een hoge detectiegevoeligheid met een laag volume aan biologische monsters (bijvoorbeeld cellysaten), ook al kunnen slechts 92 eiwitbiomarkers tegelijk worden gemeten.