A mepolizumab hatása a súlyos eozinofil asztmára (EMESEA)

Hipotézisek

Hº1. Az eozinofileken lévő bizonyos felszíni molekulák szintje vagy bizonyos fehérjék jelenléte vagy hiánya ennek a leukocita-alcsoportnak a proteomjában a mepolizumab-kezelést megelőzően felhasználható az erre a biológiaira adott válasz prediktív/prognosztikai markereként.

Hº2. A mepolizumab megváltoztatja számos felszíni vagy intracelluláris fehérje mennyiségét az eozinofilekben, ami az aktiválási státuszukban, a migrációs képességükben, a szabályozó/effektor funkciójukban vagy az alcsoport összetételében bekövetkezett változások eredményeképpen következik be.

Hº3. A késői megjelenésű, súlyos eozinofil asztmás betegek szérumkoncentrációja emelkedik az IGF-család különböző tagjainál (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS), és a mepolizumab-kezelés csökkenti ezeket a szinteket, és válasz-biomarkerként viselkedik a kórokozók számával együtt. eozinofilek és klinikai exacerbációk.

Célok vagy kutatási kérdések

OB (Aspirációs cél): A mepolizumabra adott válasz prediktív/prognosztikus biomarkereinek felfedezése áramlási citometria, transzkriptomikai és proteomikai technológiák segítségével.

• OB1.- Az eozinofilek és eozinofil szubpopulációk felszíni markereiben bekövetkezett változások azonosítása a mepolizumab kezelés hatására áramlási citometriás technikákkal. Ez a célkitűzés a következő dokumentumokban oszlik meg (DE):

  • DE1.1: 15 egészséges kontroll kiválasztása
  • DE1.2: Késői kezdetű, súlyos eozinofil asztmás betegek diagnosztizálása és 15 olyan beteg kiválasztása, akik megfelelnek a kritériumoknak, mepolizumab kezelésben részesülnek, és aláírják a beleegyező nyilatkozatot.
  • DE1.3: Az egészséges kontrollok és asztmás betegek kezdeti adatbázisának létrehozása demográfiai, klinikai, hematológiai és biokémiai információkkal.
  • DE1.4: Szérum (1 SST cső) és teljes vérminták (1-2 cső) gyűjtése és feldolgozása egészséges donoroktól (T0) és mepolizumabbal kezelt betegektől (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Áramlási citometriai vizsgálatok az 1. (szabályozás), a 2. (aktiválás) és a 3. (eozinofil alcsoportok) multimarker panelekkel (lásd alább).
  • DE1.6: Töltse ki az adatbázist a T4, T16 és T32 időpontokban generált klinikai, hematológiai, biokémiai és áramlási citometriai adatokkal. Végső egy- és többváltozós statisztikai elemzés.
  • DE1.7: Az eredmények közzététele.

• OB2. – Transzkriptomikai analízis az eozinofil transzkriptomon belüli mRNS-ek azonosítására, amelyek fokozott vagy csökkentett szintet mutatnak a mepolizumab-kezelés hatására. Ez a célkitűzés a következő dokumentumokban oszlik meg (DE):

  • DE2.1: Állítson be egy eozinofil izolálási protokollt, és ellenőrizze a sejttisztaságot áramlási citometriával.
  • DE2.2: Eozinofilek tisztítása 15 egészséges donortól (T0) és 15 betegtől (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Teljes RNS extrakció eozinofil lizátumokból, RNS minőségi és mennyiségi vizsgálata és -80ºC-on történő tárolás.
  • DE2.4: Felfedezésen alapuló/hipotézisgeneráló megközelítés. A mieloid sejtek toborzásához, aktiválásához és effektor funkcióihoz kapcsolódó 770 humán fehérjét kódoló mRNS szintjének értékelése az nCounter® NanoString elnevezésű közvetlen multiplex molekuláris mérőplatform segítségével, előre elkészített "nCounter® Human Myeloiddal" kombinálva Inte Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). A magas gazdasági költségek miatt a vizsgálat ezen részét csak egészséges donoroktól származó eozinofil mintákkal (T = 0) és betegeknél két időponttal (T = 0 és T = 16) végezzük.
  • DE2.5: A kapott adatok feldolgozása és kezdeti statisztikai elemzése.
  • DE2.6: Az nCounter® adatok validálása és hipotézis-vezérelt megközelítés egy bevált kvantitatív technikával. Végezzen retrotranszkripciós és qPCR-elemzést azon mRNS-eken az eozinofilekben, amelyek a legnagyobb mennyiségi változást mutatják a mepolizumab-kezelés hatására az nCounter® vizsgálat szerint. Ezenkívül néhány további mRNS-t is elemeznek, amelyek nem szerepelnek a "nanoString Myeloid Inte Immunity" panelen, mint például a FOXP3 (szabályozó funkció), a CRLF2, az ST2 vagy az IL-7R (citokin receptorok; aktiválás). A HPRT1 gént házőrző génként fogják használni ebben az RTqPCR-kísérletsorozatban.
  • DE2.7: Egy- és többváltozós statisztikai elemzések.
  • DE2.8: Átírási eredmények közzététele.

• OB3. – Proteomikus profilalkotás a mepolizumab-kezelésre adott válaszként az eozinofilekben eltérő fehérjék azonosítására. Ez a célkitűzés a következő dokumentumokban oszlik meg (DE):

  • DE3.1: Eozinofilek lízise, ​​oldhatatlan anyag eltávolítása centrifugálással, fehérje mennyiségi meghatározása (BCA) és sejtfelülúszók tárolása -80°C-on.
  • DE3.2: Teljes proteomelemzési protokoll kidolgozása adatfüggő adatgyűjtési (DDA) módszerrel, folyadékkromatográfiás (LC)-MS/MS technológiával (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Ellenőrizze a biológiai variabilitást (biológiai replikációk) és a technikát (műszaki replikák) a tesztek reprodukálhatóságának ellenőrzéséhez.
  • DE3.4: Az LC-MS / MS (TripleTOF) standardizált feltételeinek fenntartása, hozzon létre egy könyvtárat a SWATH számára (az összes elméleti tömegspektrum szekvenciális ablakgyűjtése) a lehető legtöbb eozinofil fehérjével.
  • DE3.5: Végezzen SWATH-MS elemzést 15 egészséges donorból és 15 betegből (T0, T4, T16, T32) származó mintákon ("információfüggő adatszerzés" módszer vagy IDA; "Célzott címkementes proteomika").
  • DE3.6: A kapott adatok feldolgozása és kezdeti statisztikai elemzése.
  • DE3.7: Az eltérő technológiával nyert biomarkerek paneljének ellenőrzése (pl. Selected reakció monitorozás / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Végső egy- és többváltozós statisztikai elemzés. Azonosítsa azokat a fehérjéket, amelyeknél szignifikáns különbségek vannak a csoportok között (P < 0,05) és legalább a változás ≥ 1,5.
  • DE3.9: Proteomikai eredmények közzététele

• OB4. Ellenőrizze, hogy a késői kezdetű, súlyos eozinofil asztmás betegeknél emelkedett-e az IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS szintje a szérummintákban, ha a mepolizumab válasza e markerek szintjétől függ, és ha az ezzel a biológiai gyógyszerrel történő kezelés csökkenti-e a ezen IGF-család tagjainak szérumát. Ez a célkitűzés a következő dokumentumokban oszlik meg (DE):

  • DE4.1: IGF-1, IGF-BP3 és IGF-ALS elemzése ELISA-val
  • DE4.2: Kísérleti adatok egy- és többváltozós statisztikai elemzése
  • DE4.3: Az eredmények közzététele

Eredmények publikálása:

Igyekszünk a vizsgálat első évében egy közleményt bemutatni egy Spanyol Légzőgyógyászati ​​Kongresszuson (SEPAR), valamint az Európai Légzőgyógyászati ​​Kongresszuson (ERS) a betegek mepolizumab beadása előtti és utáni klinikai adatainak tanulmányozásából. . Ezen túlmenően 3 publikációt várunk az első negyedéves folyóiratokban, valamint további 2 vagy 3 kongresszusi közleményt, amely kísérleti tanulmányok eredménye.

Vizsgálati populáció A vizsgálati populáció egészséges kontrollokat (azaz asztmától, allergiától, szisztémás betegségtől nem szenvedő alanyokat vagy kisebb műtétekre tervezett személyeket) és késői kezdetű, súlyos eozinofil asztmás betegeket fog tartalmazni, akiket Galícia különböző területeiről vesznek fel (Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo és Ourense), Spanyolország. A súlyos eozinofil asztmában szenvedő betegek szűrés során történő diagnosztizálása számos beválasztási és kizárási kritériumon alapul, amelyeket alább ismertetünk [12].

Bevételi kritériumok:

• Súlyos, kontrollálatlan asztma diagnózisa ERS/ATS kritériumok szerint [52].
• Tartós eozinofília a vérben (>300 sejt/μL) ≥ két alkalommal (több mint 4 hét az egyes mérések között).
• Gyakori exacerbációk (évente ≥ kettő), úgy definiálva, mint egy ≥ 3 napos asztmakontroll hiányának időszaka, amely szisztémás kortikoszteroid kezelést és/vagy sürgősségi osztály (ED) látogatást és/vagy kórházi kezelést igényel.
• A tájékozott beleegyező nyilatkozat aláírása, és beleegyezik, hogy betartja a vizsgálat során tett összes látogatást és az ezzel járó összes eljárást.

Kizárási kritériumok:

• Dohányzási előzmények: Jelenlegi vagy korábbi dohányosok, akiknek dohányzási múltja ≥10 dobozév (csomagévek száma = (napi cigaretták száma/20) x elszívott évek száma). Korábbi dohányosnak minősül az a résztvevő, aki az 1. látogatás előtt legalább 6 hónappal leszokott a dohányzásról.
• Az asztmától eltérő, klinikailag fontos tüdőbetegség (pl. aktív tüdőfertőzés, krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD), bronchiectasia, tüdőfibrózis, cisztás fibrózis, elhízással összefüggő hipoventilációs szindróma, tüdőrák, alfa-1-antitripszin-hiány és primer ciliáris diszkinézia) vagy valaha tüdő- vagy szisztémás betegséggel diagnosztizáltak , az asztmán kívül, amelyek emelkedett perifériás eozinofilszámmal járnak (pl. allergiás bronchopulmonalis aspergillosis/mycosis, Churg-Strauss szindróma, hipereozinofil szindróma).
• Bármilyen rendellenesség, beleértve, de nem kizárólagosan a szív- és érrendszeri, gasztrointesztinális, máj-, vese-, neurológiai, mozgásszervi, fertőző, endokrin, metabolikus, hematológiai, pszichiátriai vagy súlyos testi károsodást, amely a vizsgáló véleménye szerint nem stabil.
• Rosszindulatú daganat: Jelenlegi rosszindulatú daganat vagy korábbi rákbetegség remisszióban.
• Antibiotikumot vagy vírusellenes gyógyszert igénylő akut felső vagy alsó légúti fertőzések a látogatást megelőző 30 napon belül 1.
• Xolair: Olyan résztvevők, akik korábban omalizumabot (Xolair) vagy más monoklonális antitestet kaptak.
• Azok a résztvevők, akik az 1. látogatást megelőző 30 napon belül szisztémás kortikoszteroidokat kaptak [53].
• Terhesség: terhes vagy szoptató résztvevők.
• 2-es vagy magasabb elhízási osztály (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Minta nagysága

• Az egészséges kontrollok kohorsza (n=15) csak a T = 0-nál történő elemzéshez.

• n=15, súlyos eozinofil asztmában szenvedő alanyból álló csoport, akik mepolizumab-kezeléssel kezdik a jelenleg felírt gyógyszereik módosítása nélkül. Utánkövető vizsgálati látogatások az eredeti vizsgálati látogatás után 4 (T4), 16 (T16) és 32 (T32) héttel (T=0).

  • A mintanagyság indoklását a statisztikai részben ismertetjük.

A beiratkozás várható aránya Mivel ez egy többközpontú vizsgálat lesz, várhatóan legalább 2 súlyos eozinofil asztmás beiratkozási arányt érünk el a mepolizumab-kezeléssel kezdődően havonta (4 hét) minden kórházban (összesen = 8 havonta). Ez azt jelenti, hogy a 15 alanynak a vizsgálat első 36 hetében mepolizumab-kezelést kell beütemezni, és elegendő idejük van a vizsgálat befejezésére 72 hét (1,5 év) alatt. Arra is számítunk, hogy az alanyok legalább 90%-a befejezi ezt a vizsgálatot.

A tanulmány kezdetének becsült dátuma: 2020. december A tanulmány befejezésének becsült időpontja: 1,5 év (72 hét)

Tanulmánytervezés és módszerek

2. ábra Tanulmányterv. Ez az ábra sematikusan mutatja be a vizsgálat klinikai és kísérleti részét is.

Ez egy megfigyeléses, longitudinális, prospektív és többközpontú vizsgálat, amely mind a korai (4 hét), mind a késői (16 és 32 hét) válaszreakciót értékeli súlyos eozinofil asztmás betegek mepolizumab-kezelésére. A vizsgálatot Dr. Francisco Javier González Barcala (CHUS Pneumológiai Szolgálata) vezeti. Dr. Barcala egy klinikai vizsgálat nemzeti koordinátora, valamint 41, illetve 19 klinikai vizsgálat fő- és alvizsgálója volt. Ezen kívül Dr. Barcala 7 kutatási projekt vezető kutatója, további 7 projekt munkatársa, és több mint 120 releváns publikációt publikált (peer-reviewed és JCR-indexelt) a légúti betegségek, főként az asztma területén.

A tanulmányban a Multidiszciplináris Asztma Egység más tagjai is részt vesznek (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Dr. Salgado projektmenedzser 11 kutatási projektben vett részt, és 28 kutatási cikke van az immunológia, biokémia, proteomika és légúti betegségek területéhez tartozó, nagy hatású folyóiratokban. Ezen túlmenően a projekt többi résztvevője széleskörű tapasztalattal rendelkezik saját területükön, mind az alapkutatás, mind a transzlációs kutatás terén. Ők Dra. Marina Blanco Aparicio, az A Coruña Egyetemi Kórházkomplexum (CHUAC) asztma osztályáért felelős, Dr. Uxío Calvo a Ferroli Egyetemi Kórházkomplexumban (CHUF) és Coral González az Ourense-i Egyetemi Kórházkomplexumban (CHUO) , Mar Mosteiro a vigói Alvaro Cunqueiro kórházban; Dolores Corbacho a Povisa-Vigo Kórházban. A predoktori fázisban 12 hónapra kutatót kell alkalmazni, aki a transzkriptomikai és proteomikai vizsgálatok, valamint az RTqPCR, áramlási citometria és ELISA vizsgálatok minta-előkészítését végzi. Ez a kutató Dr. Francisco Javier Salgado Castro és Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplináris Asthma Unit, CHUS) felügyelete alatt áll. A proteomikai kísérleteket Dr. Susana Belén Bravo López és María García Vence, akik a Santiago de Compostelai Sanitary Research Foundation (FIDIS) Proteomikai Platformjában dolgoznak. Az nCounter® elemzést a GENVIP csoport (Genetika, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), a FIDIS által kínált szolgáltatáson keresztül hajtják végre.

A kutatási projekt minimálisan invazív lesz (pl. nem végeznek bronchoszkópos vizsgálatokat), de a protokollt felül kell vizsgálni és jóvá kell hagynia a spanyolországi Galicia Klinikai Kutatási Etikai Bizottságának. Csak tizenöt olyan beteget vonnak be ebbe a vizsgálatba, akik megfelelnek a későn jelentkező súlyos asztma diagnosztizálásának kritériumainak, és akiket mepolizumab kezelésre terveztek, és aláírják a beleegyező nyilatkozatot. A különböző klinikai csoportok ugyanazt a protokollt fogják követni. A demográfiai, valamint a klinikai, hematológiai és biokémiai változók szerepelnek majd egy adatbázisban. Az allergiás szenzibilizáció ellenőrzésére a gyakori allergénekre és az allergén-specifikus IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) bőrszúrási tesztet alkalmaznak. A tüdőfunkciós paraméterek (kilégzési térfogat az 1. másodpercben (FEV1), a kényszerített vitálkapacitás (FVC) és a FEV1/FVC arány) szintén elemzésre kerülnek. A spirometriát a hörgőtágító alkalmazása előtt és után végezzük. Elvégzik az Asthma Control Test (ACT) és az Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) kérdőívet. Az asztmás betegeknek a betegség stabil fázisában kell lenniük (pl. exacerbációk hiánya legalább 4 hétig a mintavétel előtt). Az exacerbációkat a standard klinikai irányelvek szerint kell kezelni. A betegek (n=15) 100 mg szubkután mepolizumab injekciót kapnak 4 hetes időközönként, vér- és szérummintákat (2-3 EDTA cső; 1 SST cső) pedig T=0, 4, 16 és 32 héten. a kezelésre adott korai (4 hét) és késői (16 és 32 hét) válaszreakció értékelése céljából.

Mód

• Csövek: EDTA (teljes vér) és SST (szérum)

• Eozinofilek tisztítása

  • Az eozinofilek teljes vérből (heparin csövek) izolálhatók a Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (130-104-466 katalógus) vagy az EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (17956. katalógus) segítségével, mindkét negatív szelekciós eljárás érintetlen alkészleteket eredményez. ezek a leukociták. Legalább 1,0-4,0 körül számítunk x 106 sejt ~20 ml vérből, de magas életképességű és tisztaságú (>95%) is.

• ELISA vizsgálatok.

  • Szérummintagyűjtés: IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 lyuk), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalógusszám: DY291) és IGF-BP3 (humán IGFBP-3) mérése DuoSet ELISA, R&D Systems, katalógusszám: DY675) ELISA segítségével.

• Teljes RNS tisztítás eozinofilektől és nCounter nanoString analízis (Felfedezésen alapuló/hipotézisgeneráló megközelítés):

  • Az egészséges kontrollokból (T=0) és betegekből (T=0, 4, 16 és 32 hét) származó tisztított eozinofileket -80ºC-on RNAlater oldatban (Ambion, Paisley, UK) tároljuk. A teljes RNS-t RNeasy Mini kit (Qiagen) segítségével izoláljuk, és az RNS minőségének és koncentrációjának (Nanodrop) ellenőrzése után -80 °C-on tároljuk.
  • Az nCounter® platform (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) egy multiplex módszer, amely lehetővé teszi akár 800 RNS, DNS vagy fehérje célpont mennyiségi meghatározását. Ami az mRNS molekulákat illeti, ez a technológia minden mRNS oldatban történő hibridizálásán alapul két komplementer oligonukleotidhoz: egy biotinilált mRNS-specifikus próbához és egy mRNS-specifikus oligonukleotidhoz, amely hat fluorokróm (négy különböző szín) szekvenciális kombinációját tartalmazza, amelyek fluoreszcenst hoznak létre. vonalkód, amely azonosítja a kimutatott specifikus mRNS-t. Miután mindkét szonda feleslegét eltávolítottuk, a hibridizált komplexeket biotin-sztreptavidin kölcsönhatáson keresztül befogjuk, és a patronon egymáshoz igazítjuk, hogy az nCounter készülék ki tudja olvasni ezeket a „vonalkódokat”. Ezen lépések végrehajtásához az nCounter platform két műszerből áll: a Prep Stationből, amely a hibridizált komplexek tisztítását és rögzítését végzi a kazetta felületére, valamint a Digital Analyzer (DA) szkennerből, amely azonosítja és számolja az egyes mintákhoz rögzített vonalkódokat. Ez a kvantitatív analízis Ezért minden miRNS egyedileg számszerűsíthető (abszolút mennyiségi meghatározás; számlálások) nehéz mintákból (például eozinofilekből), anélkül, hogy szükség lenne egyéb követelményekre, mint például mRNS-cDNS konverzióra (RT) vagy DNS-amplifikációra (qPCR), ami kisebb az adatok változékonysága (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Ezenkívül a bemeneti anyag mennyisége alacsony (25 ng-300 ng mRNS), és származhat FFPE-eredetű RNS-ből, teljes RNS-ből, fragmentált RNS-ből, sejtlizátumokból és válogatott sejtekből. Ezt követően az nCounter-adatokat normalizálják, kivonják a háttérzajt, és további korrekciót hajtanak végre, hogy figyelembe vegyék az extrakció hatékonyságát (a miRNS-ek kivonása előtt meghatározott mennyiségben a mintához hozzáadott spike-in miRNS-ek expressziója alapján számítva). ). A normalizálás az R NanoStringNorm csomag használatával történik. A normalizálás után az adatok log2 transzformációját végezzük, majd a LIMMA Bioconductor csomag segítségével elemzik, hogy azonosítsuk azokat az mRNS-eket, amelyek mepolizumab-kezelés során eltérő bőséget mutatnak. Ez az elemzés nem tart tovább 24 óránál.

• RTqPCR vizsgálatok (hipotézis-vezérelt megközelítés):

  • A mepolizumabbal kezelt betegekből származó eozinofilek alarmin által közvetített aktiválásával (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) és az eozinofilek (FOXP3) szabályozó funkciójával kapcsolatos fehérjéket kódoló mRNS-ek szintjének elemzéséhez a teljes RNS-t cDNS-vé írják át. (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) és -80 °C-on tároljuk. A qPCR-t (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) egy LightCycler® 96 műszerrel (Roche Life Science) hajtják végre, és a FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R és a HPRT1 gén expressziójának elemzésére használják (endogén kontroll).

• Áramlási citometriai vizsgálatok (hipotézis-vezérelt megközelítés):

  • EDTA-val kezelt perifériás vérminták egészséges kontrolloktól (n=15; T0) és mepolizumabbal kezelt betegektől (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Jelöljön meg 100 μL/csöve teljes perifériás vért (EDTA) specifikus és izotípus-egyeztetett kontroll antitestekkel (BD). Vörösvérsejtek lízise FACSlyse (BD) segítségével. Elemzés FACSCalibur áramlási citométerrel (BD). Használja az FSC/SSC-t a granulociták kiválasztásához; majd SSC vs CCR3 (FITC) az eozinofilek és a neutrofilek elkülönítésére. Kapu eozinofilek:

    • 1. multimarker panel (Regulatory proteins in Eosinophil): CD16 és galectins-1/10 mérése [41-44].
    • 2. multimarker panel (Aktivációs receptorok az eozinofilekben): CD48 (csökkent a közepesen súlyos asztmában szenvedő eozinofilek száma az egészséges kontrollokhoz (HC) képest [tanulmányaink, 54]), CD44 és CD11b mérése.
    • 3. multimarker panel (eozinofil alcsoportok): Az alcsoportok elemzése a Siglec-8, a CD62L (L-selectin) és az IL-5Rα expressziója alapján [40].

• Az eozinofil proteom elemzése (Felfedezésen alapuló/hipotézisgeneráló megközelítés):

  • Akár 50 x 103 sejtre lesz szükség a proteomikai vizsgálatok elvégzéséhez. 1 ml vérből körülbelül 50-400 x 103 sejtet várunk.
  • Az izolált eozinofileket (50x103 sejt) centrifugálással összegyűjtjük, mossuk, és proteináz inhibitorokat tartalmazó lízispufferben újraszuszpendáljuk. Ezt követően az oldhatatlan anyagot centrifugálással eltávolítják, és a sejtfelülúszókat -80 °C-on tárolják.
  • Az eozinofilek esetében a teljes proteom jellemzését tripszin emésztés után DDA módszerrel LC-MSMS rendszerben végezzük. Ehhez a megközelítéshez 15 egészséges donor és 15 beteg (T0, T4, T16, T32) mintáit használjuk fel. Csak azokat a fehérjéket választják ki, amelyek 1%-os globális hamis felfedezési arányról (FDR) vagy annál jobbról számoltak be [55, 56].
  • Az 5 vizsgálati csoportból (egészséges donorok és betegek a kezelés utáni T0, T4, T16 és T32 időpontban) fehérje "poolokat" használunk, amelyeket (1-DE) 5-6 sávra osztanak, és mindegyikből kivonják a fehérjéket. A megfelelő peptideket előállítva és MS/MS-sel elemezve nagy számú fehérjét tartalmazó SWATH-könyvtárat állítanak elő, amelyen a kvantifikációt elvégzik. Miután a könyvtár elkészült, és fenntartotta az LC-MS / MS (TripleTOF) szabványos feltételeit, SWATH-MS analízist végzünk ("információfüggő adatgyűjtés" módszer vagy IDA; "Célzott címkementes proteomika") a mintákon 15 egészséges donor és 15 beteg (T0, T4, T16, T32). Ezzel a vizsgálattal azonosíthatjuk azokat a fehérjéket, amelyek szignifikáns különbségeket mutatnak a vizsgált csoportok között. Csak azokat a fehérjéket választjuk ki, amelyek P<0,05 és a szoros változás ≥1,5 [56-59].

A vizsgálat végpontjai:

A vizsgálatba bevont összes személy demográfiai adatait a bázisidőszakban szerezzük be. Emellett számos adatot is gyűjtenek, többek között az asztma anamnézisét, a tüdőfunkciós paramétereket, a bőrszúrási tesztet, az allergén-specifikus IgE-t, az AQLQ pontszámot, az ACT pontszámot, az exacerbációk számát és a prednizon fogyasztást. A Pneumológiai Szolgálat következő, T0, 4, 16 és 32-es látogatásai során a mepolizumabbal kezelt betegeket nyomon követik. Ez magában foglalja a tüdőfunkció (FEV1, FEV1/FVC), biokémiai és hematológiai paraméterek mérését.

Perifériás vér- és szérummintákat gyűjtenek, és az eozinofileket mágnesesen tisztítják T0, T4, T16 és T32-nél, és áramlási citometriát, RTqPCR-t és proteomikai elemzéseket, valamint immunológiai vizsgálatokat végeznek. Az összes kísérleti változót (pl. az eozinofil fehérjék bősége a proteomikai vizsgálatokban, az eozinofil aktivációs markerek stb.) összefüggésbe kell hozni a klinikai paraméterekkel (pl. tüdőfunkció, asztmakontroll, exacerbációk száma), hogy értékelni lehessen e változók összefüggését. a kezelésre adott válasszal. A mepolizumabra adott kedvező választ akkor tekintjük, ha az alábbi kritériumok egyike teljesül:

• A megfelelő asztmakontroll eléréséhez ACT ≥20 [60], vagy/ ≥3 pontos változás, ami minimálisan fontos különbséget jelent.
• Az exacerbációk éves arányának 48%-os csökkentése. Az exacerbációt úgy határozzák meg, mint a tünetek fokozódását, amelyek szisztémás kortikoszteroid kezelést igényelnek ≥3-ig, vagy előre nem tervezett orvosi konzultációt igényelnek, hasonlóan a mepolizumabbal végzett klinikai vizsgálatokban tapasztaltakhoz [20, 61].
• 50%-kal csökkentheti az asztma exacerbációja miatti kórházi felvételek éves arányát, hasonlóan a klinikai vizsgálatok eredményeihez [62].
• A szisztémás kortikoszteroidok éves medián dózisának 50%-os csökkentése [63].

• A vizsgálat elsődleges végpontjai:

  • IGF-1, IGF-BP3 és IGF-ALS szint a szérumban
  • Transzkriptomikus (nanoString)/mRNS expressziós adatok: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomikai adatok
  • Áramlási citometriai adatok: CD16, galectins-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L és IL-5Rα expressziója

• Másodlagos végpontok vizsgálata:

  • Tüdőfunkciós paraméterek (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hematológiai paraméterek (pl. eozinofilek száma).
  • Egyéb klinikai és biokémiai változók (pl. IgE vagy más immunglobulinok).
  • Exacerbációk száma, prednizon fogyasztás, ACT pontszám, AQLQ pontszám.

Statisztikai terv vagy adatelemzés:

Graph Pad Prism lesz használva a grafika létrehozásához. A statisztikai vizsgálathoz IBM SPSS, Statistics 22.0 vagy R. kerül felhasználásra. Az elemzések során segítségünkre lesz az USC Statisztikai és Operatív Kutatási területe (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Mintaméret A mintanagyság (N) kiszámítása G*Power 3.1.9.4 [64] segítségével történt. Ezen analízisek során N szükséges statisztikai szignifikanciát számolunk ki egy F tesztben (ANOVA: Ismételt mérések, faktorokon belül), adott α (0,05), teljesítmény (1-β, 0,95), mérések száma (T0, T4, T16 ill. T32), és a hatás mérete (f = 0,4; nagy hatásméret, ami klinikailag relevánsabb eredményt ad). Az N kimenet 15 volt, a kritikus F=2,82705.

Klinikai, áramlási citometriai és transzkriptómiai adatokhoz. A HC és a (kezelés előtti) T0-ban lévő betegek keresztmetszeti összehasonlítása normál eloszlást követően és homogenitású variancia esetén t-próbával történik. A nem normál eloszlású változókhoz Mann-Whitney U tesztet fogunk használni. A különböző vizsgálati változókban a mepolizumab-kezelés hatására bekövetkező változásokat (longitudinális vizsgálat; T0, T4, T16 és T32) RM-ANOVA segítségével teszteljük. A többváltozós analízist (például PCA, felügyelet nélküli klaszterezés), valamint a funkcionális dúsítási analízist áramlási citometriával, és mindenekelőtt transzkriptomikai adatokkal végezzük.

A teljes proteom jellemzéséhez és a kvantitatív SWATH analízishez Az ABSciex ProteinPilotTM 5.0.1 szoftverét használjuk, amely a ParagonTM algoritmussal rendelkezik az adatbázis-kereséshez és a ProgroupTM az adatcsoportosításhoz. Az adatok keresése egy Human-specifikus Uniprot adatbázis használatával történik. A hamis felfedezési arány nemlineális illesztési módszerrel történik, amely csak azokat az eredményeket jeleníti meg, amelyek 1%-os vagy annál jobb globális hamis felfedezési arányt jelentettek [65].

A funkcionális elemzést különböző nyílt hozzáférésű szoftverek végzik. FunRich (Functional Enrichment elemzési eszköz) a funkcionális gazdagításhoz és interakciós hálózatelemzéshez (http://funrich.org/index.html). Statisztikákhoz a FunRich hipergeometrikus tesztet, BH-t és Bonferronit használ [66, 67]. A DAVID-t (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) vagy a GO-t (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) fogjuk használni a génontológia gazdagításához és a fehérje-fehérje interakcióhoz, hálózathoz felépítése és klaszterezése, akkor a String-et fogjuk használni (https://string-db.org/) vagy Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

A SWATH adatokhoz a MarkerView szoftver többváltozós statisztikai elemzést ad nekünk főkomponens-elemzés (PCA) használatával, hogy összehasonlítsa a minták adatait. Az egyes fehérjék átlagos MS csúcsterületét az egyes minták SWATH-MS-ének ismétléseiből származtatják, majd Student-féle t-teszt analízist végeznek a MarkerView szoftver segítségével a minták összehasonlításához, az összes átmenet átlagolt területösszege alapján. minden egyes fehérje. A t-próba megmutatja, hogy az egyes változók mennyire különböztetik meg a két csoportot, P-értékként jelentve. A könyvtár számára a különböző mennyiségben előforduló fehérjéket (p-érték <0,05) választjuk ki, 1,5 felfelé vagy lefelé szabályozott fehérjékkel.

Korlátozások

• Amint azt korábban megjegyeztük, 15 alany kap mepolizumabot a vizsgálat első felében (36 hét). Várakozásaink szerint az alanyok legalább 90%-a befejezi ezt a vizsgálatot. A klinikai vizsgálatok során azonban gyakori események a betegek lemorzsolódása és a be nem tartás (vagy nem-megfelelés). Ebben az esetben a minta mérete arányosan megnő.
• A jelen projektet a mepolizumabra reagáló molekuláris biomarkerek felfedezésének tanulmányaként javasolták. Az ilyen jellegű tanulmányok célzott/hipotézisvezérelt vagy tágabb/nem célzott ("-omics" technológiák) megközelítéssel is beszállhatnak. Tisztában vagyunk vele, hogy ebben a kicsi és prospektív/koncepciót bizonyító tanulmányban nehéz lehet prediktív markereket találni. Jelen projektben kettős megközelítést javasolunk ennek a kockázatnak a minimalizálására. Egyrészt modern és nem célzott módszertanok működnek, és nagyon érzékenyek az alacsony koncentrációjú fehérjék kimutatására (SWATH MS), vagy egyszerűsített protokollok a nehéz minták kezelésére (jó minőségű RNS előállítása eozinofilekből mindig kihívást jelent a bőséges fehérjék jelenléte miatt mint az EDN, amely az RNase család tagja), és csökkenti a technikai szórást (pl. nCounter nanoString) a mintaméretek lerövidítése érdekében. Másrészt a hipotézisvezérelt megközelítések (pl. áramlási citometria, RT-qPCR, ELISA), amelyek előnyei a nagyobb hitelesség, az I. típusú (azaz hamis felfedezés) és a II. típusú hibák kisebb kockázata, valamint a jövőbeni könnyű replikáció. eredményekről. Ezeket a célzott módszereket arra is használják, hogy megerősítsék a nem célzott transzkriptomikai/proteomikai megközelítésekkel kapott klinikailag releváns (nagy hatásméret) és szignifikáns (p-érték < 0,05) különbségeket.
• Egy másik lehetséges korlátozás az eozinofilek száma, amely egyes betegeknél potenciálisan alacsony lehet a mepolizumab-kezelés után (50 x 103 vagy kevesebb). Ezért ezeknél a betegeknél 1 vagy 2 ml-nél több vér tisztítására lehet szükség, hogy elegendő sejtet kapjunk a proteomikai és transzkriptomikai kísérletek elvégzéséhez. Ezt a kérdést a vizsgálati jegyzőkönyvben és a projekt költségvetésében is figyelembe vettük.
• Végül, a TripleTOF egy rendkívül érzékeny tömegspektrométer, amelyet arra terveztek, hogy mélyebbre ásson olyan összetett mintákba, mint az eozinofil proteom. A jelenlegi tömegspektrométerek nagy érzékenysége a nanoLC kétdimenziós sémáival kombinálva lehetővé teszi nagyobb számú fehérje (>1000) és analitok kimutatását az attomoláris tartományban (10-18), ami elegendő az alacsony koncentrációjú intracelluláris fehérjék, például kemokinek vagy citokinek kimutatásához. Így a TGFα-t, a TGFβ1-et, a CCL5-öt, a CCL23-at, a CSF1-et, a CCL18-at, a CCL24-et, a CXCL12-t és az IL-18-at sikerült kimutatni nanoLC-MS/MS-sel (Q-TOF), de másokat, például IL-5-öt vagy IL-13-at nem [69 ]. Ez a várható korlátozás a nagy mennyiségben előforduló fehérjékből származó peptidek (például eozinofil granulátum fehérjék) jelenlétének köszönhető, amelyek LC-MS/MS alkalmazásokban elnyomják a kis mennyiségben előforduló fehérjékből származó peptidek ionizációját. Ez a bőséges fajok kimutatott fehérjéinek listáján túlreprezentáltsághoz vezet, mint például a Charcot-Leyden kristályfehérje (CLC, galectin-10), ami még mindig érdekes a jelen projekt szempontjából, mivel szabályozó képességgel rendelkező eozinofileket azonosít. A minták összetettségének csökkentése és az alacsony fehérjék kimutatásának javítása érdekében azonban különböző kiürítési (például ACN-kiürítés, ultraszűrés, 1-DE) és dúsítási módszerek (pl. CPLL-ek) léteznek, amelyek segítségével kimutatható. érzékenység. Opcionálisan célzott megközelítések, például nagy multiplex immunológiai vizsgálatok (pl. Olink Immune Response, Olink Inflammation vagy Olink Immuno-Oncology panelek; https://www.olink.com/) Előnye a nagy detektálási érzékenység kis mennyiségű biológiai minta (pl. sejtlizátum) mellett, bár egyszerre csak 92 fehérje biomarker mérését teszi lehetővé.