Wirkung von Mepolizumab auf schweres eosinophiles Asthma (EMESEA)

Hypothesen

Hº1. Die Spiegel bestimmter Oberflächenmoleküle auf Eosinophilen oder das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter Proteine ​​im Proteom dieser Leukozyten-Untergruppe vor der Behandlung mit Mepolizumab können als prädiktive/prognostische Marker für das Ansprechen auf diese biologische Substanz verwendet werden.

Hº2. Mepolizumab verändert die Häufigkeit mehrerer Oberflächen- oder intrazellulärer Proteine ​​in Eosinophilen als Ergebnis im Zusammenhang mit Änderungen ihres Aktivierungsstatus, ihrer Migrationsfähigkeit, ihrer regulatorischen/Effektorfunktion oder ihrer Untergruppenzusammensetzung.

Hº3. Schwere eosinophile Asthmatiker mit spätem Ausbruch haben Erhöhungen der Serumkonzentration verschiedener Mitglieder der IGF-Familie (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) und die Behandlung mit Mepolizumab reduziert diese Spiegel und verhält sich zusammen mit der Anzahl von als Biomarker für das Ansprechen Eosinophile und klinische Exazerbationen.

Ziele oder Forschungsfragen

OB (Erstrebungsziel): Entdeckung prädiktiver/prognostischer Biomarker für das Ansprechen auf Mepolizumab unter Verwendung von Durchflusszytometrie-, Transkriptomik- und Proteomiktechnologien.

• OB1.- Zur Identifizierung von Veränderungen der Oberflächenmarker von Eosinophilen und Eosinophilen-Subpopulationen als Reaktion auf die Behandlung mit Mepolizumab unter Verwendung von Durchflusszytometrietechniken. Dieses Ziel verteilt sich auf folgende Leistungen (DE):

  • DE1.1: Auswahl von 15 gesunden Kontrollen
  • DE1.2: Diagnose von Patienten mit spät einsetzendem schwerem eosinophilem Asthma und Auswahl von 15 Patienten, die die Kriterien erfüllen, Mepolizumab erhalten sollen und die Einverständniserklärung unterzeichnen.
  • DE1.3: Erstellung der ersten Datenbank für gesunde Kontrollen und Asthmapatienten mit demografischen, klinischen, hämatologischen und biochemischen Informationen.
  • DE1.4: Entnahme und Verarbeitung von Serum- (1 SST-Röhrchen) und Vollblutproben (1-2 Röhrchen) von gesunden Spendern (T0) und mit Mepolizumab behandelten Patienten (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Durchflusszytometrie-Assays mit Multimarker-Panels 1 (regulatorisch), 2 (Aktivierung) und 3 (eosinophile Untergruppen) (siehe unten).
  • DE1.6: Vervollständigen Sie die Datenbank mit klinischen, hämatologischen, biochemischen und durchflusszytometrischen Daten, die zu den Zeiten T4, T16 und T32 generiert wurden. Endgültige uni- und multivariante statistische Analyse.
  • DE1.7: Veröffentlichung der Ergebnisse.

• OB2.- Transkriptomische Analyse zur Identifizierung von mRNAs innerhalb des eosinophilen Transkriptoms, die als Reaktion auf die Behandlung mit Mepolizumab erhöhte oder verringerte Spiegel aufweisen. Dieses Ziel verteilt sich auf folgende Leistungen (DE):

  • DE2.1: Richten Sie ein Eosinophilen-Isolationsprotokoll ein und überprüfen Sie die Zellreinheit durch Durchflusszytometrie.
  • DE2.2: Reinigung von Eosinophilen von 15 gesunden Spendern (T0) und 15 Patienten (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Gesamt-RNA-Extraktion aus Eosinophilenlysaten, Bestimmung der Qualität und Quantität der RNA und Lagerung bei -80 °C.
  • DE2.4: Entdeckungsbasierter/hypothesengenerierender Ansatz. Bewertung der Konzentrationen von 770 humanproteinkodierenden mRNAs, die mit der Rekrutierung, Aktivierung und Effektorfunktionen myeloider Zellen in Verbindung stehen, mittels einer direkten Multiplex-Molekularmessplattform namens nCounter® NanoString) in Kombination mit einem vorgefertigten „nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)“ (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). Aufgrund der hohen wirtschaftlichen Kosten wird dieser Teil der Studie nur mit Eosinophilenproben von gesunden Spendern (T = 0) und zwei Zeitpunkten bei Patienten (T = 0 und T = 16) durchgeführt.
  • DE2.5: Verarbeitung der gewonnenen Daten und anfängliche statistische Analyse.
  • DE2.6: Validierung von nCounter®-Daten und hypothesengetriebener Ansatz mit einer etablierten quantitativen Technik. Führen Sie Retrotranskriptions- und qPCR-Analysen dieser mRNAs in Eosinophilen durch, die gemäß der nCounter®-Studie die größten Änderungen der Häufigkeit als Reaktion auf die Mepolizumab-Behandlung aufweisen. Darüber hinaus werden einige zusätzliche mRNAs, die nicht im Panel „nanoString Myeloid Innate Immunity“ enthalten sind, wie FOXP3 (regulatorische Funktion), CRLF2, ST2 oder IL-7R (Zytokinrezeptoren; Aktivierung), analysiert. Das HPRT1-Gen wird in dieser Reihe von RTqPCR-Experimenten als Haushaltsgen verwendet.
  • DE2.7: Uni- und multivariante statistische Analysen.
  • DE2.8: Veröffentlichung von Transkriptomergebnissen.

• OB3.- Proteomik-Profiling zur Identifizierung von Proteinen mit unterschiedlicher Häufigkeit innerhalb der Eosinophilen als Reaktion auf die Behandlung mit Mepolizumab. Dieses Ziel verteilt sich auf folgende Leistungen (DE):

  • DE3.1: Lyse von Eosinophilen, Entfernung von unlöslichem Material durch Zentrifugation, Proteinquantifizierung (BCA) und Lagerung der Zellüberstände bei -80°C.
  • DE3.2: Entwicklung eines Gesamtproteom-Analyseprotokolls mit einer Data Dependent Acquisition (DDA)-Methode unter Verwendung einer Flüssigchromatographie (LC)-MS / MS-Technologie (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Überprüfung der biologischen Variabilität (biologische Replikationen) und Technik (technische Replikationen), um die Reproduzierbarkeit der Tests zu überprüfen.
  • DE3.4: Unter Beibehaltung der standardisierten Bedingungen der LC-MS/MS (TripleTOF), Erstellung einer Bibliothek für SWATH (sequentielle Fenstererfassung aller theoretischen Massenspektren) mit möglichst vielen eosinophilen Proteinen.
  • DE3.5: Durchführung einer SWATH-MS-Analyse in Proben von 15 gesunden Spendern und 15 Patienten (T0, T4, T16, T32) ("Information-Dependent Acquisition"-Methode oder IDA; "Targeted Label-Free Proteomics").
  • DE3.6: Verarbeitung der gewonnenen Daten und anfängliche statistische Analyse.
  • DE3.7: Überprüfung des Panels von Biomarkern, die mit einer anderen Technologie erhalten wurden (z. B. Selected Reaction Monitoring / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Endgültige uni- und multivariante statistische Analyse. Identifizieren Sie Proteine ​​mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen (P <0,05) und mindestens einer fachen Änderung ≥ 1,5.
  • DE3.9: Veröffentlichung proteomischer Ergebnisse

• OB4. Überprüfen Sie, ob Patienten mit schwerem eosinophilem Asthma mit spätem Beginn erhöhte Spiegel von IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS in Serumproben aufweisen, ob das Ansprechen auf Mepolizumab von den Spiegeln dieser Marker abhängt und ob die Behandlung mit diesem biologischen Wirkstoff die Konzentration in verringert Serum dieser Mitglieder der IGF-Familie. Dieses Ziel verteilt sich auf folgende Leistungen (DE):

  • DE4.1: Analyse von IGF-1, IGF-BP3 und IGF-ALS durch ELISA
  • DE4.2: Uni- und multivariante statistische Analyse experimenteller Daten
  • DE4.3: Veröffentlichung der Ergebnisse

Veröffentlichung der Ergebnisse:

Wir werden uns bemühen, im ersten Jahr der Studie auf einem spanischen Respiratory Congress (SEPAR) sowie auf dem European Respiratory Congress (ERS) eine Mitteilung zu präsentieren, die sich aus der Untersuchung der klinischen Daten von Patienten vor und nach der Verabreichung von Mepolizumab ergibt . Darüber hinaus erwarten wir die Veröffentlichung von 3 Veröffentlichungen in Q1-Journalen sowie von weiteren 2 oder 3 Kongressmitteilungen, die aus experimentellen Studien resultieren.

Studienpopulation Die Studienpopulation umfasst gesunde Kontrollpersonen (d. h. Probanden ohne Asthma, Allergie, systemische Erkrankungen oder mit geplanten kleineren Operationen) und Patienten mit schwerem eosinophilem Asthma mit spätem Ausbruch, die aus verschiedenen Gebieten Galiciens (Santiago de Compostela, A Coruña, Lugo, Vigo und Ourense), Spanien. Die Diagnose von Patienten mit schwerem eosinophilem Asthma beim Screening basiert auf mehreren Einschlusskriterien und Ausschlusskriterien, die wir unten beschreiben [12].

Einschlusskriterien:

• Diagnose von schwerem unkontrolliertem Asthma nach ERS/ATS-Kriterien [52].
• Anhaltende Eosinophilie im Blut (> 300 Zellen/μl) bei ≥ zwei Gelegenheiten (mehr als 4 Wochen zwischen jeder Messung).
• Häufige Exazerbationen (≥ zwei pro Jahr), definiert als ein Zeitraum von ≥ 3 Tagen ohne Asthmakontrolle, der eine Behandlung mit systemischen Kortikosteroiden und/oder einen Besuch in der Notaufnahme und/oder einen Krankenhausaufenthalt erfordert.
• Unterzeichnung der Einverständniserklärung und Zustimmung zur Einhaltung aller Studienbesuche und aller damit verbundenen Verfahren.

Ausschlusskriterien:

• Rauchergeschichte: Aktuelle Raucher oder ehemalige Raucher mit einer Rauchergeschichte von ≥10 Packungsjahren (Anzahl der Packungsjahre = (Anzahl Zigaretten pro Tag/20) x Anzahl der gerauchten Jahre). Als ehemaliger Raucher gilt ein Teilnehmer, der mindestens 6 Monate vor Besuch 1 mit dem Rauchen aufgehört hat.
• Klinisch bedeutsame Lungenerkrankung außer Asthma (z. aktive Lungeninfektion, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Bronchiektasie, Lungenfibrose, zystische Fibrose, Hypoventilationssyndrom in Verbindung mit Fettleibigkeit, Lungenkrebs, Alpha-1-Antitrypsin-Mangel und primäre Ziliendyskinesie) oder bei denen jemals eine Lungen- oder systemische Erkrankung diagnostiziert wurde , außer Asthma, die mit erhöhten peripheren Eosinophilenzahlen einhergehen (z. allergische bronchopulmonale Aspergillose/Mykose, Churg-Strauss-Syndrom, hypereosinophiles Syndrom).
• Jede Störung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, kardiovaskuläre, gastrointestinale, hepatische, renale, neurologische, muskuloskelettale, infektiöse, endokrine, metabolische, hämatologische, psychiatrische oder schwere körperliche Beeinträchtigung, die nach Meinung des Prüfarztes nicht stabil ist.
• Malignität: Eine aktuelle Malignität oder Krebs in der Vorgeschichte in Remission.
• Akute Infektionen der oberen oder unteren Atemwege, die innerhalb von 30 Tagen vor dem Besuch 1 Antibiotika oder antivirale Medikamente erfordern.
• Xolair: Teilnehmer, die zuvor Omalizumab (Xolair) oder einen anderen monoklonalen Antikörper erhalten haben.
• Teilnehmer, die innerhalb von 30 Tagen vor Besuch 1 systemische Kortikosteroide erhalten haben [53].
• Schwangerschaft: Teilnehmerinnen, die schwanger sind oder stillen.
• Fettleibigkeitsklasse 2 oder höher (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Stichprobengröße

• Kohorte gesunder Kontrollen (n = 15) nur für die Analyse bei T = 0.

• Kohorte von n = 15 Patienten mit schwerem eosinophilem Asthma, die mit einer Mepolizumab-Therapie ohne Änderung ihrer derzeit verschriebenen Medikamente beginnen. Follow-up-Studienbesuche 4 (T4), 16 (T16) und 32 (T32) Wochen nach dem ursprünglichen Studienbesuch (T = 0).

  • Die Gründe für die Stichprobengröße werden im statistischen Abschnitt erläutert.

Erwartete Rekrutierungsrate Da es sich um eine multizentrische Studie handelt, erwarten wir eine Rekrutierungsrate von mindestens 2 Patienten mit schwerem eosinophilem Asthma, die mit einer Mepolizumab-Therapie beginnen, pro Monat (4 Wochen) in jedem Krankenhaus (insgesamt = 8 pro Monat). Das bedeutet, dass die 15 Probanden während der ersten 36 Wochen dieser Studie Mepolizumab erhalten sollten, sodass sie genügend Zeit haben, die Studie in 72 Wochen (1,5 Jahre) abzuschließen. Wir erwarten auch, dass mindestens 90 % der Probanden diese Studie abschließen.

Geschätzter Studienbeginn: Dezember 2020 Geschätzter Studienabschluss: 1,5 Jahre (72 Wochen)

Studiendesign und Methoden

Abbildung 2. Studiendesign. Diese Abbildung repräsentiert schematisch sowohl den klinischen als auch den experimentellen Teil der Studie.

Dies ist eine beobachtende, longitudinale, prospektive und multizentrische Studie zur Bewertung sowohl des frühen Ansprechens (4 Wochen) als auch des späten Ansprechens (16 und 32 Wochen) auf die Mepolizumab-Therapie bei Patienten mit schwerem eosinophilem Asthma. Die Studie wird von Dr. Francisco Javier González Barcala (Pneumology Service am CHUS) geleitet. Dr. Barcala war nationaler Koordinator in einer klinischen Studie sowie Hauptprüfer und Unterprüfer in 41 bzw. 19 klinischen Studien. Darüber hinaus war Dr. Barcala Hauptprüfer von 7 Forschungsprojekten, Mitarbeiter in anderen 7 Projekten und veröffentlichte mehr als 120 relevante Publikationen (Peer-Review und JCR-indexiert) auf dem Gebiet der Atemwegserkrankungen, hauptsächlich Asthma.

An der Studie sind auch andere Mitglieder der multidisziplinären Asthmaeinheit (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Insbesondere der Projektmanager Dr. Salgado war an 11 Forschungsprojekten beteiligt und hat 28 Forschungsarbeiten in hochrangigen Zeitschriften aus den Bereichen Immunologie, Biochemie, Proteomik und Atemwegserkrankungen veröffentlicht. Darüber hinaus verfügen die anderen Teilnehmer an diesem Projekt über eine breite Erfahrung in ihren jeweiligen Bereichen, sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Forschung. Sie sind Dra. Marina Blanco Aparicio, verantwortlich für die Asthmaabteilung des Universitätsklinikums von A Coruña (CHUAC), Dr. Uxío Calvo vom Universitätsklinikum von Ferrol (CHUF) und Coral González vom Universitätsklinikum von Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro im Krankenhaus Alvaro Cunqueiro von Vigo; Dolores Corbacho im Krankenhaus Povisa-Vigo. Für die Probenvorbereitung in Transkriptom- und Proteomstudien sowie RTqPCR-, Durchflusszytometrie- und ELISA-Assays ist die Einstellung eines Forschers in der Prädoktorandenphase für 12 Monate erforderlich. Dieser Forscher wird von Dr. Francisco Javier Salgado Castro und Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplinary Asthma Unit, CHUS) betreut. Proteomik-Experimente werden von Dra durchgeführt. Susana Belén Bravo López und María García Vence, die an der Proteomic Platform der Sanitary Research Foundation von Santiago de Compostela (FIDIS) arbeiten. Die nCounter®-Analyse wird über einen Dienst durchgeführt, der von der GENVIP-Gruppe (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS, angeboten wird.

Das Forschungsprojekt wird minimal-invasiv sein (z. B. keine bronchoskopischen Untersuchungen), aber das Protokoll muss von der Ethikkommission für klinische Forschung von Galicien, Spanien, überprüft und genehmigt werden. Nur fünfzehn Patienten, die die Diagnosekriterien für schweres Asthma mit spätem Ausbruch erfüllen, Mepolizumab erhalten sollen und die Einverständniserklärung unterschreiben, werden in diese Studie aufgenommen. Dasselbe Protokoll wird von den verschiedenen klinischen Teams befolgt. Demografische sowie klinische, hämatologische und biochemische Variablen werden in eine Datenbank aufgenommen. Haut-Prick-Test auf häufige Allergene und das Vorhandensein von allergenspezifischem IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) wird verwendet, um auf allergische Sensibilisierung zu prüfen. Lungenfunktionsparameter (forciertes Exspirationsvolumen in der 1. Sekunde (FEV1), forcierte Vitalkapazität (FVC) und FEV1/FVC-Quotient) werden ebenfalls analysiert. Spirometrie wird vor und nach der Anwendung eines Bronchodilatators durchgeführt. Der Asthma Control Test (ACT) und der Fragebogen Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) werden durchgeführt. Asthmatiker müssen sich in einer stabilen Krankheitsphase befinden (d.h. Fehlen von Exazerbationen für mindestens 4 Wochen vor der Probenentnahme). Exazerbationen werden gemäß den klinischen Standardrichtlinien behandelt. Patienten (n=15) erhalten 100 mg subkutane Injektion von Mepolizumab in 4-Wochen-Intervallen, und Blut- und Serumproben (2-3 EDTA-Röhrchen; 1 SST-Röhrchen) werden bei T=0, 4, 16 und 32 Wochen entnommen, um sowohl das frühe Ansprechen (4 Wochen) als auch das späte Ansprechen (16 und 32 Wochen) auf die Behandlung zu bewerten.

Methoden

• Röhrchen: EDTA (Vollblut) und SST (Serum)

• Eosinophile Reinigung

  • Eosinophile können aus Vollblut (Heparinröhrchen) mit dem Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (Katalog-Nr. 130-104-466) oder dem EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (Katalog-Nr. 17956) isoliert werden, beides negative Selektionsverfahren, die unberührte Teilmengen von ergeben diese Leukozyten. Wir erwarten ungefähr mindestens 1,0-4,0 x 106 Zellen aus ~20 ml Blut, aber auch hohe Lebensfähigkeit und Reinheit (>95 %).

• ELISA-Studien.

  • Serumprobenentnahme: Messung von IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 well), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, Katalog-Nr. DY291) und IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, Katalog #DY675) mittels ELISA.

• Gesamt-RNA-Aufreinigung aus Eosinophilen und nCounter-nanoString-Analyse (entdeckungsbasierter/hypothesengenerierender Ansatz):

  • Gereinigte Eosinophile von gesunden Kontrollen (T=0) und Patienten (T=0, 4, 16 und 32 Wochen) werden bei -80 °C in RNAlater-Lösung (Ambion, Paisley, UK) gelagert. Die Gesamt-RNA wird mit einem RNeasy Mini-Kit (Qiagen) isoliert und nach Überprüfung der RNA-Qualität und -Konzentration (Nanodrop) bei -80 °C gelagert.
  • Die nCounter®-Plattform (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) ist eine Multiplex-Methodik, die die Quantifizierung von bis zu 800 RNA-, DNA- oder Proteinzielen ermöglicht. In Bezug auf mRNA-Moleküle basiert diese Technologie auf der In-Lösung-Hybridisierung jeder mRNA an zwei komplementäre Oligonukleotide: eine biotinylierte mRNA-spezifische Sonde und ein mRNA-spezifisches Oligonukleotid, das eine sequentielle Kombination von sechs Fluorochrome (vier verschiedene Farben) enthält, die eine Fluoreszenz erzeugen Barcode, der die nachgewiesene spezifische mRNA identifiziert. Sobald der Überschuss beider Sonden entfernt ist, werden die hybridisierten Komplexe durch eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung eingefangen und auf der Kartusche ausgerichtet, damit das nCounter-Instrument diese „Barcodes“ lesen kann. Zur Durchführung dieser Schritte besteht die nCounter-Plattform aus zwei Instrumenten, der Prep Station, die die Reinigung der hybridisierten Komplexe und deren Immobilisierung auf der Oberfläche einer Kartusche durchführt, und dem Digital Analyzer (DA), einem Scanner, der die identifiziert und zählt Barcodes, die für jede Probe erfasst wurden. Mit dieser quantitativen Analyse kann daher jede miRNA aus schwierigen Proben (z. B. Eosinophilen) einzeln quantifiziert werden (absolute Quantifizierung; Zählungen), ohne dass weitere Anforderungen wie mRNA-cDNA-Konvertierung (RT) oder DNA-Amplifikation (qPCR) erforderlich sind weniger Datenvariabilität (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). Darüber hinaus ist die Menge an Eingangsmaterial gering (25 ng-300 ng mRNA) und kann aus FFPE-abgeleiteter RNA, Gesamt-RNA, fragmentierter RNA, Zelllysaten und sortierten Zellen gewonnen werden. Anschließend werden die nCounter-Daten normalisiert, das Hintergrundrauschen abgezogen und eine weitere Korrektur durchgeführt, um die Effizienz der Extraktion zu berücksichtigen (berechnet auf der Grundlage der Expression von Spike-in-miRNAs, die der Probe in einer definierten Menge vor der miRNA-Extraktion hinzugefügt werden). ). Normalisierungen werden mit dem R NanoStringNorm-Paket durchgeführt. Nach der Normalisierung wird eine log2-Transformation der Daten durchgeführt und anschließend mit dem LIMMA Bioconductor-Paket analysiert, um diejenigen mRNAs zu identifizieren, die bei der Mepolizumab-Behandlung eine unterschiedliche Häufigkeit aufweisen. Diese Analyse dauert nicht länger als 24 Stunden.

• RTqPCR-Studien (hypothesengetriebener Ansatz):

  • Um die Spiegel von mRNAs zu analysieren, die für Proteine ​​kodieren, die mit der Alarmin-vermittelten Aktivierung von Eosinophilen (CRLF2, ST2, IL-7Rα/CD127) und mit der regulatorischen Funktion von Eosinophilen (FOXP3) von mit Mepolizumab behandelten Patienten zusammenhängen, wird die Gesamt-RNA in cDNA umgeschrieben (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) und bei –80°C gelagert. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) wird in einem LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) durchgeführt und verwendet, um die Expression von FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R und dem HPRT1-Gen (endogene Kontrolle) zu analysieren.

• Durchflusszytometrie-Studien (hypothesengetriebener Ansatz):

  • Mit EDTA behandelte periphere Blutproben von gesunden Kontrollen (n=15; T0) und mit Mepolizumab behandelten Patienten (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Beschriften Sie 100 μl/Röhrchen peripheres Vollblut (EDTA) sowohl mit spezifischen als auch mit Isotyp-abgestimmten Kontrollantikörpern (BD). Erythrozytenlyse mit FACSlyse (BD). Analyse mit einem FACSCalibur-Durchflusszytometer (BD). Verwenden Sie FSC/SSC, um Granulozyten auszuwählen; dann SSC vs. CCR3 (FITC), um Eosinophile von Neutrophilen zu trennen. Gate-Eosinophile:

    • Multimarker-Panel 1 (Regulatorische Proteine ​​in Eosinophilen): Messung von CD16 und Galectinen-1/10 [41-44].
    • Multimarker-Panel 2 (Aktivierungsrezeptoren in Eosinophilen): Messung von CD48 (reduziert in Gesamt-Eosinophilen bei mittelschwerem bis schwerem Asthma im Vergleich zu gesunden Kontrollen (HC) [unsere Studien, 54]), CD44 und CD11b.
    • Multimarker-Panel 3 (Untergruppen von Eosinophilen): Analyse von Untergruppen basierend auf der Expression von Siglec-8, CD62L (L-Selektin) und IL-5Rα [40].

• Analyse des eosinophilen Proteoms (entdeckungsbasierter/hypothesengenerierender Ansatz):

  • Bis zu 50 x 10³ Zellen sind erforderlich, um proteomische Assays durchzuführen. Wir erwarten etwa 50-400 x 103 Zellen aus ca. 1 ml Blut.
  • Isolierte Eosinophile (50 x 103 Zellen) werden durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in Lysepuffer mit Proteinase-Inhibitoren resuspendiert. Danach wird unlösliches Material durch Zentrifugation entfernt und die Zellüberstände bei -80°C gelagert.
  • Für Eosinophile wird eine Gesamtproteomcharakterisierung nach Trypsinverdau unter Verwendung eines DDA-Verfahrens in einem LC-MSMS-System durchgeführt. Für diesen Ansatz verwenden wir Proben von 15 gesunden Spendern und 15 Patienten (T0, T4, T16, T32). Die ausgewählten Proteine ​​werden nur diejenigen sein, die eine globale Falschentdeckungsrate (FDR) von 1 % oder besser gemeldet haben [55, 56].
  • Protein-"Pools" aus den 5 Studiengruppen (gesunde Spender und Patienten zum Zeitpunkt T0, T4, T16 und T32 nach der Behandlung) werden verwendet, indem sie (1-DE) in 5-6 Banden aufgeteilt werden, wobei die Proteine ​​aus jeder extrahiert werden Band, Generieren der entsprechenden Peptide und deren Analyse mittels MS/MS, um eine Bibliothek für SWATH mit einer hohen Anzahl an Proteinen zu erstellen, an der dann die Quantifizierung durchgeführt wird. Sobald die Bibliothek erstellt wurde und die standardisierten Bedingungen der LC-MS/MS (TripleTOF) eingehalten werden, führen wir eine SWATH-MS-Analyse ("Information-Dependent Acquisition"-Methode oder IDA; "Targeted Label-Free Proteomics") in Proben durch 15 gesunde Spender und 15 Patienten (T0, T4, T16, T32). Dieser Assay wird es uns ermöglichen, Proteine ​​mit signifikanten Unterschieden zwischen den Studiengruppen zu identifizieren. Die ausgewählten Proteine ​​sind nur solche mit einem P < 0,05 und einer fachen Änderung ≥ 1,5 [56-59].

Studienendpunkte:

Demografische Daten für alle Personen, die an der Studie teilnehmen, werden bei basal erhoben. Darüber hinaus werden mehrere Daten erhoben, darunter Asthma-Anamnese, Lungenfunktionsparameter, Haut-Prick-Test, Allergen-spezifisches IgE, AQLQ-Score, ACT-Score, Anzahl der Exazerbationen und Prednison-Verbrauch. Bei den folgenden Besuchen im pneumologischen Dienst um T0, 4, 16 und 32 werden die mit Mepolizumab behandelten Patienten nachbeobachtet. Dazu gehören Messungen der Lungenfunktion (FEV1, FEV1/FVC), biochemischer und hämatologischer Parameter.

Zu T0, T4, T16 und T32 werden periphere Blut- und Serumproben entnommen und Eosinophile werden magnetisch gereinigt, und es werden Durchflusszytometrie, RTqPCR und proteomische Analysen sowie Immunoassays durchgeführt. Alle experimentellen Variablen (z. B. die Häufigkeit von eosinophilen Proteinen in proteomischen Assays, eosinophile Aktivierungsmarker, …) werden mit klinischen Parametern (z. B. Lungenfunktion, Asthmakontrolle, Anzahl der Exazerbationen) korreliert, um die Assoziation dieser Variablen zu bewerten mit dem Ansprechen auf die Behandlung. Wir werden ein positives Ansprechen auf Mepolizumab in Betracht ziehen, wenn eines der folgenden Kriterien erfüllt ist:

• Um eine adäquate Asthmakontrolle zu erreichen, ACT ≥ 20 [60] oder/oder eine Änderung von ≥ 3 Punkten, die einen minimal wichtigen Unterschied darstellt.
• Reduzierung der jährlichen Exazerbationsrate um 48 %. Exazerbation ist definiert als die Zunahme von Symptomen, die eine Behandlung mit systemischen Kortikosteroiden für ≥ 3 oder eine außerplanmäßige ärztliche Konsultation erfordern, ähnlich wie sie sich in klinischen Studien mit Mepolizumab widerspiegeln [20, 61].
• Erzielen Sie eine 50%ige Reduzierung der jährlichen Krankenhauseinweisungen aufgrund von Asthma-Exazerbation, ähnlich wie in klinischen Studien [62].
• Um eine Reduktion der mittleren Jahresdosis systemischer Kortikosteroide um 50 % zu erreichen [63].

• Primäre Endpunkte der Studie:

  • IGF-1-, IGF-BP3- und IGF-ALS-Spiegel im Serum
  • Transkriptomische (nanoString)/mRNA-Expressionsdaten: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomische Daten
  • Durchflusszytometriedaten: Expression von CD16, Galectin-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L und IL-5Rα

• Sekundäre Endpunkte der Studie:

  • Lungenfunktionsparameter (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hämatologische Parameter (z. B. Eosinophilenzahl).
  • Andere klinische und biochemische Variablen (z. B. IgE oder andere Immunglobuline).
  • Anzahl der Exazerbationen, Prednisonverbrauch, ACT-Score, AQLQ-Score.

Statistischer Plan oder Datenanalyse:

Graph Pad Prism wird verwendet, um Grafiken zu erstellen. Für die statistische Untersuchung wird IBM SPSS, Statistics 22.0 oder R. verwendet. Bei den Analysen werden wir vom Bereich USC Statistics and Operational Research (Dr. Rosa Maria Crujeiras Casais).

Stichprobengröße Die Berechnung der Stichprobengröße (N) wurde mit G*Power 3.1.9.4 [64] durchgeführt. Während dieser Analysen berechnen wir N, die erforderlich sind, um statistische Signifikanz in einem F-Test (ANOVA: Wiederholte Messungen, innerhalb von Faktoren) zu erhalten, gegebenes α (0,05), Leistung (1-β, 0,95), die Anzahl der Messungen (T0, T4, T16 und T32) und die Effektgröße (f = 0,4; große Effektgröße, die klinisch relevantere Ergebnisse liefert). Die Ausgabe N war 15, mit einem kritischen F = 2,82705.

Für klinische, durchflusszytometrische und transkriptomische Daten. Querschnittsvergleiche zwischen HC und Patienten in T0 (vor der Behandlung) nach einer Normalverteilung und Varianzhomogenität werden unter Verwendung des t-Tests durchgeführt. Für nicht normalverteilte Variablen verwenden wir den Mann-Whitney-U-Test. Änderungen der verschiedenen Studienvariablen als Reaktion auf die Behandlung mit Mepolizumab (Längsschnittstudie; T0, T4, T16 und T32) werden mit RM-ANOVA getestet. Multivariate Analysen (z. B. PCA, unüberwachtes Clustering) sowie funktionelle Anreicherungsanalysen werden mit Durchflusszytometrie und vor allem Transkriptomdaten durchgeführt.

Für die Gesamtcharakterisierung des Proteoms und die quantitative SWATH-Analyse werden wir die Software ProteinPilotTM 5.0.1 von ABSciex verwenden, die den Algorithmus ParagonTM für die Datenbanksuche und ProgroupTM für die Datengruppierung enthält. Die Daten werden mithilfe einer humanspezifischen Uniprot-Datenbank gesucht. Die Falschentdeckungsrate wird unter Verwendung einer nichtlinearen Anpassungsmethode durchgeführt, die nur die Ergebnisse anzeigt, die eine globale Falschentdeckungsrate von 1 % oder besser gemeldet haben [65].

Die Funktionsanalyse wird mit unterschiedlicher Open-Access-Software durchgeführt. FunRich (Functional Enrichment Analysis Tool) für funktionale Anreicherung und Interaktionsnetzwerkanalyse (http://funrich.org/index.html). Für die Statistik verwendet FunRich den hypergeometrischen Test, BH und Bonferroni [66, 67]. Wir werden DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) oder GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) für die Genontologie-Anreicherung und für die Protein-Protein-Interaktion, Netzwerk verwenden Konstruktion und Clustering verwenden wir String (https://string-db.org/) oder Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/) [68].

Für SWATH-Daten liefert uns die MarkerView-Software eine multivariate statistische Analyse unter Verwendung der Hauptkomponentenanalyse (PCA), um die Daten über die Proben hinweg zu vergleichen. Die durchschnittliche MS-Peakfläche jedes Proteins wird aus den Wiederholungen des SWATH-MS jeder Probe abgeleitet, gefolgt von einer Student-t-Test-Analyse unter Verwendung der MarkerView-Software zum Vergleich zwischen den Proben, basierend auf den gemittelten Flächensummen aller abgeleiteten Übergänge jedes Protein. Der t-Test gibt an, wie gut jede Variable die beiden Gruppen unterscheidet, angegeben als P-Wert. Für die Bibliothek wird ihr Satz unterschiedlich häufiger Proteine ​​(p-Wert <0,05) mit um 1,5 hochregulierten oder herunterregulierten Proteinen ausgewählt.

Einschränkungen

• Wie bereits erwähnt, sollen 15 Probanden während der ersten Hälfte der Studie (36 Wochen) Mepolizumab erhalten. Wir erwarten, dass mindestens 90 % der Teilnehmer diese Studie abschließen. Allerdings sind Patientenabbrüche und Non-Adhärenz (oder Non-Compliance) häufige Ereignisse in klinischen Studien. In einem solchen Fall wird die Stichprobengröße proportional erhöht.
• Das vorliegende Projekt wurde als Studie zur Entdeckung molekularer Biomarker als Reaktion auf Mepolizumab vorgeschlagen. Diese Art von Studien kann durch gezielte/hypothesengetriebene oder breitere/ungezielte ("-omics"-Technologien) Ansätze durchgeführt werden. Wir sind uns bewusst, dass es schwierig sein könnte, in dieser kleinen und prospektiven/Proof-of-Concept-Studie prädiktive Marker zu finden. Im vorliegenden Projekt schlagen wir einen doppelten Ansatz vor, um dieses Risiko zu minimieren. Auf der einen Seite funktionieren moderne und nicht zielgerichtete Methoden und hochempfindliche Methoden zum Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit (SWATH MS) oder vereinfachte Protokolle, um mit schwierigen Proben zu arbeiten (die Erzeugung von qualitativ hochwertiger RNA aus Eosinophilen ist aufgrund des Vorhandenseins von reichlich vorhandenen Proteinen immer eine Herausforderung). wie EDN, ein Mitglied der RNase-Familie) und die technische Varianz reduzieren (z. B. nCounter nanoString), um die Stichprobenumfänge zu verkürzen. Auf der anderen Seite hypothesengesteuerte Ansätze (z. B. Durchflusszytometrie, RT-qPCR, ELISA) mit den Vorteilen einer größeren Glaubwürdigkeit, eines geringeren Risikos von Typ-I- (d. h. falscher Entdeckung) und II-Fehlern und einer einfachen zukünftigen Replikation von Ergebnissen. Diese zielgerichteten Methoden werden auch verwendet, um nur klinisch relevante (hohe Effektstärke) und signifikante (p-Wert < 0,05) Unterschiede zu bestätigen, die mit nicht zielgerichteten transkriptomischen/proteomischen Ansätzen erzielt wurden.
• Eine weitere potenzielle Einschränkung ist die Anzahl der Eosinophilen, die bei manchen Patienten nach der Behandlung mit Mepolizumab potenziell niedrig sein könnte (50 x 103 oder weniger). Daher könnte es notwendig sein, bei diesen Patienten mehr als 1 oder 2 ml Blut zu reinigen, um genügend Zellen zu erhalten, um die Proteomik- und Transkriptomik-Experimente durchzuführen. Wir haben diese Frage im Studienprotokoll und im Budget des Projekts berücksichtigt.
• Schließlich ist das TripleTOF ein hochempfindliches Massenspektrometer, das entwickelt wurde, um tiefer in komplexe Proben wie das eosinophile Proteom einzudringen. Die hohe Empfindlichkeit aktueller Massenspektrometer in Kombination mit zweidimensionalen NanoLC-Schemata ermöglicht den Nachweis einer höheren Anzahl von Proteinen (> 1000) und Analyten bei Konzentrationen im attomolaren Bereich (10–18), die ausreichen, um wenig häufig vorkommende intrazelluläre Proteine ​​wie Chemokine oder Zytokine nachzuweisen. So wurden TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 und IL-18 durch nanoLC-MS/MS (Q-TOF) nachgewiesen, aber keine anderen wie IL-5 oder IL-13 [69 ]. Diese erwartete Einschränkung ist auf das Vorhandensein von Peptiden von sehr häufig vorkommenden Proteinen (z. B. eosinophile Körnerproteine) zurückzuführen, die die Ionisation von Peptiden von wenig häufig vorkommenden Proteinen in LC-MS/MS-Anwendungen unterdrücken. Dies führt zu einer Überrepräsentation in der Liste der nachgewiesenen Proteine ​​von häufig vorkommenden Arten wie dem Charcot-Leyden-Kristallprotein (CLC, Galectin-10), das für das vorliegende Projekt immer noch interessant ist, da es Eosinophile mit regulatorischen Fähigkeiten identifiziert. Um jedoch die Probenkomplexität zu reduzieren und den Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit zu verbessern, gibt es verschiedene Verarmungs- (z. B. ACN-Verarmung, Ultrafiltration, 1-DE) und Anreicherungsmethoden (z. B. CPLLs), die wir verwenden könnten, um den Nachweis zu gewinnen Empfindlichkeit. Optional zielgerichtete Ansätze wie High-Multiplex-Immunoassays (z. B. Olink Immune Response, Olink Inflammation oder Olink Immuno-Oncology Panels; https://www.olink.com/) haben den Vorteil einer hohen Nachweisempfindlichkeit bei geringem Volumen biologischer Proben (z. B. Zelllysate), obwohl sie nur die gleichzeitige Messung von 92 Protein-Biomarkern ermöglichen.