Effekt av Mepolizumab på alvorlig eosinofil astma (EMESEA)

Hypoteser

Hº1. Nivåene av visse overflatemolekyler på eosinofiler eller tilstedeværelsen eller fraværet av visse proteiner i proteomet til denne leukocyttundergruppen før mepolizumabbehandling kan brukes som prediktive/prognostiske markører for respons på dette biologiske.

Hº2. Mepolizumab endrer forekomsten av flere overflate- eller intracellulære proteiner i eosinofiler som et resultat relatert til endringer i deres aktiveringsstatus, migrasjonsevne, regulatorisk/effektorfunksjon eller undergruppesammensetning.

Hº3. Sent debuterende alvorlige eosinofile astmatikere har forhøyede serumkonsentrasjoner av forskjellige medlemmer av IGF-familien (IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS) og mepolizumab-behandling reduserer disse nivåene og oppfører seg som en respons-biomarkør sammen med antall eosinofiler og kliniske eksaserbasjoner.

Mål eller forskningsspørsmål

OB (Aspirasjonsmål): Oppdagelse av prediktive/prognostiske biomarkører for respons på mepolizumab ved bruk av flowcytometri, transkriptomiske og proteomiske teknologier.

• OB1.- Å identifisere endringer i overflatemarkører for eosinofiler og eosinofile subpopulasjoner som respons på behandling med mepolizumab ved bruk av flowcytometriteknikker. Dette målet er fordelt på følgende leveranser (DE):

  • DE1.1: Utvalg av 15 friske kontroller
  • DE1.2: Diagnose av sent debuterende alvorlig eosinofil astmapasienter og utvalg av 15 pasienter som oppfyller kriteriene, er planlagt å motta mepolizumab og signere det informerte samtykket.
  • DE1.3: Generering av den første databasen for friske kontroller og astmapasienter med demografisk, klinisk, hematologisk og biokjemisk informasjon.
  • DE1.4: Innsamling og prosessering av serum (1 SST-rør) og fullblodprøver (1-2 rør) fra friske givere (T0) og mepolizumab-behandlede pasienter (T0, T4, T16, T32).
  • DE1.5: Flowcytometrianalyser med multimarkørpaneler 1 (regulatorisk), 2 (aktivering) og 3 (eosinofil undersett) (se nedenfor).
  • DE1.6: Kompletter databasen med kliniske, hematologiske, biokjemiske og flowcytometridata generert på tidspunktene T4, T16 og T32. Endelig uni- og multivariant statistisk analyse.
  • DE1.7: Publisering av resultater.

• OB2.- Transkriptomisk analyse for å identifisere mRNA i det eosinofile transkriptomet som viser økte eller reduserte nivåer som respons på behandling med mepolizumab. Dette målet er fordelt på følgende leveranser (DE):

  • DE2.1: Sett opp en eosinofil isolasjonsprotokoll og kontroller cellenes renhet ved flowcytometri.
  • DE2.2: Rensing av eosinofiler fra 15 friske givere (T0) og 15 pasienter (T0, T4, T16, T32).
  • DE2.3: Total RNA-ekstraksjon fra eosinofile lysater, analyse av kvalitet og mengde RNA, og lagring ved -80ºC.
  • DE2.4: Oppdagelsesbasert/hypotesegenererende tilnærming. Evaluering av nivåene av 770 humane proteinkodende mRNA-er knyttet til rekrutterings-, aktiverings- og effektorfunksjonene til myeloide celler ved hjelp av en direkte multiplekset molekylær måleplattform kalt nCounter® NanoString) i kombinasjon med en forhåndslaget "nCounter® Human Myeloid Innate Immunity Panel (v2)" (www.nanostring.com/products/gene-expression-panels/gene-expression-panels-overview/ncounter-myeloid-innate-immunity-panel ). På grunn av den høye økonomiske kostnaden vil denne delen av studien kun utføres med eosinofilprøver fra friske givere (T = 0) og to tidspunkt hos pasienter (T = 0 og T = 16).
  • DE2.5: Behandling av innhentede data og innledende statistisk analyse.
  • DE2.6: Validering av nCounter®-data og hypotesedrevet tilnærming med en etablert kvantitativ teknikk. Utfør retrotranskripsjon og qPCR-analyser av de mRNAene i eosinofiler som viser de største mengdeendringene som respons på mepolizumab-behandling i henhold til nCounter®-studien. I tillegg vil noen ekstra mRNA-er som ikke er inkludert i "nanoString Myeloid Innate Immunity"-panelet, som FOXP3 (regulatorisk funksjon), CRLF2, ST2 eller IL-7R (cytokinreseptorer; aktivering), bli analysert. HPRT1-genet vil bli brukt som et husholdningsgen i dette settet med RTqPCR-eksperimenter.
  • DE2.7: Uni- og multivariant statistiske analyser.
  • DE2.8: Publisering av transkriptomiske resultater.

• OB3.- Proteomisk profilering for å identifisere proteiner med differensiell overflod i eosinofilene som respons på behandling med mepolizumab. Dette målet er fordelt på følgende leveranser (DE):

  • DE3.1: Lysis av eosinofiler, fjerning av uløselig materiale ved sentrifugering, proteinkvantifisering (BCA) og lagring av cellesupernatanter ved -80°C.
  • DE3.2: Utvikle en total proteomanalyseprotokoll med en Data Dependent Acquisition (DDA)-metode ved bruk av væskekromatografi (LC)-MS / MS-teknologi (Triple TOF 6600)
  • DE3.3: Sjekk den biologiske variabiliteten (biologiske replikasjoner) og teknikk (tekniske kopier) for å sjekke reproduserbarheten til testene.
  • DE3.4: Opprettholde de standardiserte betingelsene for LC-MS / MS (TripleTOF), opprett et bibliotek for SWATH (sekvensiell vindusinnhenting av alle teoretiske massespektre) med så mange eosinofile proteiner som mulig.
  • DE3.5: Utfør SWATH-MS-analyse i prøver fra 15 friske givere og 15 pasienter (T0, T4, T16, T32) ("informasjonsavhengig innhenting"-metode eller IDA; "Targeted label-free proteomics").
  • DE3.6: Behandling av innhentede data og innledende statistisk analyse.
  • DE3.7: Kontroll av panelet med biomarkører oppnådd med en annen teknologi (f.eks. Valgt reaksjonsovervåking / SRM, ELISA).
  • DE3.8: Endelig uni- og multivariant statistisk analyse. Identifiser proteiner med signifikante forskjeller mellom grupper (P < 0,05) og minst en fold endring ≥ 1,5.
  • DE3.9: Publisering av proteomiske resultater

• OB4. Sjekk om sent debuterende alvorlige eosinofile astmatikere viser forhøyede nivåer av IGF-1, IGF-BP3, IGF-ALS i serumprøver, hvis responsen til mepolizumab avhenger av nivåene av disse markørene, og hvis behandling med denne biologiske reduserer konsentrasjonen i serum fra disse IGF-familiemedlemmene. Dette målet er fordelt på følgende leveranser (DE):

  • DE4.1: Analyse av IGF-1, IGF-BP3 og IGF-ALS ved ELISA
  • DE4.2: Uni- og multivariant statistisk analyse av eksperimentelle data
  • DE4.3: Publisering av resultater

Publisering av resultater:

Vi vil forsøke å presentere en kommunikasjon i løpet av det første året av studien på en spansk luftveiskongress (SEPAR) så vel som i den europeiske luftveiskongressen (ERS) som er et resultat av studiet av kliniske data fra pasienter før og etter administrering av mepolizumab . I tillegg forventer vi å publisere 3 publikasjoner i Q1-tidsskrifter samt annen 2 eller 3 kongresskommunikasjon som er et resultat av eksperimentelle studier.

Studiepopulasjon Studiepopulasjonen vil omfatte friske kontroller (dvs. personer uten astma, allergi, systemiske sykdommer eller planlagt for mindre operasjoner) og sent-debuterende alvorlig eosinofil astmapasienter, som vil bli rekruttert fra forskjellige områder av Galicia (Santiago de Compostela, A. Coruña, Lugo, Vigo og Ourense), Spania. Diagnostisering av alvorlige eosinofile astmapasienter ved screening vil være basert på flere inklusjonskriterier og eksklusjonskriterier som vi beskriver nedenfor [12].

Inklusjonskriterier:

• Diagnose av alvorlig ukontrollert astma i henhold til ERS/ATS-kriterier [52].
• Vedvarende eosinofili i blod (>300 celler/μL) ved ≥ to anledninger (mer enn 4 uker mellom hver måling).
• Hyppige eksaserbasjoner (≥ to per år), definert som en periode på ≥ 3 dager med manglende astmakontroll som krever behandling med systemiske kortikosteroider og/eller akuttmottak (ED) besøk og/eller sykehusinnleggelse.
• Signatur på informert samtykke og samtykker i å overholde alle besøkene til studien og alle prosedyrene som dette innebærer.

Ekskluderingskriterier:

• Røykehistorie: Nåværende røykere eller tidligere røykere med en røykehistorie på ≥10 pakkeår (antall pakkeår = (antall sigaretter per dag/20) x antall år røykt). En tidligere røyker er definert som en deltaker som sluttet å røyke minst 6 måneder før besøk 1.
• Andre klinisk viktige lungesykdommer enn astma (f. aktiv lungeinfeksjon, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), bronkiektasi, lungefibrose, cystisk fibrose, hypoventilasjonssyndrom assosiert med fedme, lungekreft, alfa 1 anti-trypsin-mangel og primær ciliær dyskinesi) eller noen gang blitt diagnostisert med lunge- eller systemisk sykdom , annet enn astma, som er assosiert med forhøyet perifert eosinofiltall (f.eks. allergisk bronkopulmonal aspergillose/mykose, Churg-Strauss syndrom, hypereosinofilt syndrom).
• Enhver lidelse, inkludert, men ikke begrenset til, kardiovaskulær, gastrointestinal, lever, nyre, nevrologisk, muskuloskeletal, smittsom, endokrin, metabolsk, hematologisk, psykiatrisk eller større fysisk svekkelse som ikke er stabil etter etterforskerens oppfatning.
• Malignitet: En nåværende malignitet eller tidligere historie med kreft i remisjon.
• Akutte øvre eller nedre luftveisinfeksjoner som krever antibiotika eller antivirale medisiner innen 30 dager før besøket 1.
• Xolair: Deltakere som har fått omalizumab (Xolair) eller et annet monoklonalt antistoff tidligere.
• Deltakere som har fått systemiske kortikosteroider innen 30 dager før besøk 1 [53].
• Graviditet: Deltakere som er gravide eller ammer.
• Fedmeklasse 2 eller høyere (BMI≥ 35 kg/m2) (https://www.who.int/dietphysicalactivity/childhood_what/en/).

Prøvestørrelse

• Kohort av friske kontroller (n=15) kun for analyse ved T = 0.

• Kohort av n=15 forsøkspersoner med alvorlig eosinofil astma som starter med mepolizumab-behandling uten modifikasjon av foreskrevet medisinering. Oppfølgingsstudiebesøk ved 4 (T4), 16 (T16) og 32 (T32) uker etter det opprinnelige studiebesøket (T=0).

  • Begrunnelsen for utvalgsstørrelse er forklart i statistikkdelen.

Forventet påmeldingsrate Siden dette vil være en multisenterstudie, forventer vi å nå en påmeldingsrate på minst 2 alvorlige eosinofile astmatikere som begynner med mepolizumabbehandling per måned (4 uker) på hvert sykehus (Totalt = 8 per måned). Dette betyr at de 15 forsøkspersonene bør planlegges å motta mepolizumab i løpet av de første 36 ukene av denne studien, og ha nok tid til å fullføre studien på 72 uker (1,5 år). Vi forventer også at minst 90 % av deltakerne fullfører denne studien.

Estimert studiestartdato: desember 2020 Estimert studiegjennomføringsdato: 1,5 år (72 uker)

Studiedesign og metoder

Figur 2. Studiedesign. Denne figuren representerer på en skjematisk måte både den kliniske og den eksperimentelle delen av studien.

Dette er en observasjons-, longitudinell, prospektiv og multisenterstudie for å evaluere både tidlig respons (4 uker) og sen respons (16 og 32 uker) på mepolizumab-behandling hos alvorlige eosinofile astmatikere. Studien vil bli ledet av Dr. Francisco Javier González Barcala (Pneumology Service ved CHUS). Dr. Barcala var nasjonal koordinator i én klinisk studie samt hovedetterforsker og underetterforsker i henholdsvis 41 og 19 kliniske studier. I tillegg har Dr. Barcala vært hovedetterforsker av 7 forskningsprosjekter, samarbeidspartner i andre 7 prosjekter, og publisert mer enn 120 relevante publikasjoner (peer-reviewed og JCR-indeksert) innen luftveissykdommer, hovedsakelig astma.

Studien involverer også andre medlemmer av den flerfaglige astmaenheten (Dr. Francisco Javier Salgado Castro, Dr. Juan José Nieto Fontarigo). Spesielt har prosjektlederen Dr. Salgado vært involvert i 11 forskningsprosjekter, har 28 forskningsartikler i tidsskrifter med høy effekt som tilhører fagområdene immunologi, biokjemi, proteomikk og luftveissykdommer. I tillegg har de andre deltakerne i dette prosjektet bred erfaring innen sine respektive felt, både grunnforskning og translasjonsforskning. De er Dra. Marina Blanco Aparicio, ansvarlig for astmaenheten ved University Hospital Complex of A Coruña (CHUAC), Dr. Uxío Calvo, ved University Hospital Complex of Ferrol (CHUF), og Coral González ved University Hospital Complex of Ourense (CHUO) , Mar Mosteiro ved sykehuset Alvaro Cunqueiro i Vigo; Dolores Corbacho ved sykehuset Povisa-Vigo. Det vil være nødvendig å ansette en forsker i predoktoralfasen i 12 måneder for å utføre prøvepreparering i transkriptomiske og proteomiske studier samt RTqPCR, flowcytometri og ELISA-analyser. Denne forskeren vil være under veiledning av Dr. Francisco Javier Salgado Castro og Dr. Juan José Nieto-Fontarigo (Multidisciplinary Asthma Unit, CHUS). Proteomikk-eksperimenter vil bli utført av Dra. Susana Belén Bravo López og María García Vence, som jobber ved Proteomic Platform ved Sanitary Research Foundation i Santiago de Compostela (FIDIS). nCounter®-analysen vil bli utført gjennom en tjeneste som tilbys av GENVIP-gruppen (Group of Genetics, Vaccines and Infections in Pediatrics; https://nanostringenvip.com/), FIDIS.

Forskningsprosjektet vil være minimalt invasivt (f.eks. ingen bronkoskopiske undersøkelser), men protokollen må gjennomgås og godkjennes av Ethics Committee of Clinical Research i Galicia, Spania. Bare femten pasienter som oppfyller kriteriene for sen-debut av alvorlig astmadiagnose, er planlagt til å motta mepolizumab og signere det informerte samtykket, vil bli registrert i denne studien. Den samme protokollen vil bli fulgt av de forskjellige kliniske teamene. Demografiske, så vel som kliniske, hematologiske og biokjemiske variabler vil bli inkludert i en database. Hudstikktest for vanlige allergener og tilstedeværelsen av allergenspesifikk IgE (ImmunoCAP, Thermo Fisher) vil bli brukt for å sjekke for allergisk sensibilisering. Lungefunksjonsparametere (tvungen ekspirasjonsvolum i 1. sekund (FEV1), tvungen vitalkapasitet (FVC) og FEV1/FVC-forhold) vil også bli analysert. Spirometri vil bli utført før og etter bruk av bronkodilatator. Astmakontrolltesten (ACT) og Asthma Quality of Life Questionnaire (AQLQ) spørreskjemaet vil bli utført. Astmatikere må være i en stabil fase av sykdommen (dvs. fravær av eksacerbasjoner i minst 4 uker før prøvetaking). Eksacerbasjoner vil bli behandlet i henhold til standard kliniske retningslinjer. Pasienter (n=15) vil få 100 mg subkutan injeksjon av mepolizumab med 4 ukers mellomrom, og blod- og serumprøver (2-3 EDTA-rør; 1 SST-rør) vil bli tatt ut ved T=0, 4, 16 og 32 uker, for å evaluere både tidlig respons (4 uker) og sen respons (16 og 32 uker) på behandlingen.

Metoder

• Rør: EDTA (fullstendig blod) og SST (serum)

• Rensing av eosinofiler

  • Eosinofiler kan isoleres fra fullblod (heparinrør) ved å bruke Miltenyi Human Eosinophil Isolation Kit (katalog #130-104-466) eller EasySep™ Human Eosinophil Isolation Kit (katalog #17956), begge negative seleksjonsprosedyrer som gir urørte undergrupper disse leukocyttene. Vi forventer rundt minst 1,0-4,0 x 106 celler fra ~20 ml blod, men også høy levedyktighet og renhet (>95%).

• ELISA-studier.

  • Serumprøvesamling: Måling av IGF-ALS (GENOIT4078 Immunotag Human IGFALS 96 brønn), IGF-1 (Human IGF-I/IGF-1 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY291) og IGF-BP3 (Human IGFBP-3 DuoSet ELISA, R&D Systems, katalog #DY675) ved hjelp av ELISA.

• Total RNA-rensing fra eosinofiler og nCounter nanoString-analyse (oppdagelsesbasert/hypotesegenererende tilnærming):

  • Rensede eosinofiler fra friske kontroller (T=0) og pasienter (T=0, 4, 16 og 32 uker) vil bli lagret ved -80ºC i RNAlater-løsning (Ambion, Paisley, Storbritannia). Totalt RNA vil bli isolert ved hjelp av et RNeasy Mini-sett (Qiagen) og lagret ved -80ºC etter kontroll av RNA-kvalitet og -konsentrasjon (Nanodrop).
  • nCounter®-plattformen (nanoString; https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/ncounter-technology) er en multipleksmetodikk som tillater kvantifisering av opptil 800 RNA-, DNA- eller proteinmål. Når det gjelder mRNA-molekyler, er denne teknologien basert på hybridisering i oppløsning av hvert mRNA til to komplementære oligonukleotider: en biotinylert mRNA-spesifikk probe og et mRNA-spesifikk oligonukleotid som inneholder en sekvensiell kombinasjon av seks fluorokromer (fire forskjellige farger) som skaper en fluorescerende strekkode som identifiserer det spesifikke mRNA som blir oppdaget. Når overskuddet av begge probene er fjernet, fanges de hybridiserte kompleksene opp gjennom en biotin-streptavidin-interaksjon og justeres på kassetten for at nCounter-instrumentet kan lese disse "strekkodene". For å utføre disse trinnene, består nCounter-plattformen av to instrumenter Prep Station, som utfører rensing av hybridiserte komplekser og immobilisering av dem på overflaten av en kassett, og Digital Analyzer (DA), en skanner som identifiserer og teller strekkoder fanget opp for hver prøve. Denne kvantitative analysen Derfor kan hvert miRNA kvantifiseres individuelt (absolutt kvantifisering; tellinger) fra vanskelige prøver (f.eks. eosinofiler) uten behov for andre krav som mRNA-cDNA-konvertering (RT) eller DNA-amplifikasjon (qPCR), som fører til mindre datavariabilitet (https://www.nanostring.com/scientific-content/technology-overview/challenges-of-rt). I tillegg er mengden inputmateriale lav (25 ng-300 ng mRNA) og kan avledes fra FFPE-avledet RNA, totalt RNA, fragmentert RNA, cellelysater og sorterte celler. Etterpå vil nCounter-data normaliseres, bakgrunnsstøy trekkes fra og ytterligere korreksjon utføres for å ta hensyn til effektiviteten til ekstraksjonen (beregnet basert på uttrykket av spike-in miRNA-er som vil bli lagt til prøven i en definert mengde før miRNA-ekstraksjonen ). Normaliseringer vil bli gjort ved å bruke R NanoStringNorm-pakken. Etter normalisering vil en log2-transformasjon av dataene bli gjort og deretter analysert ved hjelp av LIMMA Bioconductor-pakken for å identifisere de mRNAene som viser en differensiell overflod ved mepolizumab-behandling. Denne analysen vil ikke ta mer enn 24 timer.

• RTqPCR-studier (hypotesedrevet tilnærming):

  • For å analysere nivåene av mRNA som koder for proteiner relatert til alarmin-mediert aktivering av eosinofiler (CRLF2, ST2, IL-7Ra/CD127) og med den regulatoriske funksjonen til eosinofiler (FOXP3) fra pasienter behandlet med mepolizumab, vil total RNA bli transkribert til cDNA (QuantiTect Rev. Transcription Kit; Qiagen) og lagret ved -80ºC. qPCR (QuantiTect SYBR Green PCR Kit; Qiagen) vil bli utført i et LightCycler® 96 Instrument (Roche Life Science) og brukes til å analysere uttrykket av FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R og HPRT1-genet (endogen kontroll).

• Flowcytometristudier (hypotesedrevet tilnærming):

  • EDTA-behandlede perifere blodprøver fra friske kontroller (n=15; T0) og mepolizumab-behandlede pasienter (n=15; T0, T4, T16, T32).

  • Merk 100 μL/rør med hel perifert blod (EDTA) med både spesifikke og isotype-matchede kontrollantistoffer (BD). Lyse av røde blodlegemer med FACSlyse (BD). Analyse med et FACSCalibur flowcytometer (BD). Bruk FSC/SSC for å velge granulocytter; deretter SSC vs CCR3 (FITC) for å skille eosinofiler fra nøytrofiler. Gate eosinofiler:

    • Multimarkørpanel 1 (Regulatoriske proteiner i eosinofiler): Måling av CD16 og galectiner-1/10 [41-44].
    • Multimarkørpanel 2 (Aktiveringsreseptorer i eosinofiler): Måling av CD48 (redusert i totalt antall eosinofiler med moderat-alvorlig astma sammenlignet med friske kontroller (HC) [våre studier, 54]), CD44 og CD11b.
    • Multimarkørpanel 3 (Eosinofile undergrupper): Analyse av undergrupper basert på ekspresjonen av Siglec-8, CD62L(L-selektin) og IL-5Ra [40].

• Analyse av eosinofilt proteom (oppdagelsesbasert/hypotesegenererende tilnærming):

  • Så mye som 50 x 103 celler vil være nødvendig for å utføre proteomiske analyser. Vi forventer rundt 50-400 x 103 celler fra ~1 mL blod.
  • Isolerte eosinofiler (50 x 103 celler) vil bli samlet ved sentrifugering, vasket og resuspendert i lyseringsbuffer med proteinasehemmere. Deretter vil uløselig materiale fjernes ved sentrifugering og cellesupernatanter lagres ved -80°C.
  • For eosinofiler vil total proteomkarakterisering gjøres etter trypsinfordøyelse ved bruk av en DDA-metode i et LC-MSMS-system. For denne tilnærmingen vil vi bruke prøver fra 15 friske givere og 15 pasienter (T0, T4, T16, T32). Proteinene som er valgt vil kun være de som rapporterte en global falsk oppdagelsesrate på 1 % (FDR) eller bedre [55, 56].
  • Protein "pooler" fra de 5 studiegruppene (friske givere og pasienter ved tidspunkt T0, T4, T16 og T32 etter behandling) vil bli brukt, og dele dem (1-DE) i 5-6 bånd, og trekke ut proteinene fra hver bånd, genererer de tilsvarende peptidene og analyserer dem av MS / MS for å produsere et bibliotek for SWATH med et høyt antall proteiner, som deretter kvantifiseringen vil bli utført på. Når biblioteket er laget og opprettholder de standardiserte forholdene til LC-MS / MS (TripleTOF), vil vi utføre en SWATH-MS-analyse ("informasjonsavhengig innhenting"-metode eller IDA; "Targeted label-free proteomics") i prøver fra 15 friske givere og 15 pasienter (T0, T4, T16, T32). Denne analysen vil la oss identifisere proteiner med betydelige forskjeller mellom studiegruppene. Proteinene som velges vil kun være de med P<0,05 og en fold endring ≥1,5 [56-59].

Studiens endepunkter:

Demografiske data for alle individer som er registrert i studien vil bli innhentet ved basal. I tillegg vil flere data bli samlet inn, inkludert astmahistorie, lungefunksjonsparametere, hudpriktest, allergenspesifikk IgE, AQLQ-score, ACT-score, antall eksaserbasjoner og forbruk av prednison. Ved følgende besøk til Pneumologitjenesten på T0, 4, 16 og 32 vil pasienter behandlet med mepolizumab bli fulgt opp. Dette inkluderer målinger av lungefunksjon (FEV1, FEV1/FVC), biokjemiske og hematologiske parametere.

Perifere blod- og serumprøver vil bli samlet inn, og eosinofiler vil bli magnetisk renset, ved T0, T4, T16 og T32, og flowcytometri, RTqPCR og proteomiske analyser, samt immunanalyser, vil bli utført. Alle de eksperimentelle variablene (f.eks. mengden av eosinofile proteiner i proteomiske analyser, eosinofile aktiveringsmarkører, ...) vil bli korrelert med kliniske parametere (f.eks. lungefunksjon, astmakontroll, antall eksaserbasjoner) for å vurdere assosiasjonen til disse variablene med respons på behandlingen. Vi vil vurdere en gunstig respons på mepolizumab hvis ett av følgende kriterier er oppfylt:

• For å oppnå tilstrekkelig astmakontroll ACT ≥20 [60], eller/en endring på ≥3 poeng som representerer en minimalt viktig forskjell.
• For å oppnå en reduksjon i den årlige frekvensen av eksacerbasjoner på 48%. Forverring er definert som økningen i symptomer som krever behandling med systemiske kortikosteroider i ≥3, eller en ikke-planlagt medisinsk konsultasjon, tilsvarende det som gjenspeiles i kliniske studier med mepolizumab [20, 61].
• Få en 50 % reduksjon i den årlige frekvensen av sykehusinnleggelser på grunn av astmaforverring, tilsvarende det som gjenspeiles i kliniske studier [62].
• Å oppnå en reduksjon i median årlig dose av systemiske kortikosteroider på 50 % [63].

• Studer primære endepunkter:

  • IGF-1, IGF-BP3 og IGF-ALS nivåer i serum
  • Transkriptomiske (nanostreng)/mRNA-ekspresjonsdata: FOXP3, CRLF2, ST2, IL-7R
  • Proteomiske data
  • Flowcytometridata: Uttrykk av CD16, galectiner-1/10, CD48, CD44, CD11b, Siglec-8, CD62L og IL-5Ra

• Studer sekundære endepunkter:

  • Lungefunksjonsparametere (FEV1, FEV1/FVC)
  • Hematologiske parametere (f.eks. antall eosinofiler).
  • Andre kliniske og biokjemiske variabler (f.eks. IgE eller andre immunglobuliner).
  • Antall eksacerbasjoner, prednisonforbruk, ACT-score, AQLQ-score.

Statistisk plan eller dataanalyse:

Graph Pad Prism vil bli brukt til å lage grafikk. IBM SPSS, Statistics 22.0 eller R. vil bli brukt for den statistiske studien. Under analysene vil vi bli assistert av USC Statistics and Operational Research-området (Dr. Rosa María Crujeiras Casais).

Prøvestørrelse Beregningen av prøvestørrelse (N) er utført ved å bruke G*Power 3.1.9.4 [64]. Under disse analysene beregner vi N nødvendig for å få statistisk signifikans i en F-test (ANOVA: Gjentatte mål, innenfor faktorer), gitt α (0,05), effekt (1-β, 0,95), antall målinger (T0, T4, T16 og T32), og effektstørrelsen (f = 0,4; stor effektstørrelse, som gir mer klinisk relevante resultater). Utgangen N var 15, med en kritisk F= 2,82705.

For kliniske, flowcytometri og transkriptomiske data. Tverrsnittssammenligninger mellom HC og pasienter i T0 (før behandling) etter normalfordeling og med homogenitet av varianser vil bli gjort ved å bruke t-test. For ikke-normalfordelte variabler vil vi bruke Mann-Whitney U-test. Endringer i de forskjellige studievariablene som respons på behandling med mepolizumab (longitudinell studie; T0, T4, T16 og T32) vil bli testet med RM-ANOVA. Multivariat analyse (f.eks. PCA, unsupervised clustering) samt funksjonell anrikningsanalyse vil bli utført med flowcytometri, og fremfor alt, transkriptomiske data.

For total proteomkarakterisering og kvantitativ SWATH-analyse Vi vil bruke ProteinPilotTM 5.0.1 programvare fra ABSciex som har algoritmen ParagonTM for databasesøk og ProgroupTM for datagruppering. Data vil bli søkt ved hjelp av en Human-spesifikk Uniprot-database. Falsk oppdagelsesrate vil bli utført ved bruk av en ikke-lineær tilpasningsmetode som viser bare de resultatene som rapporterte en global falsk oppdagelsesrate på 1 % eller bedre [65].

Funksjonsanalyse vil bli utført av forskjellig programvare med åpen tilgang. FunRich (Functional Enrichment analyseverktøy) for funksjonell berikelse og interaksjonsnettverksanalyse (http://funrich.org/index.html). For statistikk bruker FunRich hypergeometrisk test, BH og Bonferroni [66, 67]. Vi vil bruke DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) eller GO (http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis) for genontologiberikelse og for protein-protein-interaksjon, nettverk konstruksjon og klynging, vil vi bruke String (https://string-db.org/) eller Cytoscape 3.7 (https://cytoscape.org/ ) [68].

For SWATH-data vil MarkerView-programvare gi oss en multivariat statistisk analyse ved å bruke hovedkomponentanalyse (PCA) for å sammenligne dataene på tvers av prøvene. Det gjennomsnittlige MS-topparealet til hvert protein vil bli utledet fra replikatene av SWATH-MS for hver prøve etterfulgt av Students t-testanalyse ved bruk av MarkerView-programvaren for sammenligning mellom prøvene basert på gjennomsnittlig arealesummer av alle overgangene utledet for hvert protein. T-testen vil indikere hvor godt hver variabel skiller de to gruppene, rapportert som en P-verdi. For biblioteket vil dets sett med forskjellig rikelige proteiner (p-verdi <0,05) med 1,5 oppregulerte eller nedregulerte proteiner bli valgt.

Begrensninger

• Som tidligere kommentert, vil 15 forsøkspersoner etter planen få mepolizumab i løpet av første halvdel av studien (36 uker). Vi forventer at minst 90 % av deltakerne fullfører denne studien. Imidlertid er pasientfrafall og manglende overholdelse (eller manglende etterlevelse) vanlige hendelser i kliniske studier. I et slikt tilfelle vil prøvestørrelsen bli proporsjonalt oppblåst.
• Dette prosjektet er foreslått som en studie av oppdagelsen av molekylære biomarkører som respons på mepolizumab. Denne typen studier kan gå ombord gjennom målrettede/hypotesedrevne eller bredere/ikke-målrettede ("-omics"-teknologier) tilnærminger. Vi er klar over at det kan være utfordrende å finne prediktive markører i denne lille og prospektive/proof of concept-studien. I dette prosjektet foreslår vi en dobbel tilnærming for å minimere denne risikoen. På den ene siden, moderne og umålrettede metoder for å fungere og svært følsomme for å oppdage proteiner med lavt innhold (SWATH MS) eller forenklede protokoller for å jobbe med vanskelige prøver (generering av RNA av god kvalitet fra eosinofiler er alltid utfordrende på grunn av tilstedeværelsen av rikelig med proteiner som EDN, et medlem av RNase-familien) og redusere teknisk varians (f.eks. nCounter nanoString) for å forkorte prøvestørrelser. På den annen side, hypotesedrevne tilnærminger (f.eks. flowcytometri, RT-qPCR, ELISA), med fordelene av større troverdighet, mindre risiko for type I (dvs. falsk oppdagelse) og II feil, og enkel til fremtidig replikering av resultater. Disse målrettede metodene vil også bli brukt for å bekrefte kun klinisk relevante (høy effekt-størrelse) og signifikante (p-verdi < 0,05) forskjeller oppnådd med ikke-målrettede transkriptomiske/proteomiske tilnærminger.
• En annen potensiell begrensning er antallet eosinofiler, som potensielt kan være lavt hos enkelte pasienter etter behandling med mepolizumab (50 x 103 eller lavere). Derfor kan det være nødvendig å rense mer enn 1 eller 2 mL blod hos disse pasientene for å oppnå nok celler til å utføre de proteomiske og transkriptomiske eksperimentene. Vi har vurdert denne problemstillingen i studieprotokollen og i prosjektets budsjett.
• Til slutt er TripleTOF et svært følsomt massespektrometer designet for å grave dypere inn i komplekse prøver som det eosinofile proteomet. Den høye følsomheten til nåværende massespektrometre kombinert med todimensjonale skjemaer for nanoLC tillater påvisning av høyere antall proteiner (>1000) og analytter ved konsentrasjoner i det attomolare området (10-18), nok til å oppdage lavt rikelig med intracellulære proteiner som kjemokiner eller cytokiner. Således er TGFα, TGFβ1, CCL5, CCL23, CSF1, CCL18, CCL24, CXCL12 og IL-18 påvist av nanoLC-MS/MS (Q-TOF), men ikke andre som IL-5 eller IL-13 [69 ]. Denne forventede begrensningen skyldes tilstedeværelsen av peptider fra svært rikelig med proteiner (f.eks. eosinofile granulatproteiner) som undertrykker ioniseringen av peptider fra lavt rikelig med proteiner i LC-MS/MS-applikasjoner. Dette fører til overrepresentasjonen i listen over påviste proteiner av rikelig art som Charcot-Leyden krystallproteinet (CLC, galectin-10), som fortsatt er interessant for det nåværende prosjektet siden identifiserer eosinofiler med regulatorisk kapasitet. For å redusere prøvekompleksiteten og forbedre deteksjonen av proteiner med lav overflod, er det imidlertid forskjellige uttømming (f.eks. ACN-uttømming, ultrafiltrering, 1-DE) og anrikningsmetoder (f.eks. CPLL-er) som vi kan bruke for å få deteksjon følsomhet. Eventuelt målrettede tilnærminger som høy-multipleks immunoassays (f.eks. Olink Immune Response, Olink Inflammation eller Olink Immuno-Oncology paneler; https://www.olink.com/) har fordelen av høy deteksjonsfølsomhet med lavt volum av biologiske prøver (f.eks. cellelysater), selv om det bare tillater måling av 92 proteinbiomarkører samtidig.