非代償性肝硬変患者の再発性腹水の転帰における標的および応答誘導アルブミン療法と標準治療の有効性。

研究デザインの目的と目的 プライマリ

• 非代償性肝硬変患者の再発性腹水による6か月死亡率の低下における標的アルブミン療法と標準治療の有効性を研究すること

副次的な目的

• 両群における治療的腹腔穿刺の頻度を研究する
• 合併症の発生率: 穿刺誘発性循環機能障害 (PICD)、AKI、低ナトリウム血症、細菌感染、肝性脳症、静脈瘤出血
• 全身血行動態および門脈圧への影響
• フレイルとサルコペニアへの影響
• 両群の腹水解消までの時間
• eGFRおよびその他のバイオマーカー（尿-NGAL、腎臓損傷分子-1、肝臓-脂肪酸結合タンパク質（L-FABP））のシーケンシャルシスタチンCベースの式によって評価される腎予備能の変化3か月ごと
• 両群におけるβ遮断薬の副作用と中止率
• 6か月および1年の両方のグループで肝移植およびTIPSなしで生存
• 簡易調査で評価された生活の質-36 バージョン (SF-36)
• 免疫調節に対するアルブミン療法の効果
• アルブミンが 12 か月死亡率に及ぼす影響

方法論 投薬レジメン（被験者または動物の投薬について説明する） このオープンラベル無作為試験では、包含基準および除外基準を満たす連続した肝硬変患者が試験に登録される。 サンプルサイズの計算の詳細は、統計的手法のセクションに記載されています。 肝疾患の重症度は、重症度スコア（CTPおよびMELDスコア）に従って評価されます。

患者は、臨床試験コーディネーター (CTC) によって 2 つのグループに無作為に割り付けられます。 ＣＴＣは、患者および受けた治療に対して盲目的であり、連続番号が付けられた不透明密封封筒（ＳＮＯＳＥ）技術による割り当ての隠蔽が行われる。 患者は 2 週間、4 週間で血清アルブミン値、腹水グレード、利尿薬の使用を評価され、その後は 3 か月ごとに評価されます。

グループ A- 標準的な治療を受けます (詳細はグループ B の患者の場合と同じです) に加えて、以下のように標的アルブミン療法が行われます。

再発性腹水を伴う血清アルブミンが 3 g/L 未満の患者 - 3.0 g/L の目標血清アルブミンが達成されるまで、60 グラム/週で 20 % のアルブミンを受け取ります。アルブミン >3.5 g/L。 この目標を達成した患者は、患者が腹水および血清アルブミンが 3.5 gm/L を超えて完全に解消されるまで、またはこの患者がアルブミン 20 gm を 2 週間に 1 回投与されてから最大 6 か月間、20 gm/週を継続します グループ B: 標準医療治療 - 減塩、大量穿刺による利尿薬 これらの患者は、低ナトリウム食（2 g/日）を摂取し、ループ利尿薬（フロセミド 40-160 mg/日）と遠位作用利尿薬（スピロノラクトン 100-400 mg/日) を使用し、副作用を監視しながら一度に 1 段階ずつ用量を増やします。 大量の腹腔穿刺 (LVP) は、必要に応じて静脈内アルブミン (8 g/L の腹水を除去) と一緒に実行され、タップの頻度が記録されます。

フォローアップ: 2 週間、4 週間、その後 3 か月ごとに 1 年間

重要な定義:

反復性腹水は、食事のナトリウム制限および適切な利尿剤の投与にもかかわらず、12 か月の期間内に少なくとも 3 回再発する腹水として定義されます。

腹水の解消は、臨床的腹水（腹水グレード0または1）の欠如として定義されます。これは、利尿薬による腹水の解消として定義され、完全は、利尿薬を必要としない腹水の解消として定義されます。

調査: 門脈 (全身および肺の血行動態) および心臓の血行動態の評価を伴うベースライン HVPG、シスタチン C、サルコペニアの評価のための単純な CT スキャン。 体重、血圧、心エコー検査はすべての患者に対して行われます。 糸球体濾過率 (GFR) は、eGFR 方程式 - 腎疾患における食事の変更 (MDRD6) およびシスタチン C ベース (慢性腎臓病疫学コラボレーション) を使用して推定されます。 これに伴い、血漿レニン活性、血漿アルドステロンおよび血漿ノルエピネフリン濃度について、一晩絶食し、仰臥位で少なくとも8時間安静にした後、動脈血サンプルを採取する。 登録されたすべての患者に対して、尿中ナトリウムの評価を伴うベースライン尿検査も行われます。 その後、患者は 3 ～ 6 か月後に HVPG を受け、3 か月ごとにシスタチン C を受けます。 これとは別に、尿好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（NGAL）、血漿レニン活性、および血清アルドステロンレベルを、ベースライン、3および6か月で実施します。 サルコペニアを評価するために単純 CT スキャンを 3 か月目と 6 か月目に繰り返し行います。 追跡期間は 1 年または TIPS または肝移植までです。

アルブミン関連の免疫学的評価:

アルブミンの重要な作用機序として免疫調節を考慮する。 アルブミンアイソフォーム（HMA、HNA1、HNA2、IMA）、炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのレベル（マルチプレックスルミネックスベースのサイトカインアレイ）、炎症メディエーター（C-反応性タンパク質、エンドトキシンアッセイ、補体タンパク質; DAMPS );自然免疫細胞（単球、好中球）の頻度と機能プロファイル

アルブミンアイソフォーム分析:

化学物質 アルブミン アイソフォームの変化は、Thermoscientific USA の UHPLC に結合された電子スプレー イオン化オービトラップ HRMS システム (Q Exative plus) 質量分析計で、さまざまなアルブミン修飾 (HMA、HNA1、HNA2、IMA) の定量化によって行われます。ある時点 (0 日目と 3 か月目) の患者の血液を蒸留水で 1:4,000 の比率で希釈し、この希釈血漿 8 μL を高速液体クロマトグラフィー - 電子スプレーイオン化 MS システムに注入します。 . 高速液体クロマトグラフィー分離は、逆相 C8 カラム (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8、2.1 mm id 3 50 mm、1.8 lm スレッド カラム、孔径 300 Å) で 0.2 mL の流速で実行されます。 H2O-アセトニトリル (0.1% ギ酸を含む) 溶媒系を使用し、90% H2O から 90% アセトニトリルへの勾配で 25 分間、3 分から取得を開始します。 自動 MS 条件下で、質量スペクトル分析が実行されます。 同様の分析は、外因性アルブミン溶液でも実行されます。 得られた化合物電子スプレーイオン化ＭＳスペクトルは、ソフトウェアＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｓｏｆｔ ｗａｒｒｅ（ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析される。 ここでは、トータルイオンクロマトグラムからベースピーククロマトグラムを最小化した後、アルブミンマスクロマトグラムを取得して分析します。 得られたアルブミン スペクトルは、66,000 ～ 67,000 Da の質量範囲内でデコンボリューションされます (さまざまなアルブミン アイソフォームの分子量 [MW] がこの範囲内に収まるため)。 最後に、ピークの強度から、アルブミン アイソフォームの存在量が測定され、Das et.al 2017 で説明されているように、さまざまな HSA アイソフォームの相対的な存在量が報告されます。 これは、ベースラインと 3 か月で実行されます。 (質量分析 (MS) グレードの水、アセトニトリル、およびギ酸は、Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス) から購入します。 精製 HSA は Baxter (Gurgaon、インド) から購入しました。 すべての試薬は分析グレードのものになります。

サイトカイン アレイ 45 のサイトカイン、ケモカイン、および成長因子のパネルは、製造元のプロトコルに従って、Bio-Plex マルチプレックス サイトカイン ビーズ アッセイ システム (Bio-Rad, CA) を使用して、ベースラインおよび 3 か月の患者群の血漿で分析されます。 マルチプレックスアッセイで考慮されるアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は 5% 未満です。

自然免疫細胞のプロファイリング:

治療前および治療後の患者から全血を採取し、蛍光色素標識抗 CD14 抗 CD16 で染色することにより単球の頻度 % を評価し、好中球抗 CD11b 抗 CD16 抗 CD15、抗 CD66b を使用して取得および分析します。フローサイトメトリー FACS ヴァース (BD biosciences)。 自然免疫細胞の機能プロファイリングのために、血液は 2 つの部分に分けられます。 ＰＢＭＣは、ｆｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ（Ｈｉｍｅｄｉａ）を使用して単離され、単球は、ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈからのＣＤ１４単離キットを製造プロトコルに従って使用して単離される。 一方、血液の他の部分は、gran-hypaque (Himedia) を使用して好中球を分離するために使用されます。 IFN-γ、TNF-α、IL-1bなどの細胞内サイトカインは、低用量のLPS刺激後に分析されます。 また、貪食バーストまたは ROS 生成は、製造元の説明されているプロトコルを使用して行われます。 ここでも、FACS verse (BD biosciences) を使用してデータを取得し、分析します。

タツノオトシゴの代謝分析方法論:

単球のエネルギー代謝に対する影響 (免疫細胞の機能特性を導く) は、ベースライン時の患者の末梢血単球における Seahorse XF24 細胞外フラックス アナライザー機器を介して細胞外酸性化率 (ECAR) および酸素消費率 (OCR) を測定することによって分析されます。乳酸生産 (解糖速度の代理) と OXPHOS の測定としてそれぞれ 3 か月。 簡単に言えば、単球は、製造プロトコルに従って、miltenyi biotech の CD14 分離キットを使用して、採血したばかりの血液から分離されます。 単離された単球は、1ウェルあたり1×105細胞の密度で3連で播種されます。 アッセイを開始する前に、細胞を 10 mM グルコースおよび 1 mM ピルビン酸ナトリウムとグルタミンを添加した Seahorse Assay Medium で、CO2 を使用せずに 37°C のインキュベーターで 45 分間インキュベートします。 酸化的リン酸化のパラメーターのさらなる変化は、Oligomycin (ATPase 阻害剤、1 μM)、FCCP (0.2 μM)、およびロテノン (0.5 μM) による処理に応答した OCR のリアルタイム変化によって計算されます。

調査対象母集団：

対象集団/前臨床モデル (包含/除外基準または動物モデルを含む対象集団を説明する)

研究デザイン:

• ランダム化比較試験。
• この研究は、2020 年 8 月から 2022 年 8 月までにニューデリーの ILBS で肝臓科に入院した患者に対して実施されます。
• 研究グループは、再発性の腹水を伴う非代償性肝硬変の患者で構成されます

サンプルサイズの計算: Singh et al (Journal of Hepatology 2012) による無作為対照試験では、ミドドリンを投与した再発性腹水患者の 90 日死亡率は 15/20 (75%) 対 8/20 (40%) でした。標準治療群（大量の腹腔穿刺とアルブミン注入）。 アルブミンの生存率が 75% で SMT の生存率が 40% であると仮定すると、アルファが 5% で検出力が 90% の場合、90 のケース、つまり各グループに 45 のケースを登録する必要があります。 さらに、ドロップアウト率が 10% であると仮定すると、各グループに 50 の 100 ケースを登録し、ブロックサイズを 10 とするブロックランダム化法でランダムに割り当てる必要があります。

特定の時点での治療群の生存率 = 0.75 特定の時点での対照群の生存率 = 0.40 ハザード比 = 3.19 検出力 (%) = 90 アルファ エラー (%) = 5 両面 = 2 必要なサンプル治療グループのサイズ = 45 コントロール グループの必要なサンプル サイズ = 45 アルファ エラー (%) 検出力 (%) 第 1 グループ 第 2 グループ 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

介入: 標的アルブミン療法 モニタリングと評価: フォローアップ: 2 週間、4 週間、3 か月、その後 3 か月ごとに 1 年間

統計分析

• すべての変数は、平均 (sd) または中央値 (範囲) で表されます。
• 変数は、マンホイットニーの U 検定によって比較されます
• カテゴリ変数については、カイ二乗またはフィッシャーの検定を使用します
• 生存分析は、Cox 比例回帰分析を使用して行われます
• 数理生存確率はカプラン・マイヤーグラフで計算し、ログランク検定で比較する。
• TIPS や肝移植などの競合するイベントとのリスク生存分析の競合 副作用: アルブミンに対するアレルギー反応、呼吸困難の悪化、容量過負荷 停止規則: アルブミン注入に対する反応

研究における倫理的問題とこれらの問題に対処する計画:

試験プロトコルに関して倫理的な問題はありません。 アルブミンは、腹水を伴う肝硬変患者の管理に日常的に推奨されています。 大規模な多施設試験では、週に 40 グラムの高用量のアルブミンが、合併症のない腹水のある肝硬変患者の転帰を改善することが示されました。 しかし、これは、インドのような資源に制約のある国で高用量を提供する実現可能性に基づく臨床応用に欠けています. したがって、私たちのデータは、各患者に個別化された応答と全体的な結果の改善に対するその効果に基づいて、的を絞ったアプローチ（エスカレーション/エスカレーション解除）を提供します。 治験薬は無料で提供され、標準治療の一部ではない特別な調査の費用は患者が負担しません。