Skuteczność ukierunkowanej i ukierunkowanej na odpowiedź terapii albuminowej w porównaniu ze standardowym leczeniem medycznym w wynikach nawracającego wodobrzusza u pacjentów z niewyrównaną marskością wątroby.

Projekt badania Cel i zadania Podstawowe

• Zbadanie skuteczności ukierunkowanej terapii albuminami w porównaniu ze standardowym leczeniem medycznym w zmniejszaniu 6-miesięcznej śmiertelności w przypadku nawracającego wodobrzusza u pacjentów z niewyrównaną marskością wątroby

Cele drugorzędne

• Zbadanie częstości paracentezy terapeutycznej w obu grupach
• Częstość powikłań: zaburzenia krążenia wywołane paracentezą (PICD), AKI, hiponatremia, infekcje bakteryjne, encefalopatia wątrobowa i krwawienia z żylaków
• Wpływ na układową hemodynamikę i ciśnienie wrotne
• Wpływ na kruchość i sarkopenię
• Czas do ustąpienia wodobrzusza w obu grupach
• Zmiany rezerwy nerkowej oceniane za pomocą kolejnych równań opartych na cystatyny C dla eGFR i innych biomarkerów (mocz-NGAL, cząsteczka uszkodzenia nerek-1, białko wiążące kwasy tłuszczowe wątroby (L-FABP) co 3 miesiące)
• Działania niepożądane i wskaźniki odstawienia beta-adrenolityków w obu grupach
• Przeżycie bez przeszczepu wątroby i TIPS w obu grupach po 6 miesiącach i 1 roku
• Jakość życia oceniana za pomocą krótkiej ankiety w wersji 36 (SF-36)
• Wpływ terapii albuminami na immunomodulację
• Wpływ albuminy na 12-miesięczną śmiertelność

Metodologia DAWKOWANIE (opisać dawkowanie osobnika lub zwierzęcia) W tym otwartym, randomizowanym badaniu, kolejni pacjenci z marskością wątroby, spełniający kryteria włączenia i wykluczenia, zostaną włączeni do badania. Szczegóły dotyczące obliczania liczebności próby podano w rozdziale dotyczącym metod statystycznych. Nasilenie choroby wątroby zostanie ocenione zgodnie z oceną ciężkości - CTP i MELD.

Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do 2 grup przez koordynatora badań klinicznych (CTC). CTC będzie ślepy na pacjenta i otrzymane leczenie, a ukrywanie alokacji za pomocą techniki sekwencyjnie numerowanych nieprzezroczystych zapieczętowanych kopert (SNOSE) zostanie wykonane. Pacjenci byliby oceniani po 2 tygodniach, 4 tygodniach pod kątem poziomu albumin w surowicy, stopnia wodobrzusza i stosowania leków moczopędnych, a następnie co 3 miesiące

Grupa A — otrzyma standardową opiekę medyczną (szczegóły jak u pacjentów z grupy B) oraz terapię ukierunkowaną albuminą, jak poniżej:

Pacjenci z albuminą w surowicy <3 g/l z nawracającym wodobrzuszem - Otrzymują 20% albuminy w dawce 60 gramów/tydzień, aż do osiągnięcia docelowego stężenia albumin w surowicy wynoszącego 3,0 g/l, po czym pacjenci będą otrzymywać 40 gramów albuminy co tydzień do ustąpienia wodobrzusza lub albumina >3,5 g/L. Pacjenci, którzy osiągną ten cel, będą kontynuować dawkowanie 20 g/tydzień, aż do całkowitego ustąpienia wodobrzusza i stężenia albumin w surowicy >3,5 g/l lub maksymalnie przez 6 miesięcy po tym pacjenci będą otrzymywać albuminę w dawce 20 g raz na 2 tygodnie. Grupa B: standardowa medyczna Leczenie – ograniczenie soli, diuretyki z paracentezą o dużej objętości Pacjenci ci zostaną poddani diecie niskosodowej (2 g/dobę) i otrzymają kombinację diuretyku pętlowego (furosemid 40-160 mg/dobę) i diuretyku o działaniu dystalnym ( spironolaktonu 100-400 mg/dobę) ze zwiększaniem dawki o jeden krok na raz i monitorowaniem działań niepożądanych. Zostanie przeprowadzona paracenteza o dużej objętości (LVP) wraz z dożylnym podaniem albuminy (usunięto wodobrzusze 8 g/l) zgodnie z wymaganiami z zapisem częstotliwości nakłuć.

Kontynuacja: 2 tygodnie, 4 tygodnie, a następnie co 3 miesiące przez 1 rok

Ważne definicje:

Nawracające wodobrzusze będą definiowane jako wodobrzusze, które nawracają co najmniej trzy razy w okresie 12 miesięcy pomimo ograniczenia sodu w diecie i odpowiednich dawek leków moczopędnych.

Ustąpienie wodobrzusza byłoby zdefiniowane jako brak klinicznego wodobrzusza (wodobrzusze stopnia 0 lub 1), które może być częściowe - byłoby zdefiniowane jako ustąpienie wodobrzusza po zastosowaniu leków moczopędnych, a całkowite byłoby zdefiniowane jako ustąpienie wodobrzusza bez potrzeby stosowania leków moczopędnych.

Badania diagnostyczne: wyjściowa HVPG z oceną hemodynamiki wrotnej (hemodynamika ogólnoustrojowa i płucna) i hemodynamiki serca, cystatyna C, zwykły tomografia komputerowa w celu oceny sarkopenii. Masa ciała, ciśnienie krwi i echokardiogram byłyby wykonywane dla wszystkich pacjentów. Współczynnik przesączania kłębuszkowego (GFR) zostanie oszacowany za pomocą równań eGFR - modyfikacja diety w chorobie nerek (MDRD6) i cystatyna C na podstawie (współpraca z epidemiologią przewlekłej choroby nerek). Wraz z tym zostanie pobrana próbka krwi tętniczej po całonocnej głodówce i leżeniu w łóżku przez co najmniej 8 godzin w pozycji leżącej na aktywność reniny w osoczu, stężenie aldosteronu w osoczu i norepinefryny w osoczu. U wszystkich pacjentów włączonych do badania zostanie również wykonana wyjściowa analiza moczu z oceną stężenia sodu w moczu. Pacjenci byli następnie poddawani HVPG po 3-6 miesiącach i cystatynie C co 3 miesiące. Poza tym, poziom lipokaliny związanej z żelatynazą neutrofili w moczu (NGAL), aktywność reniny w osoczu i poziom aldosteronu w surowicy byłyby wykonywane na początku badania, po 3 i 6 miesiącach. Powtórzenie zwykłego skanu CT w celu oceny sarkopenii byłoby wykonane po 3 miesiącach i po 6 miesiącach. Obserwacja trwałaby 1 rok lub do TIPS lub przeszczepu wątroby.

Ocena immunologiczna związana z albuminami:

Uznanie immunomodulacji za ważny mechanizm działania albumin. Dodatkowe eksperymenty zostałyby przeprowadzone na początku badania, po 3 i 6 miesiącach, aby ocenić izoformy albuminy (HMA, HNA1, HNA2, IMA), poziomy cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych (macierz cytokin na bazie multipleksu luminex), mediatory stanu zapalnego (C- Białko reaktywne, test endotoksyny, białka komplementarne; DAMPS); Frekwencja i profil czynnościowy komórek odporności wrodzonej (monocyty, neutrofile)

Analiza izoform albuminy:

Chemikalia Zmiana izoformy albuminy zostanie przeprowadzona poprzez oznaczenie ilościowe różnych modyfikacji albuminy (HMA, HNA1, HNA2, IMA) na spektrometrze masowym HRMS z jonizacją przez rozpylanie elektronów (Q Exative plus) sprzężonym z UHPLC z firmy Thermoscientific USA. Pokrótce wyizolowane osocze krwi pacjentów w danym punkcie czasowym (dzień 0 i trzeci miesiąc) zostanie rozcieńczona wodą destylowaną w stosunku 1:4000, a następnie 8 ul tego rozcieńczonego osocza zostanie wstrzyknięte do systemu MS do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z jonizacją przez rozpylanie elektronów . Rozdział metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej zostanie przeprowadzony na kolumnie C8 z odwróconą fazą (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm id 3 50 mm, 1,8 µm gwintowana kolumna o wielkości porów 300 Å) przy natężeniu przepływu 0,2 ml /minutę stosując układ rozpuszczalników H2O-acetonitryl (z 0,1% kwasem mrówkowym) w gradiencie od 90% H2O do 90% acetonitrylu przez okres 25 minut, z akwizycją rozpoczynającą się po 3 minutach. W warunkach auto-MS zostanie przeprowadzona analiza widm masowych. Podobna analiza zostanie również przeprowadzona z roztworem egzogennej albuminy. Otrzymane widma MS złożonej jonizacji przez rozpylanie elektronów będą analizowane przy użyciu oprogramowania Protein Deconvolution soft warre (termo-naukowe Niemcy). Tutaj, po zminimalizowaniu chromatogramu piku podstawowego z chromatogramu jonów całkowitych, zostaną uzyskane i przeanalizowane chromatogramy masowe albuminy. Otrzymane widma albumin będą następnie dekonwoluowane w zakresie mas od 66 000 do 67 000 Da (ponieważ masa cząsteczkowa [MW] różnych izoform albumin mieści się w tym zakresie. Wreszcie, na podstawie intensywności pików, zmierzona zostanie obfitość izoform albuminy, a względna obfitość różnych izoform HSA zostanie podana, jak opisano w Das i in. 2017. Zostanie to przeprowadzone na początku badania i po 3 miesiącach. ( Woda do spektrometrii mas (MS), acetonitryl i kwas mrówkowy zostaną zakupione od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Oczyszczoną HSA zakupiono od firmy Baxter (Gurgaon, Indie). Wszystkie odczynniki będą miały stopień analityczny.

Macierz cytokin Panel 45 cytokin, chemokin i czynników wzrostu będzie analizowany w osoczu krwi grupy pacjentów na początku badania i po 3 miesiącach przy użyciu systemu oznaczania kulek cytokinowych Bio-Plex multiplex (Bio-Rad, CA) zgodnie z protokołem producenta. Współczynnik zmienności wewnątrz testu i między testami brany pod uwagę dla testów multipleksowych będzie < 5%

Profilowanie komórek odporności wrodzonej:

Całkowita krew pełna zostanie pobrana od pacjentów przed i po terapii i oceniona pod kątem procentowej częstości monocytów poprzez barwienie znakowanymi fluorochromem anty-CD14, anty-CD16 i neutrofili, anty-CD11b, anty-CD16, anty-CD15, anty-CD66b. cytometria przepływowa werset FACS (BD Biosciences). W celu profilowania funkcjonalnego komórek odporności wrodzonej krew zostanie podzielona na dwie części. PBMC zostaną wyizolowane przy użyciu ficoll-hypaque (Himedia), a monocyty zostaną wyizolowane przy użyciu zestawu do izolacji CD14 firmy miltenyi biotech zgodnie z protokołem wytwarzania. Podczas gdy inna część krwi zostanie wykorzystana do izolacji neutrofili przy użyciu gran-hypaque (Himedia). Wewnątrzkomórkowe cytokiny takie jak IFN-y, TNF-a, IL-1b będą analizowane po niskiej dawce stymulacji LPS. Również wybuch fagocytarny lub generowanie ROS zostanie przeprowadzone przy użyciu protokołu opisanego przez producenta. Ponownie dane zostaną pozyskane i przeanalizowane przy użyciu wersetu FACS (BD Biosciences).

Metodologia analizy metabolicznej konika morskiego:

Wpływ na metabolizm energetyczny monocytów (który kieruje właściwościami funkcjonalnymi komórek odpornościowych) jest analizowany poprzez pomiar wskaźnika zakwaszenia pozakomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą instrumentu Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer w monocytach krwi obwodowej pacjentów na początku badania i 3 miesiące jako miara produkcji mleczanu (zastępcza szybkość glikolizy) i odpowiednio OXPHOS. W skrócie, monocyty zostaną wyizolowane ze świeżo pobranej krwi przy użyciu zestawu do izolacji CD14 firmy miltenyi biotech, zgodnie z protokołem produkcji. Izolowane monocyty zostaną wysiane w trzech powtórzeniach przy gęstości 1 x 105 komórek na studzienkę. Przed rozpoczęciem testu komórki będą inkubowane w pożywce Seahorse Assay Medium uzupełnionej 10 mM glukozą i 1 mM pirogronianu sodu i glutaminą w inkubatorze w 37°C bez CO2 przez 45 min. Dalsza zmiana parametrów fosforylacji oksydacyjnej zostanie obliczona na podstawie zmiany OCR w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na leczenie oligomycyną (inhibitor ATPazy, 1 μM), FCCP (0,2 μM) i rotenonem (0,5 μM).

Badana populacja:

BADANA POPULACJA/MODEL PRZEDKLINICZNY (Opisać badaną populację, w tym kryteria włączenia/wyłączenia lub model zwierzęcy)

Projekt badania:

• Randomizowane badanie kontrolowane.
• Badanie zostanie przeprowadzone na pacjentach przyjętych do Kliniki Hepatologii w okresie od sierpnia 2020 do sierpnia 2022 w ILBS, New Delhi
• Grupę badaną stanowić będą pacjenci ze zdekompensowaną marskością wątroby z nawracającymi wodobrzuszami

Obliczenie wielkości próby: W randomizowanym badaniu kontrolowanym przeprowadzonym przez Singha i wsp. (Journal of Hepatology 2012) 90-dniowa śmiertelność u pacjentów z nawracającym wodobrzuszem przyjmujących midodrynę wynosiła 15/20 (75%) w porównaniu z 8/20 (40%) w grupa standardowego leczenia (paracenteza wielkoobjętościowa i infuzje albumin). Zakładając, że przeżycie dla albuminy wynosi 75%, a przy SMT 40%, to przy alfa 5% i mocy 90% musimy zapisać 90 przypadków, czyli po 45 przypadków w każdej grupie. Ponadto zakładając 10% wskaźnik rezygnacji, musimy zarejestrować 100 przypadków po 50 w każdej grupie i losowo przydzielonych metodą randomizacji bloków z wielkością bloku przyjętą jako 10.

Odsetek przeżycia w grupie leczonej w danym punkcie czasowym = 0,75 Odsetek przeżycia w grupie kontrolnej w danym punkcie czasowym = 0,40 Współczynnik ryzyka = 3,19 Moc (%) = 90 Błąd alfa (%) = 5-stronny = 2 Wymagana próbka liczebność grupy badanej = 45 Wymagana wielkość próby dla grupy kontrolnej = 45 Błąd alfa (%) Moc (%) Pierwsza grupa Druga grupa 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Interwencja: Ukierunkowana terapia albuminami Monitorowanie i ocena: Obserwacja: 2 tygodnie, 4 tygodnie, 3 miesiące, następnie co 3 miesiące przez 1 rok

Analiza statystyczna

• Wszystkie zmienne wyraża się jako średnią (sd) lub medianę (zakres)
• Zmienne zostaną porównane testem U Manna-Whitneya
• Dla zmiennych kategorialnych użyjemy testu Chi-Square lub Fishera
• Analiza przeżycia zostanie przeprowadzona przy użyciu analizy regresji proporcjonalnej Coxa
• Aktuarialne prawdopodobieństwo przeżycia oblicza się za pomocą wykresu Kaplana-Meiera i porównuje za pomocą testu log-rank.
• Przeprowadzona zostanie analiza przeżycia współzawodniczącego z konkurencyjnymi zdarzeniami, takimi jak TIPS i przeszczep wątroby Działania niepożądane: Reakcje alergiczne na albuminę, nasilenie duszności, przeciążenie objętościowe Zasada zatrzymania: Reakcja na wlew albuminy

Kwestie etyczne w badaniu i plany rozwiązania tych problemów:

Nie ma żadnych problemów etycznych w odniesieniu do protokołu badania. Albumina jest rutynowo zalecana w leczeniu pacjentów z marskością wątroby i wodobrzuszem. W dużym wieloośrodkowym badaniu wykazano, że wysoka dawka albuminy wynosząca 40 gramów/tydzień poprawia wyniki leczenia marskości wątroby z niepowikłanym wodobrzuszem. Nie ma to jednak zastosowania klinicznego opartego na możliwości zapewnienia wysokich dawek w kraju o ograniczonych zasobach, takim jak Indie. Nasze dane dostarczyłyby zatem ukierunkowanego podejścia (eskalacja/deeskalacja) w oparciu o odpowiedź zindywidualizowaną dla każdego pacjenta i jej wpływ na poprawę ogólnych wyników. Badany lek byłby dostarczany bezpłatnie, a koszty specjalnych badań, które nie są częścią standardowej opieki, nie byłyby ponoszone przez pacjentów.