靶向和反应引导白蛋白治疗与标准药物治疗对失代偿性肝硬化患者复发性腹水结局的疗效。

研究设计的主要目的和目标

• 研究靶向白蛋白治疗与标准药物治疗在降低失代偿性肝硬化患者复发性腹水 6 个月死亡率方面的疗效

次要目标

• 研究两组治疗性腹腔穿刺术的频率
• 并发症的发生率：穿刺引起的循环功能障碍（PICD）、AKI、低钠血症、细菌感染、肝性脑病和静脉曲张出血
• 对全身血流动力学和门静脉压力的影响
• 对虚弱和肌肉减少症的影响
• 两组腹水消退时间
• 通过 eGFR 和其他生物标志物（尿-NGAL、肾损伤分子-1、肝-脂肪酸结合蛋白 (L-FABP) 每 3 个月）的连续胱抑素 C 方程评估的肾脏储备变化
• 两组β受体阻滞剂的不良反应和停药率
• 两组在 6 个月和 1 年时无肝移植和 TIPS 的生存率
• 通过简表调查 36 版 (SF-36) 评估的生活质量
• 白蛋白治疗对免疫调节的影响
• 白蛋白对 12 个月死亡率的影响

方法学 给药方案（描述受试者或动物给药） 在这项开放标记的随机研究中，符合纳入标准和排除标准的连续肝硬化患者将被纳入研究。 样本量计算的详细信息在统计方法部分给出。 将根据严重程度评分-CTP和MELD评分评估肝病的严重程度。

临床试验协调员 (CTC) 会将患者随机分为 2 组。 CTC 将对患者和接受的治疗不知情，并通过顺序编号的不透明密封信封 (SNOSE) 技术进行分配隐藏。 患者将在 2 周、4 周时评估血清白蛋白水平、腹水等级和使用利尿剂，然后每 3 个月评估一次

A 组 - 将接受标准药物治疗（细节与 B 组患者相同）加上靶向白蛋白治疗，如下所示：

血清白蛋白 <3 g/L 且复发性腹水的患者 - 将以 60 克/周的速度接受 20% 的白蛋白，直到达到目标血清白蛋白 3.0 g/L 之后，患者每周将接受 40 克白蛋白，直到腹水消退或血清白蛋白 >3.5 g/L。 达到该目标的患者将继续使用 20 克/周，直到患者腹水完全消退且血清白蛋白 >3.5 克/升或最长 6 个月后患者将每 2 周接受一次 20 克白蛋白 B 组：标准医疗治疗-限盐、利尿剂和大量腹腔穿刺术这些患者将接受低钠饮食（2 克/天），并联合使用袢利尿剂（呋塞米 40-160 毫克/天）和远端作用利尿剂（螺内酯 100-400 mg/天），每次一步一步增加剂量，同时监测副作用。 大体积腹腔穿刺术 (LVP) 将根据需要与静脉注射白蛋白（去除 8 g/L 腹水）一起进行，并记录穿刺频率。

随访：2 周、4 周，然后每 3 个月一次，持续 1 年

重要定义：

复发性腹水将被定义为在 12 个月内至少复发 3 次的腹水，尽管饮食钠限制和足够的利尿剂剂量。

腹水消退定义为不存在临床腹水（0 级或 1 级腹水），这可以是部分腹水消退定义为利尿剂腹水消退，完全消退定义为不需要利尿剂腹水消退。

研究：基线 HVPG 评估门静脉（全身和肺血流动力学）和心脏血流动力学、胱抑素 C、用于评估肌肉减少症的普通 CT 扫描。 将对所有患者进行体重、血压和超声心动图检查。 肾小球滤过率 (GFR) 将通过使用 eGFR 方程式 - 肾病饮食调整 (MDRD6) 和基于胱抑素 C（慢性肾病流行病学协作）进行估算。 与此同时，在禁食过夜和卧床休息至少 8 小时后采集动脉血样，以检测血浆肾素活性、血浆醛固酮和血浆去甲肾上腺素浓度。 还将对所有登记的患者进行基线尿液分析和尿钠评估。 患者随后将在 3-6 个月后接受 HVPG，每 3 个月接受一次胱抑素 C。 除此之外，还将在基线、3 个月和 6 个月时检测尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (NGAL)、血浆肾素活性和血清醛固酮水平。 将在 3 个月和 6 个月时进行重复的普通 CT 扫描以评估肌肉减少症。 随访将持续 1 年或直至 TIPS 或肝移植。

白蛋白相关免疫学评估：

将免疫调节视为白蛋白的重要作用机制。 将在基线、3 个月和 6 个月时进行额外的实验，以评估白蛋白亚型（HMA、HNA1、HNA2、IMA）、促炎和抗炎细胞因子水平（基于多重 luminex 的细胞因子阵列）、炎症介质（C-反应蛋白、内毒素测定、补体蛋白；DAMPS）；先天免疫细胞（单核细胞、中性粒细胞）的频率和功能概况

白蛋白亚型分析：

白蛋白亚型的化学变化将通过在电子喷雾电离轨道阱 HRMS 系统“(Q Exative plus) 质谱仪上对不同的白蛋白修饰物（HMA、HNA1、HNA2、IMA）进行定量来完成。在给定时间点（第 0 天和三个月）的患者血液将以 1:4,000 的比例用蒸馏水稀释，然后将 8 uL 这种稀释血浆注入高效液相色谱-电子喷雾电离 MS 系统. 高效液相色谱分离将在反相 C8 柱（Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8，2.1 mm id 3 50 mm，1.8 lm 螺纹柱，孔径为 300 Å）上以 0.2 mL 的流速进行/分钟，使用 H2O-乙腈（含 0.1% 甲酸）溶剂系统，在 90% H2O 至 90% 乙腈的梯度下，历时 25 分钟，从 3 分钟开始采集。 在自动 MS 条件下，将执行质谱分析。 还将用外源性白蛋白溶液进行类似的分析。 将使用软件 Protein Deconvolution soft warre (thermoscientific germany) 分析获得的化合物电子喷雾电离 MS 谱。 在这里，从总离子色谱图中最小化基峰色谱后，将获得白蛋白质量色谱并进行分析。 获得的白蛋白谱图将在 66,000-67,000 Da 的质量范围内进行解卷积（因为各种白蛋白异构体的分子量 [MW] 落在该范围内。 最后，根据峰的强度，将测量白蛋白异构体的丰度，并如 Das 等人 2017 中所述报告各种 HSA 异构体的相对丰度。 这将在基线和 3 个月时进行。 ( 质谱 (MS) 级水、乙腈和甲酸将从 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 购买。 纯化的 HSA 购自 Baxter（印度古尔冈）。 所有试剂均为分析级。

细胞因子阵列 一组 45 种细胞因子、趋化因子和生长因子将根据制造商的方案使用 Bio-Plex 多重细胞因子珠测定系统（Bio-Rad，CA）在基线和 3 个月时在患者组的血浆中进行分析。 考虑用于多重测定的测定内和测定间变异系数将 < 5%

先天免疫细胞分析：

将从治疗前和治疗后的患者收集全血，并通过用荧光染料标记的抗 CD14 抗 CD16 染色评估单核细胞的百分比频率，并评估嗜中性粒细胞抗 CD11b 抗 CD16 抗 CD15、抗 CD66b 的频率，并将使用流式细胞术 FACS verse (BD biosciences)。 对于先天免疫细胞的功能分析，血液将分为两部分。 PBMCs 将使用 ficoll-hypaque (Himedia) 进行分离，单核细胞将根据制造方案使用来自 miltenyi biotech 的 CD14 分离试剂盒进行分离。 然而，血液的其他部分将用于使用 gran-hypaque (Himedia) 分离中性粒细胞。 在低剂量的 LPS 刺激后，将分析细胞内细胞因子，如 IFN-γ、TNF-α、IL-1b。 此外，吞噬细胞爆发或 ROS 生成将使用制造商描述的协议来完成。 再次使用 FACS verse (BD biosciences) 获取和分析数据。

海马代谢分析方法：

我们通过 Seahorse XF24 细胞外通量分析仪测量患者基线时外周血单核细胞的细胞外酸化率 (ECAR) 和耗氧率 (OCR) 对单核细胞能量代谢（指导免疫细胞功能特性）的影响进行分析和 3 个月分别作为乳酸产生（糖酵解率的替代指标）和 OXPHOS 的量度。 简而言之，将根据制造协议使用美天宜生物技术公司的 CD14 分离试剂盒从新鲜收集的血液中分离单核细胞。 分离的单核细胞将以每孔 1X105 个细胞的密度一式三份接种。 在开始测定之前，细胞将在补充有 10 mM 葡萄糖和 1 mM 丙酮酸钠和谷氨酰胺的 Seahorse 测定培养基中在 37°C 无 CO2 培养箱中孵育 45 分钟。 氧化磷酸化参数的进一步变化将通过 OCR 响应寡霉素（ATP 酶抑制剂，1 μM）、FCCP（0.2 μM）和鱼藤酮（0.5 μM）处理的实时变化来计算。

研究人群：

受试者人群/临床前模型（描述受试者人群，包括纳入/排除标准或动物模型）

学习规划：

• 一项随机对照研究。
• 该研究将针对 2020 年 8 月至 2022 年 8 月在新德里 ILBS 肝病科收治的患者进行
• 研究组将包括失代偿期肝硬化伴复发性腹水的患者

样本量计算：在 Singh 等人的随机对照试验（Journal of Hepatology 2012）中，服用米多君的复发性腹水患者的 90 天死亡率分别为 15/20 (75%) 和 8/20(40%)标准内科治疗组（大量腹腔穿刺和输注白蛋白）。 假设白蛋白的存活率为 75%，SMT 为 40%，那么在 alpha 为 5% 和功效为 90% 的情况下，我们需要招募 90 个病例，即每组 45 个病例。 进一步假设 10% 的辍学率，我们需要招募 100 个案例，每组 50 个，并使用块随机化方法随机分配，块大小取为 10。

治疗组在给定时间点的存活比例 = 0.75 对照组在给定时间点的存活比例 = 0.40 风险比 = 3.19 功效 (%) = 90 阿尔法误差 (%) = 5 面 = 2 所需样本治疗组大小 = 45 对照组所需样本大小 = 45 阿尔法误差 (%) 功效 (%) 第一组 第二组 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

干预：靶向白蛋白治疗 监测和评估：随访：2 周、4 周、3 个月，然后每 3 个月一次，持续 1 年

统计分析

• 所有变量均应以平均值（sd）或中位数（范围）表示
• 变量将通过 Mann-Whitney U 检验进行比较
• 对于分类变量，我们将使用卡方检验或 Fisher 检验
• 将使用 Cox 比例回归分析进行生存分析
• 精算生存概率应通过Kaplan-Meier图计算并通过对数秩检验进行比较。
• 将进行 TIPS 和肝移植等竞争事件的竞争风险生存分析 不良反应：对白蛋白的过敏反应、呼吸困难恶化、容量超负荷 停止规则：对输注白蛋白的反应

研究中的伦理问题和解决这些问题的计划：

试验方案不存在伦理问题。 白蛋白常规推荐用于肝硬化腹水患者的治疗。 在一项大型多中心试验中，显示 40 克/周的高剂量白蛋白可改善伴有无并发症腹水的肝硬化患者的预后。 然而，这缺乏基于在像印度这样的资源有限国家提供高剂量的可行性的临床应用。 因此，我们的数据将根据每个患者的个体化反应及其对改善总体结果的影响提供有针对性的方法（升级/降级）。 研究药物将免费提供，不属于护理标准的特殊检查费用将不会由患者承担。