Eficácia da terapia de albumina direcionada e guiada por resposta versus tratamento médico padrão nos resultados de ascite recorrente em pacientes com cirrose descompensada.

Alvo e Objetivos do Desenho do Estudo Primário

• Estudar a eficácia da terapia com albumina direcionada versus tratamento médico padrão na redução da mortalidade em 6 meses em ascite recorrente em pacientes com cirrose descompensada

Objetivos Secundários

• Estudar a frequência de paracentese terapêutica em ambos os grupos
• Incidência de complicações: disfunção circulatória induzida por paracentese (PICD), LRA, hiponatremia, infecções bacterianas, encefalopatia hepática e sangramento varicoso
• Impacto na hemodinâmica sistêmica e nas pressões portais
• Impacto na fragilidade e sarcopenia
• Tempo para resolução da ascite em ambos os grupos
• Alterações na reserva renal avaliadas por equações sequenciais baseadas em cistatina C para eGFR e outros biomarcadores (urina-NGAL, molécula de lesão renal-1, proteína de ligação de ácidos graxos do fígado (L-FABP) a cada 3 meses)
• Efeitos adversos e taxas de descontinuação de betabloqueadores em ambos os grupos
• Sobrevida livre de transplante de fígado e TIPS em ambos os grupos em 6 meses e 1 ano
• Qualidade de vida avaliada pela versão abreviada da pesquisa-36 (SF-36)
• Efeito da terapia com albumina na imunomodulação
• Efeito da albumina na mortalidade em 12 meses

Metodologia REGIME DE DOSAGEM (Descreva a dosagem do sujeito ou animal) Neste estudo randomizado aberto, pacientes cirróticos consecutivos, preenchendo os critérios de inclusão e exclusão serão incluídos no estudo. Os detalhes do cálculo do tamanho da amostra são fornecidos na seção de métodos estatísticos. A gravidade da doença hepática será avaliada de acordo com os escores de gravidade - CTP e MELD.

Os pacientes serão randomizados em 2 grupos pelo coordenador do estudo clínico (CTC). O CTC será cego para o paciente e o tratamento recebido, e a ocultação da alocação pela técnica de envelopes opacos selados sequencialmente numerados (SNOSE) seria feita. Os pacientes seriam avaliados em 2 semanas, 4 semanas com níveis séricos de albumina, grau de ascite e uso de diuréticos e depois a cada 3 meses

Grupo A- Receberia tratamento médico padrão (detalhes como em pacientes para o Grupo B) mais terapia de albumina direcionada seria dada conforme abaixo:

Pacientes com albumina sérica <3 g/L com ascite recorrente - Receberão 20% de albumina a 60 gramas/semana até que a meta de albumina sérica de 3,0 g/L seja alcançada. albumina >3,5 g/L. Os pacientes que atingirem essa meta continuarão com 20 g/semana até que o paciente tenha resolução completa da ascite e albumina sérica > 3,5 g/L ou no máximo 6 meses após isso, os pacientes receberiam 20 g de albumina uma vez a cada 2 semanas Grupo B: Médico padrão Tratamento - Restrição de sal, diuréticos com paracentese de grande volume Esses pacientes serão colocados em dieta com baixo teor de sódio (2 g/dia) e receberão uma combinação de diurético de alça (furosemida 40-160 mg/dia) e um diurético de ação distal ( espironolactona 100-400 mg/dia) com aumento da dose em um passo de cada vez com monitoramento de efeitos colaterais. Paracentese de grande volume (LVP) será realizada juntamente com albumina intravenosa (8 g/L de ascite removida) conforme necessário com registro da frequência das torneiras.

Acompanhamento: 2 semanas, 4 semanas e depois a cada 3 meses por 1 ano

Definições importantes:

Ascite recorrente será definida como ascite recorrente em pelo menos três ocasiões em um período de 12 meses, apesar da restrição dietética de sódio e doses adequadas de diuréticos.

A resolução da ascite seria definida como ausência de ascite clínica (ascite grau 0 ou 1), que pode ser parcial- Seria definida como resolução da ascite com diuréticos e completa seria definida como resolução da ascite sem a necessidade de diuréticos.

Investigações: HVPG basal com avaliação da hemodinâmica portal (hemodinâmica sistêmica e pulmonar) e hemodinâmica cardíaca, cistatina C, tomografia computadorizada simples para avaliação de sarcopenia. Peso corporal, pressão arterial e ecocardiograma seriam feitos para todos os pacientes. A taxa de filtração glomerular (GFR) será estimada usando equações eGFR - modificação da dieta na doença renal (MDRD6) e com base na cistatina C (Chronic renal disease Epidemiology Collaboration). Junto com isso, uma amostra de sangue arterial será coletada após jejum noturno e repouso no leito por pelo menos 8 h em posição supina para atividade de renina plasmática, aldosterona plasmática e concentração plasmática de norepinefrina. Um exame de urina inicial com avaliação do sódio urinário também seria feito para todos os pacientes inscritos. Os pacientes seriam subseqüentemente submetidos a HVPG após 3-6 meses e cistatina C a cada 3 meses. Além disso, a lipocalina associada à neutrófilo-gelatinase na urina (NGAL), a atividade da renina plasmática e os níveis séricos de aldosterona seriam avaliados na linha de base, 3 e 6 meses. Uma repetição da TC simples para avaliar a sarcopenia seria feita aos 3 meses e aos 6 meses. O acompanhamento seria de 1 ano ou até TIPS ou transplante de fígado.

Avaliação imunológica relacionada à albumina:

Considerando a imunomodulação como um importante mecanismo de ação da albumina. Experimentos adicionais seriam feitos na linha de base, 3 e 6 meses para avaliar as isoformas de albumina (HMA, HNA1, HNA2, IMA), níveis de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias (array de citocinas baseado em luminex multiplex), mediadores inflamatórios (C- Proteína reativa, ensaio de endotoxina, proteínas complementares; DAMPS ); Frequência e perfil funcional de células imunes inatas (monócitos, neutrófilos)

Análise de isoformas de albumina:

Substâncias químicas A alteração na isoforma da albumina será feita pela quantificação de diferentes modificações da albumina (HMA, HNA1, HNA2, IMA) em um sistema orbitrap de ionização por spray de elétrons HRMS "(Q Exative plus) espectrômetro de massa acoplado a UHPLC da Thermoscientific USA. Resumidamente o plasma isolado do sangue do paciente em um determinado ponto de tempo (dia 0 e três meses) será diluído com água destilada na proporção de 1:4.000 e, em seguida, 8 uL desse plasma diluído serão injetados no sistema MS de ionização por spray de elétrons por cromatografia líquida de alta eficiência . A separação por cromatografia líquida de alto desempenho será realizada em uma coluna C8 de fase reversa (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm id 3 50 mm, coluna rosqueada de 1,8 lm com tamanho de poro de 300 Å) a uma taxa de fluxo de 0,2 mL /minuto usando um sistema de solvente H2O-acetonitrila (com 0,1% de ácido fórmico) sob um gradiente de 90% de H2O a 90% de acetonitrila durante um período de 25 minutos com aquisição começando em 3 minutos. Sob condições de auto-MS, a análise espectral de massa será realizada. Uma análise semelhante também será realizada com solução de albumina exógena. Os espectros de MS de ionização por spray de elétrons obtidos serão analisados ​​usando o software Protein Deconvolution soft warre (thermoscientific alemanha). Aqui, depois de minimizar o cromatograma de pico de base do cromatograma de íon total, os cromatogramas de massa de albumina serão obtidos e analisados. Os espectros de albumina obtidos serão então deconvoluídos dentro da faixa de massa de 66.000-67.000 Da (uma vez que o peso molecular [MW] de várias isoformas de albumina cai dentro desta faixa. Finalmente, a partir da intensidade dos picos, a abundância de isoformas de albumina será medida e a abundância relativa das várias isoformas de HSA será relatada conforme descrito em Das et.al 2017. Isso será realizado na linha de base e 3 meses. (Água de grau de espectrometria de massa (MS), acetonitrila e ácido fórmico serão adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O HSA purificado foi adquirido da Baxter (Gurgaon, Índia). Todos os reagentes serão de grau analítico.

Matriz de citocinas Um painel de 45 citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento será analisado no plasma sanguíneo do grupo de pacientes na linha de base e 3 meses usando um sistema de ensaio de citocinas multiplex Bio-Plex (Bio-Rad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O coeficiente de variação intra-ensaio e inter-ensaio considerado para ensaios multiplex será < 5%

Perfil de células imunes inatas:

Sangue total total será coletado de pacientes pré e pós-terapia e avaliado quanto à % de frequência de monócitos por coloração com anti-CD14 anti-CD16 marcado com fluorocromo e para neutrófilos anti-CD11b anti-CD16 anti-CD15, anti-CD66b e será adquirido e analisado usando citometria de fluxo FACS verso (BD biociências). Para o perfil funcional das células imunes inatas, o sangue será dividido em duas partes. As PBMCs serão isoladas usando ficoll-hypaque (Himedia) e os monócitos serão isolados usando o kit de isolamento CD14 da miltenyi biotech de acordo com o protocolo de fabricação. Já outra parte do sangue será utilizada para isolar os neutrófilos utilizando gran-hypaque (Himedia). As citocinas intracelulares como IFN-y, TNF-a, IL-1b serão analisadas após estimulação com baixa dose de LPS. Além disso, a explosão fagocitária ou geração de ROS será feita usando o protocolo descrito pelo fabricante. Mais uma vez, os dados serão adquiridos e analisados ​​usando FACS verso (BD biociências).

Metodologia de análise metabólica de cavalos-marinhos:

O efeito no metabolismo energético dos monócitos (que orientam a propriedade funcional das células imunes) será analisado medindo a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) através do instrumento Seahorse XF24 Extracelular Flux Analyzer em monócitos do sangue periférico de pacientes na linha de base e 3 meses como medida da produção de lactato (um substituto para a taxa glicolítica) e OXPHOS, respectivamente. Em resumo, os monócitos serão isolados do sangue recém-coletado usando o kit de isolamento CD14 da miltenyi biotech de acordo com o protocolo de fabricação. Os monócitos isolados serão semeados em triplicado a uma densidade de 1X105 células por poço. Antes de iniciar o ensaio, as células serão incubadas em Seahorse Assay Medium suplementado com 10 mM de glicose e 1 mM de piruvato de sódio e glutamina em incubadora a 37°C sem CO2 por 45 min. Alterações adicionais nos parâmetros de fosforilação oxidativa serão calculadas por uma alteração em tempo real no OCR em resposta ao tratamento com Oligomicina (inibidor de ATPase, 1 μM), FCCP (0,2 μM) e rotenona (0,5 μM).

População do estudo:

POPULAÇÃO DO SUJEITO/MODELO PRÉ-CLÍNICO (Descreva a população do sujeito incluindo critérios de inclusão/exclusão ou modelo animal)

Design de estudo:

• Um estudo randomizado controlado.
• O estudo será realizado em pacientes admitidos no Departamento de Hepatologia de agosto de 2020 a agosto de 2022 no ILBS, Nova Delhi
• Grupo de estudo será composto por pacientes com cirrose descompensada com ascite recorrente

Cálculo do tamanho da amostra: No estudo controlado randomizado de Singh et al (Journal of Hepatology 2012), a mortalidade em 90 dias em pacientes com ascite recorrente em midodrina foi de 15/20 (75%) vs. 8/20 (40%) no grupo de tratamento médico padrão (paracentese de grande volume e infusões de albumina). Assumindo que a sobrevida para albumina é de 75% e com SMT é de 40%, então com alfa de 5% e poder de 90%, precisamos registrar 90 casos, ou seja, 45 casos em cada grupo. Além disso, assumindo uma taxa de abandono de 10%, precisamos inscrever 100 casos, 50 em cada grupo e alocados aleatoriamente com o método de randomização de blocos com tamanho de bloco considerado como 10.

Proporção de sobrevivência no grupo de tratamento em um determinado momento = 0,75 Proporção de sobrevivência no grupo de controle em um determinado momento = 0,40 Razão de risco = 3,19 Potência (%) = 90 Erro alfa (%) = 5 lados = 2 Amostra necessária tamanho para grupo de tratamento = 45 Tamanho de amostra necessário para grupo de controle = 45 Erro alfa (%) Poder (%) Primeiro Grupo Segundo Grupo 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Intervenção: Terapia de albumina direcionada Monitoramento e avaliação: Acompanhamento: 2 semanas, 4 semanas, 3 meses, depois a cada 3 meses por 1 ano

Análise estatística

• Todas as variáveis ​​devem ser expressas em média (sd) ou mediana (intervalo)
• As variáveis ​​serão comparadas pelo teste Mann-Whitney U
• Para variáveis ​​categóricas, usaremos o teste Qui-quadrado ou Fisher
• A análise de sobrevivência será feita usando a análise de regressão proporcional de Cox
• A probabilidade atuarial de sobrevivência será calculada pelo gráfico de Kaplan-Meier e comparada pelo teste de log-rank.
• Seria realizada análise de sobrevida de risco competitivo com eventos concorrentes como TIPS e transplante de fígado Efeitos adversos: Reações alérgicas à albumina, piora da dispneia, sobrecarga de volume Regra de parada: Reação à infusão de albumina

Questões éticas no estudo e planos para abordar essas questões:

Não há questões éticas com relação ao protocolo do estudo. A albumina é rotineiramente recomendada para o manejo de pacientes com cirrose com ascite. Em um grande estudo multicêntrico, foi demonstrado que altas doses de albumina de 40 gramas/semana melhoraram os resultados em cirróticos com ascite não complicada. No entanto, isso carece de aplicação clínica com base na viabilidade de fornecer altas doses em um país com restrição de recursos como a Índia. Nossos dados forneceriam, portanto, uma abordagem direcionada (escalonamento/desescalonamento) com base na resposta individualizada para cada paciente e seu efeito na melhoria dos resultados gerais. O medicamento do estudo seria fornecido gratuitamente e o custo de investigações especiais que não fazem parte do padrão de tratamento não seriam arcados pelos pacientes.