Efficacia della terapia con albumina mirata e guidata dalla risposta rispetto al trattamento medico standard negli esiti di ascite ricorrente nei pazienti con cirrosi scompensata.

Disegno dello studio Scopo e obiettivi Primario

• Studiare l'efficacia della terapia mirata con albumina rispetto al trattamento medico standard nella riduzione della mortalità a 6 mesi nell'ascite ricorrente nei pazienti con cirrosi scompensata

Obiettivi secondari

• Studiare la frequenza della paracentesi terapeutica in entrambi i gruppi
• Incidenza delle complicanze: disfunzione circolatoria indotta da paracentesi (PICD), AKI, iponatriemia, infezioni batteriche, encefalopatia epatica e sanguinamento da varici
• Impatto sull'emodinamica sistemica e sulle pressioni portali
• Impatto su fragilità e sarcopenia
• Tempo di risoluzione dell'ascite in entrambi i gruppi
• Variazioni della riserva renale valutate mediante equazioni sequenziali basate sulla cistatina C per eGFR e altri biomarcatori (urina-NGAL, molecola di danno renale-1, proteina legante gli acidi grassi del fegato (L-FABP) ogni 3 mesi)
• Effetti avversi e tassi di interruzione dei beta-bloccanti in entrambi i gruppi
• Sopravvivenza senza trapianto di fegato e TIPS in entrambi i gruppi a 6 mesi e 1 anno
• Qualità della vita valutata dalla versione short form survey-36 (SF-36)
• Effetto della terapia con albumina sull'immunomodulazione
• Effetto dell'albumina sulla mortalità a 12 mesi

Metodologia REGIME DI DOSAGGIO (Descrivere il soggetto o il dosaggio dell'animale) In questo studio randomizzato in aperto, verranno arruolati nello studio pazienti cirrotici consecutivi che soddisfano i criteri di inclusione e di esclusione. I dettagli del calcolo della dimensione del campione sono forniti nella sezione dei metodi statistici. La gravità della malattia epatica sarà valutata in base ai punteggi di gravità: punteggio CTP e MELD.

I pazienti saranno randomizzati in 2 gruppi dal coordinatore della sperimentazione clinica (CTC). Il CTC sarà cieco nei confronti del paziente e del trattamento ricevuto e verrà eseguita l'occultamento dell'assegnazione mediante la tecnica delle buste sigillate opache numerate in sequenza (SNOSE). I pazienti verrebbero valutati a 2 settimane, 4 settimane con livelli di albumina sierica, grado di ascite e uso di diuretici e poi ogni 3 mesi

Gruppo A- Riceverebbe cure mediche standard (dettagli come nei pazienti per il gruppo B) più la terapia mirata con albumina sarebbe data come sotto:

Pazienti con albumina sierica <3 g/L con ascite ricorrente - Riceveranno il 20% di albumina a 60 grammi/settimana fino al raggiungimento di un target di albumina sierica di 3,0 g/L in seguito a questo i pazienti riceveranno 40 grammi di albumina ogni settimana fino alla risoluzione dell'ascite o siero albumina >3,5 g/L. I pazienti che raggiungono questo obiettivo continueranno con 20 g/settimana fino a quando il paziente non avrà la completa risoluzione dell'ascite e dell'albumina sierica > 3,5 g/L o per un massimo di 6 mesi dopo questo i pazienti riceveranno 20 g di albumina una volta ogni 2 settimane Gruppo B: standard medico Trattamento: restrizione del sale, diuretici con paracentesi di volume elevato Questi pazienti verranno sottoposti a una dieta a basso contenuto di sodio (2 g/giorno) e verrà somministrata una combinazione di diuretico dell'ansa (furosemide 40-160 mg/giorno) e un diuretico ad azione distale ( spironolattone 100-400 mg/giorno) con aumento della dose di un livello alla volta con monitoraggio degli effetti collaterali. Verrà eseguita la paracentesi di grande volume (LVP) insieme all'albumina per via endovenosa (8 g/L di ascite rimossa) come richiesto con registrazione della frequenza dei prelievi.

Follow-up: 2 settimane, 4 settimane poi ogni 3 mesi per 1 anno

Definizioni importanti:

L'ascite ricorrente sarà definita come ascite che ricorre in almeno tre occasioni entro un periodo di 12 mesi nonostante la restrizione dietetica di sodio e adeguate dosi di diuretiche.

La risoluzione dell'ascite sarebbe definita come assenza di ascite clinica (ascite di grado 0 o 1) che può essere parziale. Sarebbe definita come risoluzione dell'ascite con diuretici e completa sarebbe definita come risoluzione dell'ascite senza la necessità di diuretici.

Esami diagnostici: HVPG basale con valutazione dell'emodinamica portale (emodinamica sistemica e polmonare) ed emodinamica cardiaca, cistatina C, TAC normale per la valutazione della sarcopenia. Il peso corporeo, la pressione sanguigna e l'ecocardiogramma verrebbero eseguiti per tutti i pazienti. La velocità di filtrazione glomerulare (GFR) sarà stimata utilizzando le equazioni eGFR-modifica della dieta nelle malattie renali (MDRD6) e basate sulla cistatina C (Chronic renal disease Epidemiology Collaboration). Insieme a questo, il campione di sangue arterioso sarà raccolto dopo il digiuno notturno e il riposo a letto di almeno 8 ore in posizione supina per l'attività della renina plasmatica, l'aldosterone plasmatico e la concentrazione plasmatica di norepinefrina. Un'analisi delle urine al basale con valutazione del sodio urinario verrebbe eseguita anche per tutti i pazienti arruolati. I pazienti sarebbero successivamente sottoposti a HVPG dopo 3-6 mesi e cistatina C ogni 3 mesi. Oltre a questo, la lipocalina associata alla gelatina dei neutrofili nelle urine (NGAL), l'attività della renina plasmatica e i livelli sierici di aldosterone verrebbero eseguiti al basale, a 3 e 6 mesi. Una scansione TC semplice ripetuta per valutare la sarcopenia verrebbe eseguita a 3 mesi ea 6 mesi. Il follow-up sarebbe di 1 anno o fino a TIPS o trapianto di fegato.

Valutazione immunologica correlata all'albumina:

Considerando l'immunomodulazione come un importante meccanismo d'azione dell'albumina. Ulteriori esperimenti sarebbero stati condotti al basale, 3 e 6 mesi per valutare le isoforme dell'albumina (HMA, HNA1, HNA2, IMA), i livelli di citochine pro-infiammatorie e antinfiammatorie (array di citochine basato su multiplex luminex), mediatori dell'infiammazione (C- Proteine ​​reattive, dosaggio delle endotossine, proteine ​​del complemento; DAMPS ); Frequenza e profilo funzionale delle cellule immunitarie innate (monociti, neutrofili)

Analisi delle isoforme dell'albumina:

Sostanze chimiche Il cambiamento nell'isoforma dell'albumina sarà effettuato mediante quantificazione di diverse modifiche dell'albumina (HMA, HNA1, HNA2, IMA) su un sistema HRMS orbitrap a ionizzazione a spruzzo di elettroni "(Q Exative plus) spettrometro di massa accoppiato a UHPLC da Thermoscientific USA. Brevemente il plasma isolato del sangue dei pazienti in un determinato momento (giorno 0 e tre mesi) sarà diluito con acqua distillata in un rapporto 1:4.000, quindi 8 uL di questo plasma diluito saranno iniettati nel sistema MS di ionizzazione a spruzzo di elettroni con cromatografia liquida ad alte prestazioni . La separazione per cromatografia liquida ad alte prestazioni verrà eseguita su una colonna C8 a fase inversa (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm d.i. 3 50 mm, colonna filettata da 1,8 lm con una dimensione dei pori di 300 Å) a una portata di 0,2 mL /minuto utilizzando un sistema solvente H2O-acetonitrile (con acido formico allo 0,1%) con un gradiente dal 90% di H2O al 90% di acetonitrile per un periodo di 25 minuti con acquisizione a partire da 3 minuti. In condizioni di auto-MS, verrà eseguita l'analisi spettrale di massa. Un'analisi simile verrà eseguita anche con soluzione di albumina esogena. Gli spettri MS di ionizzazione a spruzzo di elettroni ottenuti saranno analizzati utilizzando il software Protein Deconvolution soft warre (thermoscientific germany). Qui, dopo aver minimizzato il cromatogramma del picco base dal cromatogramma ionico totale, saranno ottenuti ed analizzati i cromatogrammi di massa dell'albumina. Gli spettri di albumina ottenuti saranno quindi deconvoluti entro un intervallo di massa compreso tra 66.000 e 67.000 Da (poiché il peso molecolare [MW] di varie isoforme di albumina rientra in questo intervallo. Infine, dall'intensità dei picchi, sarà misurata l'abbondanza delle isoforme dell'albumina e sarà riportata l'abbondanza relativa delle varie isoforme HSA come descritto in Das et.al 2017. Questo sarà eseguito al basale e 3 mesi. (L'acqua per spettrometria di massa (MS), l'acetonitrile e l'acido formico saranno acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L'HSA purificato è stato acquistato da Baxter (Gurgaon, India). Tutti i reagenti saranno di grado analitico.

Array di citochine Un pannello di 45 citochine, chemochine e fattori di crescita sarà analizzato nel plasma sanguigno del gruppo di pazienti al basale e 3 mesi utilizzando un sistema di analisi delle perle di citochine multiplex Bio-Plex (Bio-Rad, CA) secondo il protocollo del produttore. Il coefficiente di variazione intra-analisi e inter-analisi considerato per le analisi multiplex sarà < 5%

Profilazione delle cellule immunitarie innate:

Il sangue intero totale sarà raccolto dai pazienti prima e dopo la terapia e valutato per la frequenza% dei monociti mediante colorazione con anti-CD14 anti CD16 marcato con fluorocromo e per i neutrofili anti-CD11b anti CD16 anti-CD15, anti-CD66b e sarà acquisito e analizzato utilizzando citometria a flusso versetto FACS (bioscienze BD). Per la profilazione funzionale delle cellule immunitarie innate, il sangue sarà diviso in due parti. Le PBMC saranno isolate utilizzando ficoll-hypaque (Himedia) ei monociti saranno isolati utilizzando il kit di isolamento CD14 della miltenyi biotech secondo il protocollo di produzione. Considerando che, altra parte del sangue verrà utilizzata per isolare i neutrofili utilizzando gran-hypaque (Himedia). Le citochine intracellulari come IFN-y, TNF-a, IL-1b saranno analizzate dopo stimolazione con LPS a basse dosi. Inoltre, il burst fagocitico o la generazione di ROS verranno eseguiti utilizzando il protocollo descritto dal produttore. Anche in questo caso i dati saranno acquisiti e analizzati utilizzando FACS verse (BD biosciences).

Metodologia di analisi metabolica del cavalluccio marino:

L'effetto sul metabolismo energetico dei monociti (che guidano la proprietà funzionale delle cellule immunitarie) sarà analizzato misurando il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) attraverso lo strumento Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer nei monociti del sangue periferico dei pazienti al basale e 3 mesi come misura rispettivamente della produzione di lattato (un surrogato del tasso glicolitico) e dell'OXPHOS. In breve, i monociti saranno isolati dal sangue appena raccolto utilizzando il kit di isolamento CD14 della miltenyi biotech secondo il protocollo di produzione. I monociti isolati saranno seminati in triplicato ad una densità di 1X105 cellule per pozzetto. Prima di iniziare il saggio, le cellule saranno incubate in Seahorse Assay Medium addizionato con 10 mM di glucosio e 1 mM di piruvato di sodio e glutammina in un incubatore a 37°C senza CO2 per 45 min. Ulteriori cambiamenti nei parametri della fosforilazione ossidativa saranno calcolati da un cambiamento in tempo reale nell'OCR in risposta al trattamento con oligomicina (inibitore dell'ATPasi, 1 μM), FCCP (0,2 μM) e rotenone (0,5 μM).

Popolazione di studio:

POPOLAZIONE SOGGETTA/MODELLO PRE-CLINICO (Descrivere la popolazione soggetto compresi i criteri di inclusione/esclusione o il modello animale)

Disegno dello studio:

• Uno studio controllato randomizzato.
• Lo studio sarà condotto su pazienti ricoverati presso il Dipartimento di Epatologia da agosto 2020 ad agosto 2022 presso ILBS, Nuova Delhi
• Il gruppo di studio comprenderà pazienti con cirrosi scompensata con ascite ricorrente

Calcolo della dimensione del campione: nello studio controllato randomizzato di Singh et al (Journal of Hepatology 2012) la mortalità a 90 giorni nei pazienti con ascite ricorrente trattata con midodrina era 15/20 (75%) rispetto a 8/20 (40%) nel gruppo di trattamento medico standard (paracentesi di grande volume e infusioni di albumina). Supponendo che la sopravvivenza per l'albumina sia del 75% e con SMT sia del 40%, quindi con alfa del 5% e potenza del 90% dobbiamo iscrivere 90 casi, cioè 45 casi in ciascun gruppo. Inoltre, supponendo un tasso di abbandono del 10%, dobbiamo iscrivere 100 casi 50 per gruppo e assegnati in modo casuale con il metodo di randomizzazione a blocchi con dimensione del blocco presa come 10.

Proporzione di sopravvivenza nel gruppo di trattamento in un dato momento = 0,75 Proporzione di sopravvivenza nel gruppo di controllo in un dato momento = 0,40 Rapporto di rischio = 3,19 Potenza (%) = 90 Errore alfa (%) = 5 lati = 2 Campione richiesto Dimensione del campione per il gruppo di trattamento = 45 Dimensione del campione richiesta per il gruppo di controllo = 45 Errore alfa (%) Potenza (%) Primo gruppo Secondo gruppo 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Intervento: terapia mirata con albumina Monitoraggio e valutazione: follow-up: 2 settimane, 4 settimane, 3 mesi, poi ogni 3 mesi per 1 anno

analisi statistica

• Tutte le variabili devono essere espresse in media (sd) o mediana (range)
• Le variabili saranno confrontate con il test U di Mann-Whitney
• Per le variabili categoriali utilizzeremo il test Chi-quadrato o il test di Fisher
• L'analisi di sopravvivenza sarà effettuata utilizzando l'analisi di regressione proporzionale di Cox
• La probabilità attuariale di sopravvivenza deve essere calcolata mediante grafico di Kaplan-Meier e confrontata mediante test log-rank.
• Verrebbe eseguita un'analisi competitiva di sopravvivenza al rischio con eventi concorrenti come TIPS e trapianto di fegato Effetti avversi: reazioni allergiche all'albumina, peggioramento della dispnea, sovraccarico di volume Regola di arresto: reazione all'infusione di albumina

Problemi etici nello studio e piani per affrontare questi problemi:

Non ci sono problemi etici rispetto al protocollo di prova. L'albumina è raccomandata di routine per la gestione dei pazienti con cirrosi con ascite. In un ampio studio multicentrico è stato dimostrato che un'alta dose di albumina di 40 grammi/settimana ha migliorato gli esiti nei cirrotici con ascite non complicata. Ciò tuttavia manca di un'applicazione clinica basata sulla fattibilità di fornire dosi elevate in un paese con limitazioni di risorse come l'India. I nostri dati fornirebbero quindi un approccio mirato (escalation/de-escalation) basato sulla risposta individualizzata per ciascun paziente e il suo effetto sul miglioramento dei risultati complessivi. Il farmaco in studio verrebbe fornito gratuitamente e il costo di indagini speciali che non fanno parte dello standard di cura non sarebbe a carico dei pazienti.