Эффективность таргетной терапии альбумином, управляемой ответом, по сравнению со стандартным медикаментозным лечением в исходах рецидивирующего асцита у пациентов с декомпенсированным циррозом печени.

План исследования Цель и задачи Первичные

• Изучить эффективность таргетной терапии альбумином по сравнению со стандартным медикаментозным лечением в снижении 6-месячной смертности от рецидивирующего асцита у пациентов с декомпенсированным циррозом печени.

Второстепенные цели

• Изучить частоту лечебного парацентеза в обеих группах.
• Частота осложнений: индуцированная парацентезом дисфункция кровообращения (PICD), ОПП, гипонатриемия, бактериальные инфекции, печеночная энцефалопатия и кровотечение из варикозно расширенных вен.
• Влияние на системную гемодинамику и портальное давление
• Влияние на слабость и саркопению
• Время до разрешения асцита в обеих группах
• Изменения почечного резерва, оцениваемые с помощью последовательных уравнений на основе цистатина С для рСКФ и других биомаркеров (моча-NGAL, молекула-1 повреждения почек, белок, связывающий жирные кислоты печени (L-FABP) каждые 3 месяца)
• Побочные эффекты и частота отмены бета-блокаторов в обеих группах
• Выживаемость без трансплантации печени и TIPS в обеих группах через 6 месяцев и 1 год
• Качество жизни по оценке краткой формы опроса-36 версия (SF-36)
• Влияние терапии альбумином на иммуномодуляцию
• Влияние альбумина на 12-месячную смертность

Методология РЕЖИМ ДОЗИРОВКИ (Опишите дозирование субъекта или животного) В этом открытом рандомизированном исследовании будут участвовать последовательные пациенты с циррозом печени, отвечающие критериям включения и критериям исключения. Детали расчета размера выборки приведены в разделе статистических методов. Тяжесть заболевания печени будет оцениваться по шкале тяжести — CTP и шкале MELD.

Пациенты будут рандомизированы на 2 группы координатором клинических испытаний (ККИ). CTC будет слеп к пациенту и полученному лечению, и будет выполняться сокрытие распределения с помощью последовательно пронумерованных непрозрачных запечатанных конвертов (SNOSE). Пациенты будут оцениваться через 2 недели, 4 недели по уровням сывороточного альбумина, степени асцита и использованию диуретиков, а затем каждые 3 месяца.

Группа A- будет получать стандартное лечение (подробности, как у пациентов группы B) плюс таргетная терапия альбумином, как указано ниже:

Пациенты с сывороточным альбумином <3 г/л с рецидивирующим асцитом - будут получать 20 % альбумин по 60 г/неделю до тех пор, пока не будет достигнут целевой уровень сывороточного альбумина 3,0 г/л, после чего пациенты будут получать 40 г альбумина каждую неделю до разрешения асцита или сыворотки. альбумин >3,5 г/л. Пациенты, достигшие этой цели, будут продолжать прием 20 г в неделю до полного разрешения асцита и уровня сывороточного альбумина >3,5 г/л или максимум 6 месяцев после этого пациенты будут получать альбумин в дозе 20 г каждые 2 недели. Лечение: ограничение соли, диуретики с большим объемом парацентеза. Этим пациентам будет назначена диета с низким содержанием натрия (2 г/день) и будет назначена комбинация петлевых диуретиков (фуросемид 40-160 мг/день) и диуретика дистального действия ( спиронолактон 100-400 мг/сут) с поэтапным повышением дозы с контролем побочных эффектов. Парацентез большого объема (LVP) будет выполняться вместе с внутривенным введением альбумина (удалено 8 г/л асцита) по мере необходимости с записью частоты постукиваний.

Последующее наблюдение: 2 недели, 4 недели, затем каждые 3 месяца в течение 1 года.

Важные определения:

Рецидивирующий асцит будет определяться как асцит, который повторяется не менее трех раз в течение 12-месячного периода, несмотря на ограничение натрия в рационе и адекватные дозы диуретиков.

Разрешение асцита определяется как отсутствие клинического асцита (степень асцита 0 или 1), которое может быть либо частичным, либо определяется как разрешение асцита на фоне приема диуретиков, а полное определяется как разрешение асцита без необходимости приема диуретиков.

Исследования: исходное ГПВД с оценкой портальной (системной и легочной гемодинамики) и сердечной гемодинамики, цистатина С, обзорная КТ для оценки саркопении. Масса тела, кровяное давление и эхокардиограмма будут сделаны для всех пациентов. Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) будет оцениваться с использованием уравнений рСКФ - модификации диеты при заболеваниях почек (MDRD6) и на основе цистатина С (Сотрудничество по эпидемиологии хронического заболевания почек). Наряду с этим, образец артериальной крови будет собираться после ночного голодания и постельного режима не менее 8 часов в положении лежа на спине для определения активности ренина в плазме, концентрации альдостерона в плазме и концентрации норадреналина в плазме. Базовый анализ мочи с оценкой содержания натрия в моче также будет проводиться для всех включенных в исследование пациентов. Впоследствии через 3-6 месяцев пациенты подвергались ГПВД и цистатину С каждые 3 месяца. Кроме того, определяли липокалин, связанный с нейтрофильной желатиназой в моче (NGAL), активность ренина в плазме и уровни альдостерона в сыворотке на исходном уровне, через 3 и 6 месяцев. Повторная простая компьютерная томография для оценки саркопении будет выполнена через 3 месяца и через 6 месяцев. Последующее наблюдение будет длиться 1 год или до TIPS или трансплантации печени.

Иммунологическая оценка, связанная с альбумином:

Рассмотрение иммуномодуляции как важного механизма действия альбумина. Дополнительные эксперименты будут проводиться на исходном уровне, через 3 и 6 месяцев для оценки изоформ альбумина (HMA, HNA1, HNA2, IMA), уровней провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (массив цитокинов на основе мультиплексного люминекса), медиаторов воспаления (C- Реактивный белок, анализ эндотоксинов, комплементарные белки; DAMPS); Частота и функциональный профиль клеток врожденного иммунитета (моноциты, нейтрофилы)

Анализ изоформ альбумина:

Химические вещества Изменение изоформы альбумина будет выполнено путем количественного определения различных модификаций альбумина (HMA, HNA1, HNA2, IMA) на масс-спектрометре HRMS с ионизацией электронным распылением (Q Exative plus), соединенном с УВЭЖХ от Thermoscientific USA. Кратко об изолированной плазме крови пациентов в данный момент времени (день 0 и три месяца) будут разбавлены дистиллированной водой в соотношении 1:4000, а затем 8 мкл этой разбавленной плазмы будут введены в систему высокоэффективной жидкостной хроматографии с ионизацией электронным распылением. . Высокоэффективное жидкостное хроматографическое разделение будет выполняться на колонке C8 с обращенной фазой (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, колонка с резьбой 2,1 мм 3 50 мм, 1,8 мкм с резьбой и размером пор 300 Å) при скорости потока 0,2 мл. /минута с использованием системы растворителей H2O-ацетонитрил (с 0,1% муравьиной кислоты) при градиенте от 90% H2O до 90% ацетонитрила в течение 25 минут с началом сбора данных через 3 минуты. В условиях автоматической МС будет выполняться масс-спектральный анализ. Аналогичный анализ будет также выполнен с раствором экзогенного альбумина. Полученные спектры МС ионизации электронным распылением будут проанализированы с использованием программного обеспечения Protein Deconvolution soft warre (thermoscientific, Германия). Здесь, после минимизации хроматограммы основного пика из общей ионной хроматограммы, будут получены и проанализированы масс-хроматограммы альбумина. Затем полученные спектры альбумина деконволютируют в диапазоне масс от 66 000 до 67 000 Да (поскольку молекулярная масса [MW] различных изоформ альбумина попадает в этот диапазон. Наконец, по интенсивности пиков будет измерено количество изоформ альбумина, и будет указано относительное количество различных изоформ HSA, как описано в Das et.al 2017. Это будет выполняться на исходном уровне и через 3 месяца. ( Вода, ацетонитрил и муравьиная кислота для масс-спектрометрии (МС) будут приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Очищенный HSA был приобретен у Baxter (Гургаон, Индия). Все реагенты должны быть аналитической чистоты.

Массив цитокинов Панель из 45 цитокинов, хемокинов и факторов роста будет проанализирована в плазме крови группы пациентов на исходном уровне и через 3 месяца с использованием мультиплексной системы анализа цитокинов Bio-Plex (Bio-Rad, CA) в соответствии с протоколом производителя. Коэффициент вариации внутри и между анализами, рассматриваемый для мультиплексных анализов, будет < 5%.

Профилирование клеток врожденного иммунитета:

Общая цельная кровь будет собрана у пациентов до и после терапии и оценена в % частоте моноцитов путем окрашивания мечеными флуорохромом анти-CD14, анти-CD16 и нейтрофилами, анти-CD11b, анти-CD16, анти-CD15, анти-CD66b, и будет получена и проанализирована с использованием проточная цитометрия FACS verse (BD biosciences). Для функционального профилирования клеток врожденного иммунитета кровь будет разделена на две части. PBMC будут выделять с использованием фиколла-гипака (Himedia), а моноциты будут выделять с использованием набора для выделения CD14 от miltenyi biotech в соответствии с производственным протоколом. Принимая во внимание, что другая часть крови будет использоваться для выделения нейтрофилов с использованием gran-hypaque (Himedia). Внутриклеточные цитокины, такие как IFN-y, TNF-a, IL-1b, будут проанализированы после стимуляции низкой дозой ЛПС. Кроме того, фагоцитарный взрыв или генерация АФК будут выполняться с использованием протокола, описанного производителем. Опять же, данные будут получены и проанализированы с использованием FACS verse (BD biosciences).

Методология метаболического анализа морского конька:

Влияние на энергетический метаболизм моноцитов (которые определяют функциональные свойства иммунных клеток) мы анализировали путем измерения скорости внеклеточного закисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) с помощью анализатора внеклеточного потока Seahorse XF24 в моноцитах периферической крови пациентов на исходном уровне. и 3 месяца как показатель продукции лактата (заменитель скорости гликолиза) и OXPHOS соответственно. Вкратце, моноциты будут выделены из свежесобранной крови с использованием набора для выделения CD14 от miltenyi biotech в соответствии с производственным протоколом. Изолированные моноциты высевают в трех повторностях с плотностью 1×105 клеток на лунку. Перед началом анализа клетки инкубируют в среде для анализа морского конька с добавлением 10 мМ глюкозы и 1 мМ пирувата натрия и глутамина в инкубаторе при 37°C без CO2 в течение 45 минут. Дальнейшее изменение параметров окислительного фосфорилирования будет рассчитываться по изменению OCR в реальном времени в ответ на лечение олигомицином (ингибитором АТФазы, 1 мкМ), FCCP (0,2 мкМ) и ротеноном (0,5 мкМ).

Исследуемая популяция:

ИСПЫТУЕМАЯ ПОПУЛЯЦИЯ/ДОКЛИНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ (Опишите исследуемую популяцию, включая критерии включения/исключения или животную модель)

Дизайн исследования:

• Рандомизированное контролируемое исследование.
• Исследование будет проводиться на пациентах, поступивших в отделение гепатологии с августа 2020 года по август 2022 года в ILBS, Нью-Дели.
• В группу исследования войдут пациенты с декомпенсированным циррозом печени с рецидивирующим асцитом.

Расчет размера выборки: в рандомизированном контролируемом исследовании Singh et al (Journal of Hepatology 2012) 90-дневная смертность у пациентов с рецидивирующим асцитом, получавших мидодрин, составила 15/20 (75%) по сравнению с 8/20 (40%) в группа стандартного медикаментозного лечения (большой объем парацентеза и инфузии альбумина). Предполагая, что выживаемость для альбумина составляет 75%, а для SMT - 40%, тогда при альфа 5% и мощности 90% нам нужно зарегистрировать 90 случаев, т.е. 45 случаев в каждой группе. Кроме того, предполагая, что показатель отсева составляет 10%, нам необходимо зарегистрировать 100 случаев, по 50 в каждой группе, и случайным образом распределить их методом блочной рандомизации, при этом размер блока принимается равным 10.

Доля выживаемости в группе лечения в данный момент времени = 0,75 Доля выживаемости в контрольной группе в данный момент времени = 0,40 Отношение рисков = 3,19 Мощность (%) = 90 Альфа-ошибка (%) = 5 сторон = 2 Требуемый образец размер экспериментальной группы = 45 Требуемый размер выборки для контрольной группы = 45 Альфа-ошибка (%) Мощность (%) Первая группа Вторая группа 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Вмешательство: Целевая альбуминовая терапия Мониторинг и оценка: Последующее наблюдение: 2 недели, 4 недели, 3 месяца, затем каждые 3 месяца в течение 1 года

статистический анализ

• Все переменные должны быть выражены в среднем (sd) или медиане (диапазон).
• Переменные будут сравниваться с помощью U-критерия Манна-Уитни.
• Для категориальных переменных мы будем использовать критерий хи-квадрат или критерий Фишера.
• Анализ выживаемости будет выполнен с использованием пропорционального регрессионного анализа Кокса.
• Актуарная вероятность выживания рассчитывается по графику Каплана-Мейера и сравнивается с помощью логарифмического рангового критерия.
• Будет проведен анализ выживаемости с конкурирующим риском с конкурирующими событиями, такими как TIPS и трансплантация печени. Побочные эффекты: аллергические реакции на альбумин, усиление одышки, объемная перегрузка Правило остановки: реакция на инфузию альбумина

Этические проблемы в исследовании и планы по решению этих проблем:

Нет никаких этических проблем в отношении протокола исследования. Альбумин обычно рекомендуется для лечения пациентов с циррозом печени с асцитом. В крупном многоцентровом исследовании было показано, что высокие дозы альбумина 40 г/нед улучшают исходы при циррозе печени с неосложненным асцитом. Однако этому не хватает клинического применения, основанного на возможности обеспечения высоких доз в стране с ограниченными ресурсами, такой как Индия. Таким образом, наши данные обеспечат целенаправленный подход (эскалация/деэскалация), основанный на реакции, индивидуальной для каждого пациента, и ее влиянии на улучшение общих результатов. Исследуемый препарат будет предоставляться бесплатно, а расходы на специальные исследования, не входящие в стандарт лечения, не будут нести пациенты.