Wirksamkeit einer zielgerichteten und reaktionsgesteuerten Albumintherapie im Vergleich zu einer medizinischen Standardbehandlung bei den Folgen von rezidivierendem Aszites bei Patienten mit dekompensierter Zirrhose.

Studiendesign Zweck und Ziele Primär

• Untersuchung der Wirksamkeit einer zielgerichteten Albumintherapie im Vergleich zur medizinischen Standardbehandlung bei der Verringerung der 6-Monats-Sterblichkeit bei rezidivierendem Aszites bei Patienten mit dekompensierter Zirrhose

Sekundäre Ziele

• Untersuchung der Häufigkeit der therapeutischen Parazentese in beiden Gruppen
• Auftreten von Komplikationen: Parazentese-induzierte Kreislaufstörung (PICD), AKI, Hyponatriämie, bakterielle Infektionen, hepatische Enzephalopathie und Varizenblutung
• Auswirkungen auf die systemische Hämodynamik und den Portaldruck
• Auswirkungen auf Gebrechlichkeit und Sarkopenie
• Zeit bis zur Auflösung des Aszites in beiden Gruppen
• Veränderungen der Nierenreserve, bewertet durch aufeinanderfolgende Cystatin-C-basierte Gleichungen für eGFR und andere Biomarker (Urin-NGAL, Nierenverletzungsmolekül-1, Leberfettsäure-bindendes Protein (L-FABP) alle 3 Monate)
• Nebenwirkungen und Abbruchraten von Betablockern in beiden Gruppen
• Überleben ohne Lebertransplantation und TIPS in beiden Gruppen nach 6 Monaten und 1 Jahr
• Lebensqualität, bewertet durch Kurzformumfrage-36-Version (SF-36)
• Wirkung der Albumintherapie auf die Immunmodulation
• Wirkung von Albumin auf die 12-Monats-Sterblichkeit

Methodik DOSIERUNGSREGELUNG (Beschreiben Sie die Patienten- oder Tierdosis) In diese offene, randomisierte Studie werden aufeinanderfolgende Patienten mit Zirrhose, die die Einschluss- und Ausschlusskriterien erfüllen, in die Studie aufgenommen. Einzelheiten zur Berechnung des Stichprobenumfangs finden sich im Abschnitt über statistische Methoden. Der Schweregrad der Lebererkrankung wird anhand der Schweregrade bewertet – CTP- und MELD-Score.

Die Patienten werden vom Clinical Trial Coordinator (CTC) in 2 Gruppen randomisiert. Das CTC ist für den Patienten und die erhaltene Behandlung blind, und die Zuordnungsverbergung durch die Technik der sequenziell nummerierten undurchsichtigen versiegelten Umschläge (SNOSE) würde erfolgen. Die Patienten würden nach 2 Wochen, 4 Wochen mit Serumalbuminspiegeln, Aszitesgrad und Verwendung von Diuretika und dann alle 3 Monate beurteilt

Gruppe A – würde eine medizinische Standardbehandlung erhalten (Einzelheiten wie bei Patienten für Gruppe B) plus eine gezielte Albumintherapie würde wie folgt gegeben:

Patienten mit Serumalbumin < 3 g/l mit rezidivierendem Aszites – erhalten 20 % Albumin mit 60 g/Woche, bis der Zielserumalbuminwert von 3,0 g/l erreicht ist, danach erhalten die Patienten jede Woche 40 g Albumin bis zur Auflösung des Aszites oder Serum Albumin > 3,5 g/L. Patienten, die dieses Ziel erreichen, werden mit 20 g/Woche fortfahren, bis der Patient eine vollständige Auflösung von Aszites und Serumalbumin > 3,5 g/l erreicht hat, oder maximal 6 Monate danach erhalten die Patienten 20 g Albumin einmal alle 2 Wochen. Gruppe B: Standardmedizinisch Behandlung – Salzrestriktion, Diuretika mit großvolumiger Parazentese Diese Patienten erhalten eine natriumarme Diät (2 g/Tag) und erhalten eine Kombination aus einem Schleifendiuretikum (Furosemid 40–160 mg/Tag) und einem distal wirkenden Diuretikum ( Spironolacton 100–400 mg/Tag) mit Dosiseskalation um jeweils eine Stufe mit Überwachung auf Nebenwirkungen. Eine großvolumige Parazentese (LVP) wird nach Bedarf zusammen mit intravenösem Albumin (8 g/l Aszites entfernt) durchgeführt, wobei die Häufigkeit der Punktionen aufgezeichnet wird.

Follow-up: 2 Wochen, 4 Wochen, dann alle 3 Monate für 1 Jahr

Wichtige Definitionen:

Rezidivierender Aszites wird als Aszites definiert, der innerhalb von 12 Monaten trotz diätetischer Natriumeinschränkung und angemessener diuretischer Dosen mindestens dreimal wieder auftritt.

Aszites-Rückgang wäre definiert als das Fehlen von klinischem Aszites (Aszites Grad 0 oder 1), der entweder partiell sein kann oder als Rückzug von Aszites unter Diuretika definiert wäre, und vollständig wäre als Rückzug von Aszites ohne die Notwendigkeit von Diuretika definiert.

Untersuchungen: Baseline-HVPG mit Beurteilung der portalen (systemischen und pulmonalen Hämodynamik) und kardialen Hämodynamik, Cystatin C, einfacher CT-Scan zur Beurteilung der Sarkopenie. Körpergewicht, Blutdruck und Echokardiogramm würden für alle Patienten durchgeführt werden. Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) wird unter Verwendung von eGFR-Gleichungen – Modifikation der Ernährung bei Nierenerkrankungen (MDRD6) und Cystatin C-basiert (Chronic kidney disease Epidemiology Collaboration) geschätzt. Gleichzeitig wird eine arterielle Blutprobe nach Fasten über Nacht und Bettruhe von mindestens 8 Stunden in Rückenlage für die Plasma-Renin-Aktivität, Plasma-Aldosteron- und Plasma-Norepinephrin-Konzentration entnommen. Eine Grundlinien-Urinanalyse mit Bestimmung des Urinnatriums würde auch für alle aufgenommenen Patienten durchgeführt werden. Die Patienten würden anschließend nach 3-6 Monaten einer HVPG und alle 3 Monate Cystatin C unterzogen. Abgesehen davon würden Urin-Neutrophilen-Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL), Plasma-Renin-Aktivität und Serum-Aldosteronspiegel zu Studienbeginn, nach 3 und 6 Monaten bestimmt. Ein erneuter einfacher CT-Scan zur Beurteilung der Sarkopenie würde nach 3 Monaten und nach 6 Monaten durchgeführt. Die Nachsorge würde 1 Jahr oder bis TIPS oder Lebertransplantation dauern.

Albuminbezogene immunologische Bewertung:

Berücksichtigung der Immunmodulation als wichtiger Wirkungsmechanismus von Albumin. Zusätzliche Experimente würden zu Studienbeginn, nach 3 und 6 Monaten durchgeführt, um die Albumin-Isoformen (HMA, HNA1, HNA2, IMA), die Spiegel entzündungsfördernder und entzündungshemmender Zytokine (Multiplex-Luminex-basiertes Zytokin-Array), Entzündungsmediatoren (C- Reaktives Protein, Endotoxin-Assay, Komplementproteine; DAMPS); Häufigkeit und Funktionsprofil angeborener Immunzellen (Monozyten, Neutrophile)

Albumin-Isoformen-Analyse:

Chemikalien Die Änderung der Albumin-Isoform erfolgt durch Quantifizierung verschiedener Albumin-Modifikationen (HMA, HNA1, HNA2, IMA) auf einem Elektronenspray-Ionisations-Orbitrap-HRMS-System "(Q Exative plus)-Massenspektrometer, das mit UHPLC von Thermoscientific USA gekoppelt ist. Kurz das isolierte Plasma des Patientenbluts zu einem bestimmten Zeitpunkt (Tag 0 und drei Monate) werden mit destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 1:4.000 verdünnt, und dann werden 8 ul dieses verdünnten Plasmas in das Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Elektronenspray-Ionisations-MS-System injiziert . Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Trennung wird auf einer Umkehrphasen-C8-Säule (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm ID 3,50 mm, 1,8-lm-Gewindesäule mit einer Porengröße von 300 Å) bei einer Flussrate von 0,2 ml durchgeführt /Minute unter Verwendung eines H2O-Acetonitril-Lösungsmittelsystems (mit 0,1 % Ameisensäure) unter einem Gradienten von 90 % H2O bis 90 % Acetonitril über einen Zeitraum von 25 Minuten, wobei die Erfassung bei 3 Minuten beginnt. Unter Auto-MS-Bedingungen wird eine Massenspektralanalyse durchgeführt. Eine ähnliche Analyse wird auch mit exogener Albuminlösung durchgeführt. Die erhaltenen zusammengesetzten Elektronenspray-Ionisations-MS-Spektren werden mit der Software Protein Deconvolution soft warre (thermoscience germany) analysiert. Hier werden nach Minimierung des Basispeak-Chromatogramms aus dem Gesamtionenchromatogramm Albumin-Massenchromatogramme erhalten und analysiert. Die erhaltenen Albumin-Spektren werden dann innerhalb des Massenbereichs von 66.000–67.000 Da entfaltet (da das Molekulargewicht [MW] verschiedener Albumin-Isoformen in diesen Bereich fällt. Schließlich wird anhand der Intensität der Peaks die Häufigkeit der Albumin-Isoformen gemessen und die relative Häufigkeit der verschiedenen HSA-Isoformen wird angegeben, wie in Das et.al. 2017 beschrieben. Dies wird zu Studienbeginn und nach 3 Monaten durchgeführt. (Massenspektrometrie(MS)-Qualitätswasser, Acetonitril und Ameisensäure werden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen). Gereinigtes HSA wurde von Baxter (Gurgaon, Indien) gekauft. Alle Reagenzien sind analysenrein.

Zytokin-Array Ein Panel von 45 Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren wird im Blutplasma der Patientengruppe zu Beginn und nach 3 Monaten mit einem Bio-Plex-Multiplex-Zytokin-Bead-Assay-System (Bio-Rad, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers analysiert. Der für Multiplex-Assays berücksichtigte Intra-Assay- und Inter-Assay-Variationskoeffizient beträgt < 5 %

Profilierung angeborener Immunzellen:

Das gesamte Vollblut wird von Patienten vor und nach der Therapie entnommen und auf die prozentuale Häufigkeit von Monozyten durch Färbung mit Fluorochrom-markiertem Anti-CD14, Anti-CD16 und auf Neutrophile, Anti-CD11b, Anti-CD16, Anti-CD15, Anti-CD66b, untersucht und unter Verwendung gewonnen und analysiert Durchflusszytometrie FACS Vers (BD Biosciences). Für das funktionelle Profiling angeborener Immunzellen wird das Blut in zwei Teile geteilt. Die PBMCs werden unter Verwendung von Ficoll-Hypaque (Himedia) isoliert und Monozyten werden unter Verwendung des CD14-Isolierungskits von Miltenyi Biotech gemäß dem Herstellungsprotokoll isoliert. Wohingegen ein anderer Teil des Blutes verwendet wird, um die Neutrophilen unter Verwendung von Gran-Hypaque (Himedia) zu isolieren. Die intrazellulären Zytokine wie IFN-y, TNF-a, IL-1b werden nach einer niedrigen LPS-Stimulation analysiert. Außerdem wird die phagozytische Burst- oder ROS-Erzeugung unter Verwendung des vom Hersteller beschriebenen Protokolls durchgeführt. Auch hier werden die Daten unter Verwendung von FACS-Versen (BD Biosciences) erfasst und analysiert.

Methodik der Seepferdchen-Stoffwechselanalyse:

Die Wirkung auf den Energiestoffwechsel von Monozyten (die die funktionellen Eigenschaften von Immunzellen lenken) wird analysiert, indem wir die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) mit dem Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer-Instrument in peripheren Blutmonozyten von Patienten zu Studienbeginn messen und 3 Monate als Maß für die Laktatproduktion (ein Ersatz für die Glykolyserate) bzw. OXPHOS. Kurz gesagt, Monozyten werden aus frisch entnommenem Blut unter Verwendung des CD14-Isolierungskits von Miltenyi Biotech gemäß dem Herstellungsprotokoll isoliert. Isolierte Monozyten werden in dreifacher Ausfertigung mit einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Vor Beginn des Tests werden die Zellen in Seepferdchen-Testmedium, ergänzt mit 10 mM Glucose und 1 mM Natriumpyruvat und Glutamin, in einem 37°C-Inkubator ohne CO2 für 45 Minuten inkubiert. Eine weitere Änderung der Parameter der oxidativen Phosphorylierung wird durch eine Echtzeitänderung der OCR als Reaktion auf die Behandlung mit Oligomycin (ATPase-Inhibitor, 1 μM), FCCP (0,2 μM) und Rotenon (0,5 μM) berechnet.

Studienpopulation:

PROJEKTPOPULATION/PRÄKLINISCHES MODELL (Beschreiben Sie die Probandenpopulation einschließlich Einschluss-/Ausschlusskriterien oder Tiermodell)

Studiendesign:

• Eine randomisierte kontrollierte Studie.
• Die Studie wird an Patienten durchgeführt, die von August 2020 bis August 2022 in der Abteilung für Hepatologie am ILBS, Neu-Delhi, aufgenommen wurden
• Die Studiengruppe wird aus Patienten mit dekompensierter Zirrhose mit rezidivierendem Aszites bestehen

Berechnung der Stichprobengröße: In der randomisierten kontrollierten Studie von Singh et al. (Journal of Hepatology 2012) betrug die 90-Tage-Sterblichkeit bei Patienten mit rezidivierendem Aszites unter Midodrin 15/20 (75 %) gegenüber 8/20 (40 %). medizinische Standardbehandlungsgruppe (großvolumige Parazentese und Albumininfusionen). Unter der Annahme, dass das Überleben für Albumin 75 % und für SMT 40 % beträgt, müssen wir bei einem Alpha von 5 % und einer Power von 90 % 90 Fälle aufnehmen, d. h. 45 Fälle in jeder Gruppe. Unter der Annahme einer Drop-out-Rate von 10 % müssen wir 100 Fälle, 50 jede Gruppe, einschreiben und nach dem Zufallsprinzip mit einer Block-Randomisierungsmethode mit einer Blockgröße von 10 zuordnen.

Überlebensanteil in der Behandlungsgruppe zu einem bestimmten Zeitpunkt = 0,75 Überlebensanteil in der Kontrollgruppe zu einem bestimmten Zeitpunkt = 0,40 Hazard Ratio = 3,19 Power (%) = 90 Alpha-Fehler (%) = 5-seitig = 2 Erforderliche Probe Größe für Behandlungsgruppe = 45 Erforderliche Stichprobengröße für Kontrollgruppe = 45 Alpha-Fehler (%) Leistung (%) Erste Gruppe Zweite Gruppe 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Intervention: Gezielte Albumintherapie Überwachung und Bewertung: Nachsorge: 2 Wochen, 4 Wochen, 3 Monate, dann alle 3 Monate für 1 Jahr

statistische Analyse

• Alle Variablen sind als Mittelwert (SD) oder Median (Bereich) anzugeben.
• Die Variablen werden mit dem Mann-Whitney-U-Test verglichen
• Für kategoriale Variablen verwenden wir den Chi-Quadrat- oder Fisher-Test
• Die Überlebensanalyse wird unter Verwendung einer Cox-proportionalen Regressionsanalyse durchgeführt
• Die versicherungsmathematische Überlebenswahrscheinlichkeit wird mit dem Kaplan-Meier-Diagramm berechnet und mit dem Logrank-Test verglichen.
• Es würde eine konkurrierende Risikoüberlebensanalyse mit konkurrierenden Ereignissen wie TIPS und Lebertransplantation durchgeführt. Nebenwirkungen: Allergische Reaktionen auf Albumin, Verschlechterung der Dyspnoe, Volumenüberlastung. Stoppregel: Reaktion auf Albumininfusion

Ethische Probleme in der Studie und Pläne, diese Probleme anzugehen:

Es gibt keine ethischen Bedenken in Bezug auf das Studienprotokoll. Albumin wird routinemäßig für die Behandlung von Patienten mit Zirrhose mit Aszites empfohlen. In einer großen multizentrischen Studie wurde gezeigt, dass eine hohe Albumindosis von 40 Gramm/Woche die Ergebnisse bei Zirrhotikern mit unkompliziertem Aszites verbesserte. Dem fehlt jedoch die klinische Anwendung auf der Grundlage der Machbarkeit, hohe Dosen in einem Land mit begrenzten Ressourcen wie Indien bereitzustellen. Unsere Daten würden daher einen zielgerichteten Ansatz (Eskalation/Deeskalation) auf der Grundlage der für jeden Patienten individualisierten Reaktion und ihrer Auswirkung auf die Verbesserung der Gesamtergebnisse bieten. Das Studienmedikament würde kostenlos zur Verfügung gestellt und die Kosten für spezielle Untersuchungen, die nicht zum Behandlungsstandard gehören, würden nicht von den Patienten getragen.