A célzott és válaszvezérelt albuminterápia hatékonysága a szokásos orvosi kezeléssel szemben a dekompenzált cirrhosisban szenvedő betegek visszatérő ascitesének kimenetelében.

A tanulmánytervezés elsődleges célja és célkitűzései

• A célzott albuminterápia hatékonyságának tanulmányozása a standard orvosi kezeléssel szemben a 6 hónapos mortalitás csökkentésében visszatérő ascitesben dekompenzált cirrhosisban szenvedő betegeknél.

Másodlagos célok

• A terápiás paracentézis gyakoriságának vizsgálata mindkét csoportban
• Szövődmények előfordulása: paracentesis által kiváltott keringési zavar (PICD), AKI, hyponatraemia, bakteriális fertőzések, hepatikus encephalopathia és varicealis vérzés
• Hatás a szisztémás hemodinamikára és a portális nyomásra
• A törékenységre és a szarkopéniára gyakorolt ​​hatás
• Az ascites feloldódásának ideje mindkét csoportban
• A vese tartalék változásai az eGFR és más biomarkerek (vizelet-NGAL, vesekárosodás molekula-1, máj-zsírsavkötő fehérje (L-FABP) 3 havonta) szekvenciális cisztatin C-alapú egyenleteivel értékelve
• A béta-blokkolók mellékhatásai és abbahagyási aránya mindkét csoportban
• Májtranszplantáció és TIPS-mentes túlélés mindkét csoportban 6 hónapos és 1 éves korban
• Az életminőség a felmérés 36-os változata (SF-36) alapján értékelve
• Az albuminterápia hatása az immunmodulációra
• Az albumin hatása a 12 hónapos mortalitásra

Módszertan ADAGOLÁSI RENDSZER (Írja le az alany vagy az állat adagolását) Ebben a nyílt elrendezésű, randomizált vizsgálatban egymást követő cirrhoticus betegeket vonnak be a vizsgálatba, akik megfelelnek a felvételi és kizárási kritériumoknak. A mintanagyság számításának részletei a Statisztikai módszerek fejezetben találhatók. A májbetegség súlyosságát a súlyossági pontszámok – CTP és MELD pontszámok – alapján értékelik.

A betegeket a klinikai vizsgálati koordinátor (CTC) véletlenszerűen 2 csoportba osztja. A CTC nem látja a pácienst és a kapott kezelést, és a hozzárendelés elrejtése a szekvenciálisan számozott, átlátszatlan lezárt borítékok (SNOSE) technikával történik. A betegeket 2 héttel, 4 héttel szérumalbuminszinttel, ascites fokozattal és diuretikumok alkalmazásával, majd 3 havonta értékelik.

A csoport – szokásos orvosi kezelésben részesül (részletek, mint a B csoport betegeinél), valamint a célzott albumin terápiát az alábbiak szerint kapják:

3 g/l-nél kisebb szérumalbumint szenvedő, visszatérő ascitesben szenvedő betegek - 20% albumint kapnak 60 gramm/hét adagban, amíg el nem érik a 3,0 g/l-es szérumalbumint, miután a betegek hetente 40 gramm albumint kapnak az ascites megszűnéséig vagy a szérumig. albumin >3,5 g/l. Azok a betegek, akik elérik ezt a célt, 20 g/hét adaggal folytatják az ascites és a szérum albumin 3,5 g/l feletti teljes megszűnéséig, vagy legfeljebb 6 hónapig ezt követően a betegek 20 g albumint kapnak 2 hetente egyszer. B csoport: Standard Medical Kezelés - Só-megszorítás, diuretikumok nagy térfogatú paracentézissel Ezek a betegek alacsony nátriumtartalmú diétát (2 g/nap) kapnak, és kacs-diuretikum (40-160 mg/nap furoszemid) és egy távoli hatású diuretikum kombinációját kapják. spironolakton 100-400 mg/nap) adagonkénti emeléssel, a mellékhatások monitorozásával. A nagy volumenű paracentézist (LVP) intravénás albuminnal együtt (8 g/l ascites eltávolítása) végezzük, szükség szerint, rögzítve az érintések gyakoriságát.

Nyomon követés: 2 hét, 4 hét, majd 3 havonta 1 évig

Fontos meghatározások:

Kiújuló ascitesnek minősül az aszcites, amely 12 hónapon belül legalább három alkalommal megismétlődik az étrendi nátrium korlátozás és a megfelelő vízhajtó dózisok ellenére.

Az ascites feloldódása a klinikai ascites (0. vagy 1. fokozatú) hiányaként definiálható, amely lehet részleges is. Az ascites vizelethajtó hatására bekövetkező megszűnéseként, a teljes pedig az ascites vizelethajtó alkalmazása nélkül történő megszűnéseként lenne meghatározva.

Vizsgálatok: Kiindulási HVPG a portális (szisztémás és pulmonális hemodinamika) és a szív hemodinamikai vizsgálatával, cisztatin C, sima CT vizsgálat a szarkopénia értékelésére. Minden betegnél testtömeg-, vérnyomás- és echokardiogramot készítenek. A glomeruláris filtrációs rátát (GFR) az eGFR egyenletek – a diéta módosítása vesebetegségben (MDRD6) és a cisztatin C alapú (krónikus vesebetegség epidemiológiai együttműködése) segítségével – becsülik meg. Ezzel párhuzamosan egy éjszakai koplalás és legalább 8 órás fekvőtámasz után artériás vérmintát veszünk a plazma renin aktivitása, a plazma aldoszteron és a plazma noradrenalin koncentrációja szempontjából. A vizelet nátriumszintjének felmérésével együtt minden beiratkozott betegnél kiindulási vizeletvizsgálatot is végeznek. A betegek ezt követően 3-6 hónap elteltével HVPG-t, majd 3 havonta cisztatin C-t kapnak. Ettől eltekintve, a vizelet neutrofil-zselatinázzal asszociált lipokalint (NGAL), a plazma renin aktivitást és a szérum aldoszteronszintet a kiinduláskor, 3 és 6 hónapos korban kell elvégezni. A szarkopénia értékelésére ismételt sima CT-vizsgálatot végeznek 3 és 6 hónapos korban. Az utánkövetés 1 évig tart, vagy a TIPS-ig vagy a májátültetésig.

Albuminnal kapcsolatos immunológiai értékelés:

Az immunmodulációt tekintve az albumin fontos hatásmechanizmusának. A kiinduláskor, 3 és 6 hónap múlva további kísérleteket végeznek az albumin izoformáinak (HMA, HNA1, HNA2, IMA), a pro-inflammatorikus és gyulladásgátló citokinek szintjének (multiplex luminex alapú citokintömb), a gyulladásos mediátorok (C- Reaktív fehérje, endotoxin vizsgálat, kompliment fehérjék; DAMPS ); A veleszületett immunsejtek (monociták, neutrofilek) gyakorisága és funkcionális profilja

Albumin izoformák elemzése:

Vegyszerek Az albumin izoformájának változását a különböző albuminmódosítások (HMA, HNA1, HNA2, IMA) mennyiségi meghatározásával kell elvégezni egy elektronpermet ionizációs orbitrap HRMS rendszeren "(Q Exative plus) tömegspektrométer, amely UHPLC-hez van kapcsolva a Thermoscientific USA-tól. Röviden az izolált plazmáról A betegek vérét adott időpontban (0. nap és három hónap) desztillált vízzel hígítják 1:4000 arányban, majd ebből a hígított plazmából 8 ul-t injektálnak a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás-elektronpermet ionizációs MS rendszerbe. . A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás elválasztást fordított fázisú C8 oszlopon (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm id 3 50 mm, 1,8 lm menetes oszlop, 300 Å pórusmérettel) hajtjuk végre 0,2 ml áramlási sebességgel /perc H2O-acetonitril (0,1% hangyasavat tartalmazó) oldószerrendszerrel 90% H2O-90% acetonitril gradiens mellett 25 perc alatt, a felvétel 3 perctől kezdve. Auto-MS körülmények között tömegspektrum analízist végeznek. Hasonló elemzést végeznek exogén albumin oldattal is. A kapott vegyület elektronpermet ionizációs MS spektrumát a Protein Deconvolution soft warre (termotudományos németország) szoftverrel elemezzük. Itt, miután az alapcsúcs kromatogramot minimalizálták a teljes ionkromatogramból, albumin tömegkromatogramokat kell nyerni és elemezni. A kapott albumin spektrumot ezután a 66 000-67 000 Da tömegtartományon belül dekonvolúcióval végzik (mivel a különböző albumin izoformák molekulatömege [MW] ebbe a tartományba esik. Végül a csúcsok intenzitásából mérjük az albumin izoformák abundanciáját, és a különböző HSA izoformák relatív abundanciáját jelentik Das et.al 2017-ben leírtak szerint. Ezt az alaphelyzetben és 3 hónap múlva hajtják végre. (Tömegspektrometriás (MS) minőségű vizet, acetonitrilt és hangyasavat a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO) vásárolunk. A tisztított HSA-t a Baxtertől (Gurgaon, India) vásároltuk. Minden reagens analitikai minőségű legyen.

Citokin tömb Egy 45 citokinből, kemokinből és növekedési faktorból álló panelt elemeznek a betegcsoport vérplazmájában a kiinduláskor és 3 hónap múlva Bio-Plex multiplex citokingyöngy vizsgálati rendszerrel (Bio-Rad, CA) a gyártó protokollja szerint. A multiplex vizsgálatoknál figyelembe vett intra-assay és assay közötti variációs együttható <5% lesz

Veleszületett immunsejtek profilalkotása:

A teljes teljes vért a terápia előtt és után gyűjtik a betegektől, és kiértékelik a monociták százalékos gyakoriságát fluorokrómmal jelölt anti-CD14 anti-CD16 és neutrofilek anti-CD11b anti-CD16 anti-CD15, anti-CD66b festéssel, majd kinyerik és kiértékelik. áramlási citometria FACS vers (BD biosciences). A veleszületett immunsejtek funkcionális profilálásához a vért két részre osztják. A PBMC-ket ficoll-hypaque (Himedia) segítségével izoláljuk, a monocitákat pedig a miltenyi biotech cég CD14 izolációs készletével izoláljuk a gyártási protokoll szerint. Míg a vér másik részét a neutrofilek gran-hypaque (Himedia) alkalmazásával izolálják. Az intracelluláris citokineket, például az IFN-y-t, a TNF-a-t, az IL-1b-t alacsony dózisú LPS-stimuláció után elemzik. Ezenkívül a fagocita burst vagy ROS generálás a gyártó által leírt protokoll szerint történik. Az adatokat ismét a FACS vers (BD biosciences) segítségével gyűjtjük és elemezzük.

Csikóhal metabolikus elemzési módszertana:

A monociták energiaanyagcseréjére gyakorolt ​​hatást (amelyek az immunsejtek funkcionális tulajdonságait irányítják) az extracelluláris savasodási sebesség (ECAR) és az oxigénfogyasztási ráta (OCR) mérésével elemezzük a Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer műszerrel a betegek perifériás vér monocitáiban a kiinduláskor. és 3 hónap a laktáttermelés (a glikolitikus sebesség helyettesítője) és az OXPHOS mértéke. Röviden, a monocitákat a frissen gyűjtött vérből izoláljuk a miltenyi biotech CD14 izolációs készletével a gyártási protokoll szerint. Az izolált monocitákat három párhuzamosban oltjuk be lyukanként 1 x 105 sejt sűrűséggel. A vizsgálat megkezdése előtt a sejteket 10 mM glükózzal és 1 mM nátrium-piruváttal és glutaminnal kiegészített Seahorse Assay Mediumban inkubáljuk 37°C-os inkubátorban CO2 nélkül 45 percig. Az oxidatív foszforiláció paramétereinek további változását az OCR valós idejű változása számítja ki az oligomicinnel (ATPáz inhibitor, 1 μM), FCCP-vel (0,2 μM) és a rotenonnal (0,5 μM) végzett kezelés hatására.

Tanulmányi népesség:

AZ alanypopuláció/PREKLINIKAI MODELL (Írja le az alany populációját, beleértve a befogadási/kizárási kritériumokat vagy az állatmodellt)

Dizájnt tanulni:

• Véletlenszerű, kontrollált vizsgálat.
• A vizsgálatot az újdelhi-i ILBS Hepatológiai Osztályára 2020 augusztusa és 2022 augusztusa között felvett betegeken végzik el.
• A vizsgálati csoport dekompenzált cirrhosisban szenvedő, visszatérő ascitesben szenvedő betegekből áll

A minta méretének kiszámítása: Singh és munkatársai (Journal of Hepatology 2012) randomizált, kontrollált vizsgálatában a visszatérő ascitesben szenvedő betegek 90 napos mortalitása midodrinnal 15/20 (75%) volt, szemben a 8/20 (40%). standard orvosi kezelési csoport (nagy volumenű paracentézis és albumin infúziók). Feltételezve, hogy az albumin túlélése 75%, SMT esetén pedig 40%, akkor 5% alfa és 90% teljesítmény esetén 90 esetet, azaz 45 esetet kell bejegyeznünk minden csoportba. Továbbá 10%-os lemorzsolódást feltételezve csoportonként 100 esetet, 50-et kell beíratnunk, véletlenszerűen elosztva blokk randomizációs módszerrel, 10 blokkmérettel.

A túlélés aránya a kezelt csoportban egy adott időpontban = 0,75 A túlélés aránya a kontrollcsoportban egy adott időpontban = 0,40 Veszélyességi arány = 3,19 Teljesítmény (%) = 90 Alfa hiba (%) = 5 oldalas = 2 Szükséges minta mérete a kezelt csoporthoz = 45 Szükséges mintanagyság a kontrollcsoporthoz = 45 Alfa hiba (%) Teljesítmény (%) Első csoport Második csoport 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Beavatkozás: Célzott albumin terápia Monitoring és értékelés: Nyomon követés: 2 hét, 4 hét, 3 hónap, majd 3 havonta 1 évig

Statisztikai analízis

• Minden változót átlagban (sd) vagy mediánban (tartomány) kell kifejezni.
• A változókat Mann-Whitney U teszttel hasonlítjuk össze
• A kategorikus változókhoz a Chi-négyzet vagy a Fisher-tesztet használjuk
• A túlélési elemzés Cox-arányos regressziós analízissel történik
• A túlélés biztosításmatematikai valószínűségét Kaplan-Meier-gráf segítségével kell kiszámítani, és logrank teszttel kell összehasonlítani.
• Versengő kockázati túlélési elemzést a versengő eseményekkel, mint például a TIPS és a májtranszplantáció. Mellékhatások: Allergiás reakciók albuminra, nehézlégzés súlyosbodása, térfogat-túlterhelés Leállítási szabály: Reakció albumin infúzióra

A tanulmány etikai kérdései és a problémák megoldásának tervei:

Nincsenek etikai kérdések a vizsgálati protokoll tekintetében. Az albumin rutinszerűen ajánlott asciteses cirrhosisban szenvedő betegek kezelésére. Egy nagy, multicentrikus vizsgálatban kimutatták, hogy az albumin nagy dózisa, heti 40 gramm, javította a szövődménymentes aszcitesszel járó cirrhoticusok kimenetelét. Ennek azonban hiányzik a klinikai alkalmazása, amely a nagy dózisok biztosításának megvalósíthatóságán alapulna egy olyan erőforrás-korlátozott országban, mint India. Adataink ezért célzott megközelítést (eszkaláció/deeszkaláció) biztosítanak, amely az egyes betegekre egyedileg meghatározott válaszon és annak az általános eredmények javítására gyakorolt ​​hatásán alapul. A vizsgálati gyógyszert ingyenesen biztosítanák, és az ellátás színvonalába nem tartozó speciális vizsgálatok költségeit nem a betegek viselnék.