Účinnost cílené a odezvou řízené terapie albuminem versus standardní lékařská léčba ve výsledcích recidivujícího ascitu u pacientů s dekompenzovanou cirhózou.

Návrh studie Cíl a cíle Primární

• Studovat účinnost cílené léčby albuminem oproti standardní medikamentózní léčbě při snižování 6měsíční mortality u recidivujícího ascitu u pacientů s dekompenzovanou cirhózou

Sekundární cíle

• Studovat frekvenci terapeutické paracentézy u obou skupin
• Výskyt komplikací: paracentézou indukovaná oběhová dysfunkce (PICD), AKI, hyponatrémie, bakteriální infekce, jaterní encefalopatie a krvácení z varixů
• Vliv na systémovou hemodynamiku a portální tlaky
• Vliv na křehkost a sarkopenii
• Doba do vymizení ascitu u obou skupin
• Změny renální rezervy hodnocené pomocí sekvenčních rovnic založených na cystatinu C pro eGFR a další biomarkery (moč-NGAL, molekula poškození ledvin-1, jaterní protein vázající mastné kyseliny (L-FABP) každé 3 měsíce)
• Nežádoucí účinky a četnost vysazení beta-blokátorů v obou skupinách
• Přežití bez transplantace jater a TIPS v obou skupinách po 6 měsících a 1 roce
• Kvalita života hodnocená krátkým formulářem průzkumu-36 verze (SF-36)
• Vliv léčby albuminem na imunomodulaci
• Vliv albuminu na 12měsíční mortalitu

Metodologie REŽIM DÁVKOVÁNÍ (Popište dávkování subjektu nebo zvířete) V této otevřené označené randomizované studii budou do studie zařazeni po sobě jdoucí pacienti s cirhózou, kteří splňují kritéria pro zařazení a kritéria pro vyloučení. Podrobnosti výpočtu velikosti vzorku jsou uvedeny v části statistické metody. Závažnost onemocnění jater bude hodnocena podle skóre závažnosti – skóre CTP a MELD.

Pacienti budou randomizováni do 2 skupin koordinátorem klinické studie (CTC). CTC bude slepý k pacientovi a přijaté léčbě a provede se alokační skrytí technikou postupně očíslovaných neprůhledných zapečetěných obálek (SNOSE). Pacienti by měli být hodnoceni po 2 týdnech, 4 týdnech s hladinami sérového albuminu, stupněm ascitu a užíváním diuretik a poté každé 3 měsíce

Skupina A – by dostávala standardní lékařskou léčbu (podrobnosti jako u pacientů pro skupinu B) plus cílená léčba albuminem by byla podávána následovně:

Pacienti se sérovým albuminem < 3 g/l s recidivujícím ascitem – budou dostávat 20 % albuminu v dávce 60 gramů/týden, dokud nebude dosaženo cílového sérového albuminu 3,0 g/l, poté by pacienti dostávali 40 gramů albuminu každý týden až do vymizení ascitu nebo séra albumin > 3,5 g/l. Pacienti, kteří dosáhnou tohoto cíle, budou pokračovat v dávce 20 g/týden, dokud pacient zcela nevymizí ascites a sérový albumin > 3,5 g/l, nebo maximálně 6 měsíců poté by pacienti dostávali albumin 20 g jednou za 2 týdny Skupina B: Standardní lékařská péče Léčba – omezení soli, diuretika s velkoobjemovou paracentézou Těmto pacientům bude nasazena dieta s nízkým obsahem sodíku (2 g/den) a bude jim podávána kombinace kličkového diuretika (furosemid 40-160 mg/den) a diuretika s distálním účinkem ( spironolakton 100-400 mg/den) se zvyšováním dávky o jeden krok za sledováním vedlejších účinků. Bude provedena velkoobjemová paracentéza (LVP) spolu s intravenózním albuminem (odstraněno 8 g/l ascitu) podle potřeby se záznamem frekvence poklepů.

Sledování: 2 týdny, 4 týdny, poté každé 3 měsíce po dobu 1 roku

Důležité definice:

Recidivující ascites bude definován jako ascites, který se opakuje alespoň třikrát během 12měsíčního období navzdory dietnímu omezení sodíku a adekvátním dávkám diuretik.

Vyléčení ascitu by bylo definováno jako nepřítomnost klinického ascitu (ascites stupně 0 nebo 1), který může být buď částečný. Bylo by definováno jako vymizení ascitu po použití diuretik a úplné by bylo definováno jako vymizení ascitu bez potřeby diuretik.

Vyšetření: Základní HVPG s hodnocením portální (systémová a plicní hemodynamika) a srdeční hemodynamiky, cystatin C, prosté CT vyšetření k posouzení sarkopenie. U všech pacientů by byla provedena tělesná hmotnost, krevní tlak a echokardiogram. Rychlost glomerulární filtrace (GFR) bude odhadnuta pomocí rovnic eGFR - modifikace diety při onemocnění ledvin (MDRD6) a založené na cystatinu C (Chronic ledviny Epidemiology Collaboration). Spolu s tím bude odebrán vzorek arteriální krve po celonočním hladovění a odpočinku na lůžku alespoň 8 hodin v poloze na zádech pro stanovení aktivity reninu v plazmě, aldosteronu v plazmě a koncentrace norepinefrinu v plazmě. U všech zařazených pacientů by také byla provedena základní analýza moči s hodnocením sodíku v moči. Pacienti by následně podstoupili HVPG po 3-6 měsících a cystatin C každé 3 měsíce. Kromě toho by se na začátku, po 3 a 6 měsících, provedly testy s lipokalinem spojeným s neutrofily a gelatinázou v moči (NGAL), aktivita reninu v plazmě a hladiny aldosteronu v séru. Opakované prosté CT vyšetření k posouzení sarkopenie by bylo provedeno za 3 měsíce a za 6 měsíců. Sledování by mělo trvat 1 rok nebo do TIPS nebo transplantace jater.

Imunologické vyšetření související s albuminem:

Imunomodulace je považována za důležitý mechanismus účinku albuminu. Další experimenty by byly provedeny na začátku, po 3 a 6 měsících, aby se vyhodnotily izoformy albuminu (HMA, HNA1, HNA2, IMA), hladiny prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů (multiplexní luminex založené cytokinové pole), zánětlivé mediátory (C- Reaktivní protein, endotoxinový test, komplimentové proteiny; DAMPS); Frekvence a funkční profil buněk vrozené imunity (monocyty, neutrofily)

Analýza izoforem albuminu:

Chemikálie Změna izoformy albuminu bude provedena kvantifikací různých modifikací albuminu (HMA, HNA1, HNA2, IMA) na elektronovém sprejovém ionizačním orbitrap systému HRMS "(Q Exative plus) hmotnostním spektrometru spojeném s UHPLC od Thermoscientific USA. Stručně o izolované plazmě krev pacientů v daném časovém bodě (den 0 a tři měsíce) bude zředěna destilovanou vodou v poměru 1:4 000 a poté bude 8 ul této zředěné plazmy injikováno do vysoce výkonného systému kapalinové chromatografie a elektronového sprejového ionizačního MS systému . Separace vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií bude provedena na koloně C8 s reverzní fází (Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C8, 2,1 mm vnitřní průměr 3 50 mm, 1,8 lm závitová kolona s velikostí pórů 300 Å) při průtoku 0,2 ml /minutu za použití rozpouštědlového systému H20-acetonitril (s 0,1% kyselinou mravenčí) pod gradientem 90% H20 až 90% acetonitril po dobu 25 minut se získáváním začínajícím ve 3 minutách. Za podmínek auto-MS bude provedena hmotnostní spektrální analýza. Podobná analýza bude také provedena s roztokem exogenního albuminu. Získaná MS spektra s ionizací elektronovým sprejem sloučeniny budou analyzována pomocí softwaru Protein Deconvolution soft warre (termosvědecké Německo). Zde, po minimalizaci chromatogramu základního píku z celkového iontového chromatogramu, budou získány a analyzovány hmotnostní chromatogramy albuminu. Získaná spektra albuminu pak budou dekonvoluována v hmotnostním rozmezí od 66 000 do 67 000 Da (protože molekulová hmotnost [MW] různých izoforem albuminu spadá do tohoto rozmezí. Nakonec z intenzity píku bude měřena hojnost izoforem albuminu a relativní množství různých izoforem HSA bude hlášeno, jak je popsáno v Das et.al 2017. To bude provedeno na začátku a po 3 měsících. (voda, acetonitril a kyselina mravenčí pro hmotnostní spektrometrii (MS) budou zakoupeny od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Purifikovaný HSA byl zakoupen od společnosti Baxter (Gurgaon, Indie). Všechna činidla budou analytické čistoty.

Cytokinové pole Panel 45 cytokinů, chemokinů a růstových faktorů bude analyzován v krevní plazmě skupiny pacientů na začátku a po 3 měsících pomocí systému Bio-Plex multiplex cytokine bead assay system (Bio-Rad, CA) podle protokolu výrobce. Variační koeficient uvnitř testu a mezi testy uvažovaný pro multiplexní testy bude < 5 %

Profilování buněk přirozené imunity:

Celková plná krev bude odebírána pacientům před a po terapii a hodnocena na % frekvence monocytů barvením fluorochromem značeným anti-CD14 anti CD16 a na neutrofily anti-CD11b anti CD16 anti-CD15, anti-CD66b a bude získána a analyzována pomocí průtoková cytometrie FACS verš (BD biosciences). Pro funkční profilování vrozených imunitních buněk bude krev rozdělena na dvě části. PBMC budou izolovány pomocí ficoll-hypaque (Himedia) a monocyty budou izolovány pomocí CD14 izolační sady od miltenyi biotech podle výrobního protokolu. Zatímco jiná část krve bude použita k izolaci neutrofilů pomocí gran-hypaque (Himedia). Intracelulární cytokiny jako IFN-y, TNF-a, IL-lb budou analyzovány po stimulaci nízkou dávkou LPS. Rovněž se provede fagocytární vzplanutí nebo generování ROS pomocí protokolu popsaného výrobcem. Data budou opět získána a analyzována pomocí FACS verše (BD biosciences).

Metodika metabolické analýzy mořského koníka:

Účinek na energetický metabolismus monocytů (které řídí funkční vlastnosti imunitních buněk) jsme analyzovali měřením rychlosti extracelulární acidifikace (ECAR) a rychlosti spotřeby kyslíku (OCR) pomocí přístroje Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer v monocytech periferní krve pacientů na začátku studie a 3 měsíce jako míra produkce laktátu (náhrada pro rychlost glykolytické reakce) a OXPHOS v daném pořadí. Stručně řečeno, monocyty budou izolovány z čerstvě odebrané krve pomocí izolačního kitu CD14 od miltenyi biotech podle výrobního protokolu. Izolované monocyty budou nasazeny v triplikátech v hustotě 1X105 buněk na jamku. Před zahájením testu budou buňky inkubovány v Seahorse Assay Medium doplněném 10 mM glukózou a 1 mM pyruvátem sodným a glutaminem ve 37 °C inkubátoru bez CO2 po dobu 45 minut. Další změna parametrů oxidativní fosforylace bude vypočítána změnou OCR v reálném čase v reakci na léčbu oligomycinem (inhibitor ATPázy, 1 μM), FCCP (0,2 μM) a rotenonem (0,5 μM).

Studijní populace:

POPULACE SUBJEKTŮ / PŘEDKLINICKÝ MODEL (Popište populaci subjektů včetně kritérií pro zařazení/vyloučení nebo zvířecího modelu)

Studovat design:

• Randomizovaná kontrolovaná studie.
• Studie bude provedena na pacientech přijatých na oddělení hepatologie od srpna 2020 do srpna 2022 na ILBS, New Delhi
• Studijní skupinu budou tvořit pacienti s dekompenzovanou cirhózou s recidivujícím ascitem

Výpočet velikosti vzorku: V randomizované kontrolované studii Singha et al (Journal of Hepatology 2012) byla 90denní mortalita u pacientů s recidivujícím ascitem na midodrinu 15/20 (75 %) vs. 8/20 (40 %) v standardní léčebná skupina (velkoobjemová paracentéza a infuze albuminu). Za předpokladu, že přežití pro albumin je 75 % a se SMT je 40 %, pak s alfa 5 % a silou 90 % musíme zapsat 90 případů, tj. 45 případů v každé skupině. Dále za předpokladu 10% míry opuštění musíme zapsat 100 případů 50 z každé skupiny a náhodně je přidělit metodou randomizace bloků s velikostí bloku 10.

Podíl přežití v léčené skupině v daném časovém bodě = 0,75 Podíl přežití v kontrolní skupině v daném časovém bodě = 0,40 Poměr rizika = 3,19 Výkon (%) = 90 Alfa chyba (%) = 5stranný = 2 Požadovaný vzorek velikost pro léčenou skupinu = 45 Požadovaná velikost vzorku pro kontrolní skupinu = 45 Alfa chyba (%) Výkon (%) První skupina Druhá skupina 5 70 27 27 80 34 34 90 45 45

Intervence: Cílená terapie albuminem Monitorování a hodnocení: Sledování: 2 týdny, 4 týdny, 3 měsíce, poté každé 3 měsíce po dobu 1 roku

Statistická analýza

• Všechny proměnné musí být vyjádřeny v průměru (sd) nebo mediánu (rozsah)
• Proměnné budou porovnány Mann-Whitney U testem
• Pro kategorické proměnné použijeme Chí-kvadrát nebo Fisherův test
• Analýza přežití bude provedena pomocí Cox-proporcionální regresní analýzy
• Pojistně-matematická pravděpodobnost přežití se vypočte pomocí Kaplan-Meierova grafu a porovná se log-rank testem.
• Byla by provedena konkurenční analýza rizikového přežití s ​​konkurenčními událostmi, jako je TIPS a transplantace jater. Nežádoucí účinky: Alergické reakce na albumin, zhoršení dušnosti, objemové přetížení Pravidlo zastavení: Reakce na infuzi albuminu

Etické problémy ve studii a plány na řešení těchto problémů:

S ohledem na zkušební protokol neexistují žádné etické problémy. Albumin se běžně doporučuje k léčbě pacientů s cirhózou s ascitem. Ve velké multicentrické studii bylo prokázáno, že vysoká dávka albuminu 40 gramů/týden zlepšila výsledky u cirhotiků s nekomplikovaným ascitem. To však postrádá klinickou aplikaci založenou na proveditelnosti poskytovat vysoké dávky v zemi s omezenými zdroji, jako je Indie. Naše data by proto poskytla cílený přístup (eskalaci/deeskalaci) založený na reakci individualizované pro každého pacienta a jejím vlivu na zlepšení celkových výsledků. Studovaný lék by byl poskytován zdarma a náklady na speciální vyšetření, která nejsou součástí standardní péče, by nenesli pacienti.