口腔白板症におけるカンジダ関連サイトカイン

目的

1. カンジダの表現型、病原性属性 (分泌型アスパルチル プロテイナーゼ、バイオ フィルム形成、ホスホリパーゼ) および抗真菌感受性と、口腔白板症における臨床病理学的特徴との関連性を判断する
2. 炎症誘発性サイトカイン (IL-6、IL-8. 抗真菌療法前後の口腔白板症におけるIL-17、TNFα）。
3. 抗真菌療法による口腔白板症におけるカンジダと炎症誘発性サイトカインとの相関関係を研究する

研究デザイン、結果測定、サンプルサイズ、統計分析などの詳細な方法論。

研究デザイン:

前向き症例対照観察研究

患者の選択:

研究グループと対照グループの患者は、AIIMS歯科教育研究センターの口腔医学および放射線クリニックから連続して募集されます。

サンプルサイズ：

この研究には、60 人の OL (30 人の同種 OL、30 人の非同種 OL) と 30 人の健常者が含まれます。

臨床病理学的特徴:

臨床的特徴およびステージング/グレーディングは、各グループの準備されたプロフォーマに従って記録されます。 書面によるインフォームドコンセントは、さらなる調査の前に取られます。 タバコ、ビンロウの実、アルコール習慣の頻度、習慣の期間および現在の状態、ビジュアルアナログスケール（VAS）スコアによる口腔灼熱感の病歴 切開生検および診断の組織病理学的確認の前に、定期的な血液調査が行われます。 過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色による H & E 組織病理学的特徴を記録し、標準的な世界保健機関の基準に従って研究グループの等級付けを行います。 OL の臨床病期分類は、OL 病期分類システム (OLEP) (van der Waal 2000) に従って、校正された 2 人の観察者による病変の写真記録を使用して行われます。

研究のためのサンプルコレクション:

A)。カンジダの表現型、病原性および抗真菌感受性の研究。 収集、輸送、および処理: 各患者から 2 つの口腔スワブ (滅菌生理食塩水で事前に湿らせたもの) を口腔病変から採取し、標準的な検査手順に従ってさらに処理するために、微生物学部門の菌学検査室に送ります。

直接顕微鏡検査: 1 つのスワブ サンプルを顕微鏡検査して、グラム染色を調製することにより酵母細胞を検出します。

培養: 2 番目のスワブは、ゲンタマイシンを含むサブロー デキストロース寒天 (SDA) 培地に接種し、37°C​​ で 48 時間培養します。 グラム染色は、酵母の増殖に形態学的に類似する任意の増殖に対して実施される。

表現型の同定: 分離株の同定は、胚管、コーンミール寒天の形態、塩化トリフェニルテトラゾリウムおよび CHROM 寒天培地の色を使用して実行されました。フォーメーション（BF）は、標準プロトコルに従って決定されます。

ホスホリパーゼ（PL）活性の測定 ホスホリパーゼ活性は、卵黄寒天培地で細胞を増殖させ、沈殿ゾーンのサイズを測定することによって測定されます。 生理食塩水中の１０ ６ 酵母細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、５μｌを卵黄培地の表面に置く。 次に、培養物を 37°C で 7 ～ 8 日間インキュベートした後、コロニーの周囲の沈殿ゾーンの直径を測定します。 ホスホリパーゼ活性（Pz）は、コロニーの直径をプレート上に形成されたコロニーの周りの沈殿ゾーンの直径（pz）で割ることによって測定されます。 各分離株は、重複してテストされます。 C. アルビカンス SC 5314 株は、陽性対照として使用されます。

分泌アスパルチルプロテイナーゼ（ＳＡＰ）活性の決定 すべての分離株は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）寒天中で成長し、加水分解のクリアゾーンを生成する能力について試験される。 . １×１０ ６ 細胞／ｍｌの５μｌを固形培地に置き、３７℃で３～４日間インキュベートする。 続いて、沈殿したアルブミンの加水分解による不透明度の除去が記録されます。 C. アルビカンス SC 5314 株は、陽性対照として使用されます。

バイオフィルム形成（BF）の測定 1 x 106 細胞 /ml 懸濁液の 100μl 容量を、無菌のポリスチレン製平底 96 ウェルマイクロタイタープレートに置き、接着とバイオフィルムのために 37℃で 48 時間インキュベートします。 48時間後、ウェルをPBSで洗浄し、XTT [2,3-ビス(2-メトキシ-4ニトロ-5-スルホ-フェニル) - 2H - テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド］還元アッセイ ２時間のインキュベーション後、バイオフィルムの代謝活性の直接相関であるＸＴＴ還元アッセイにおける比色変化をマイクロタイタープレートリーダーで４９０ｎｍで測定する。

分離株の抗真菌感受性試験 ボリコナゾール、フルコナゾールおよびクロトリマゾールの抗真菌感受性試験は、酵母分離株に関する CLSI M44-A2 勧告に従って、ディスク拡散法によって実施されます。

B）。炎症誘発性サイトカイン研究 病変からの口腔分泌物のサンプル収集 4 つの滅菌 PVA 眼科用スポンジ (Merocel) を使用して、口腔病変 (生検部位以外) から 4 つの炎症誘発性サイトカイン研究のための口腔分泌物のサンプルを収集します。 これは非侵襲的な方法であり、他の血清や唾液の推定よりも優れた部位特異的な方法です。 さらに、OL で抗真菌療法を受けている患者の縦断的サンプリングによる局所サイトカイン レベルの評価は、サイトカイン上昇の時間的性質と抗真菌薬に対する臨床反応の理解を可能にする可能性があります。

この手順は、研究グループと対照グループの両方に対して行われます。 被験者は、サンプリングの少なくとも 2 時間前から、飲食および口のすすぎを控えるよう求められます。 スポンジは無菌生理食塩水であらかじめ湿らせ、こすったり動かしたりせずに病変と1分間接触させた後、生化学部門AIIMSでさらに分析するまで-80°Cの無菌容器にすぐに保存します。 サンプルサイトの写真と臨床記録は、将来の参照のために患者のプロフォーマとともに保管されます。 この手順は、研究グループの抗真菌療法後に同じ部位で繰り返され、比較のために写真記録が保持されます。 研究所の倫理委員会からの倫理的許可が取られます。 インフォームドされた書面による同意が得られ、研究に関する情報が研究対象者に提供され、サンプル収集前の対照となります。

ELISAによるIL-6、IL-8、IL-17およびTNFαレベルの推定 眼用スポンジ(Merocel)を室温で10分間解凍する。 次に、スポンジを 0.2 μm フィルターを含む微量遠心チューブ (SpinX 遠心チューブ) に挿入し、300 μl の抽出バッファーを加えて平衡化し、4 °C で 30 分間インキュベートした後、4 °C で 14,000 で 30 分間遠心分離します。 rpm。 遠心分離後、得られた上清を収集して、市販のキットを使用した ELISA 法による IL-6、IL-8、IL-17、および TNFα レベルの推定を行います。 上澄みは、使用するまで-80 ° C で保存されます。

抗原 (IL-6、IL-8、IL-17、および TNFα) に対するモノクローナル抗体が、付属のマイクロタイター ストリップのウェルにあらかじめコーティングされています。 サンプルまたは標準に存在する抗原をプレートと一緒にインキュベートして、抗原を抗体に結合させます。 これに続いて、それぞれのマイクロタイタープレートに、それぞれビオチンに結合した一次モノクローナル抗IL-6、IL-8、IL-17、およびTNFα抗体を添加する。 次に、一次抗体に特異的なアビジン-HRP結合抗体をウェルに添加します。 インキュベーション後、洗浄後、未結合の抗体酵素試薬を除去するために、HRP と反応する TMB ワンステップ基質試薬をウェルに添加します。 酸を加えて発色を止め、450nmで吸光度を測定した。 標準サンプルの異なる濃度を吸光度に対してプロットすることによって参照曲線が得られ、試験サンプル中の抗原のレベルがその標準プロットによって計算される。

抗真菌療法 研究グループは抗真菌療法で治療されます（うがい薬としてタブフルコナゾール100 mg（タブレットを10 mlの飲料水に溶解し、2分間すすぎとして使用し、飲み込む）を1日1回14日間）。 手順は、治療を開始する前に各被験者に実演されます。 口腔灼熱感と口腔内写真による病変の臨床的特徴は、抗真菌療法後に記録されます。

統計分析：

研究グループと対照グループにおけるカンジダの表現型、病原性属性、および抗真菌感受性の分布は、IL-6、IL-8、IL-17、およびTNFαのレベルと臨床病理学的特徴と相関します。 毒性因子と臨床的特徴との間の相関関係が決定される。 Cohens kappa 統計は、観察者内の信頼性を決定するために使用されます。 抗真菌療法前後の炎症誘発性サイトカイン（IL-6、IL-8、IL-17、およびTNFα）のレベルの比較は、研究グループで行われます。 結果は、統計的有意性について検定されます。カイ二乗検定とマンホイットニー U 検定を使用して、グループ間で観察された差の統計的有意性を推定します。

7.倫理的クリアランスの取得