Candida-assosierte cytokiner i oral leukoplakia

Mål

1. For å bestemme assosiasjonen av candida-fenotyper, virulensattributter (utskilte aspartylproteinaser, biofilmdannelse, fosfolipase) og soppdrepende følsomhet med klinikopatologiske egenskaper i oral leukoplaki
2. For å bestemme sekresjonen og nivåene av pro-inflammatoriske cytokiner (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) i oral leukoplaki før og etter antifungal terapi.
3. For å studere sammenhengen mellom candida og pro-inflammatoriske cytokiner i oral leukoplaki med antifungal terapi

Detaljert metodikk inkludert studiedesign, resultatmål, utvalgsstørrelse og statistisk analyse.

Studere design:

Prospektiv case-kontroll observasjonsstudie

Utvalg av pasienter:

Pasientene i studiegruppen og kontrollgruppen vil bli rekruttert fortløpende fra Oral Medicine & Radiology clinic ved Center for Dental Education & Research AIIMS.

Eksempelstørrelse:

Studien vil inkludere 60 OL (30 homogene OL, 30 ikke-homogene OL) og 30 friske kontroller

Klinisk patologiske egenskaper:

De kliniske egenskapene og iscenesettelsen/graderingen vil bli registrert i henhold til utarbeidet proforma for hver gruppe. Skriftlig informert samtykke vil bli tatt før ytterligere undersøkelser. Anamnese med tobakk, betelnøtt, alkoholvaner med hyppighet, varighet av vane og nåværende status, oral brennende følelse med Visual Analogue Scale (VAS) score vil bli Rutinemessige blodundersøkelser vil bli gjort før snittbiopsi og histopatologisk bekreftelse av diagnosen. H & E histopatologiske funksjoner med Periodic Acid Schiff (PAS) farging vil bli registrert og gradering gjort for studiegruppen i henhold til standard Verdens helseorganisasjons kriterier. Den kliniske iscenesettelsen av OL vil bli utført i henhold til OL-staging-systemet (OLEP) (van der Waal 2000) med fotografiske registreringer av lesjoner av to kalibrerte observatører. Rådgivning om tobakk, betelnøtt og alkoholavvenning og munnhygieneinstruksjoner vil bli gitt.

Prøvesamling for studie:

EN). Studie av Candida-fenotyper, virulens og soppdrepende følsomhet. Innsamling, transport og behandling: To orale vattpinner fra hver pasient (pre-våt med sterilt normalt saltvann) vil bli tatt fra den orale lesjonen og sendt til Mycology Laboratory, Institutt for mikrobiologi for videre behandling i henhold til standard laboratorieprosedyrer.

Direkte mikroskopi: En vattpinneprøve vil bli undersøkt med mikroskopi for påvisning av gjærceller ved å forberede gramfarging.

Kultur: Den andre vattpinnen vil bli inokulert på Sabouraud dekstroseagar (SDA) medium med gentamicin og vil bli holdt ved 37 °C for inkubasjon i 48 timer. Gramfarging vil bli utført på enhver vekst som morfologisk ligner den til gjær.

Fenotypisk identifikasjon: Identifikasjon av isolater ble utført ved bruk av kimrør, morfologi på maismelagar, farge på trifenyltetrazoliumklorid og CHROM-agarmedium Bestemmelse av virulensfaktorer til Candida spp. Ulike virulensfaktorer som fosfolipaseaktivitet, utskilt aspartylproteinase (SAP) og biofilm. formasjon (BF) vil bli bestemt i henhold til standardprotokollen.

Bestemmelse av fosfolipase (PL) aktivitet Fosfolipase aktivitet vil måles ved å dyrke celler på eggeplomme agar medium og måle størrelsen på nedbørsonen. En cellesuspensjon på 106 gjærceller/ml i saltvann vil bli klargjort og 5μl vil bli plassert på overflaten av eggeplommemediet. Kulturen vil deretter inkuberes ved 37°C i 7-8 dager, hvoretter diameteren på nedbørsonen rundt kolonien bestemmes. Fosfolipaseaktivitet (Pz) vil måles ved å dele kolonidiameteren med diameteren til nedbørssonen (pz) rundt kolonien dannet på platen. Hvert isolat vil bli testet i duplikat. C. albicans SC 5314-stammen vil bli brukt som positiv kontroll.

Bestemmelse av utskilt aspartylproteinase (SAP) aktivitet Alle isolater vil bli testet for deres evne til å vokse og produsere en klar sone for hydrolyse i bovint serumalbumin (BSA) agar. . En 5μl 1x106 celler/ml vil bli plassert på fast medium og vil bli inkubert ved 37°C i 3-4 dager. Deretter vil fjerning av opasiteten ved hydrolyse av utfelt albumin bli registrert. C. albicans SC 5314-stammen vil bli brukt som positiv kontroll.

Bestemmelse av biofilmdannelse (BF) Et 100μl volum på 1 x 106 celler/ml suspensjon vil bli plassert på sterile, polystyren, flatbunnede 96-brønners mikrotiterplater og vil bli inkubert i 48 timer ved 37°C for vedheft og biofilm. Etter 48 timer vil brønnene vaskes med PBS og et semikvalitativt mål av biofilm vil bli påvist av XTT [2,3-bis (2-metoksy-4nitro-5-sulfo-fenyl) - 2H - tetra-zolium-5- karboksanilid] -reduksjonsanalyse En kolorimetrisk endring i XTT-reduksjonsanalysen, en direkte korrelasjon av den metabolske aktiviteten til biofilmen, vil deretter bli målt i en mikrotiterplateleser ved 490 nm etter 2 timers inkubering.

Antifungal mottakelighetstesting av isolater Antifungal mottakelighet for vorikonazol flukonazol og klotrimazol vil bli utført ved diskdiffusjonsmetode i henhold til CLSI M44-A2-anbefalingen på gjærisolatene.

B). Studie av pro-inflammatoriske cytokiner Prøveinnsamling av orale sekreter fra lesjon Fire sterile PVA oftalmiske svamper (Merocel) vil bli brukt til å samle prøver av orale sekreter for fire pro-inflammatoriske cytokinstudier fra den orale lesjonen (annet enn biopsistedet). Dette er en ikke-invasiv metode og gjør den stedsspesifikk, noe som er en fordel i forhold til andre serum- og spyttestimeringer. I tillegg kan vurdering av lokale cytokinnivåer via langsgående prøvetaking hos pasienter som gjennomgår soppdrepende terapi i OL gi mulighet for en forståelse av den tidsmessige naturen til cytokinøkning og klinisk respons på soppdrepende midler.

Denne prosedyren vil bli gjort for både studiegruppen og kontrollgruppen. Forsøkspersonene vil bli bedt om å avstå fra å spise, drikke og skylle munnen minst 2 timer før prøvetaking. Svampene vil være forhåndsvåte med sterilt normalt saltvann, holdes i kontakt med lesjonen uten gnidning eller bevegelse eller 1 minutt og deretter umiddelbart lagret i sterile beholdere ved -80 °C inntil videre analyse i biokjemiavdelingen AIIMS. En fotografisk og klinisk oversikt over prøvestedet vil bli oppbevart sammen med pasientens proforma for fremtidig referanse. Denne prosedyren vil bli gjentatt på samme sted etter soppdrepende terapi for studiegruppen, og en fotografisk oversikt vil bli holdt for sammenligning. Etisk godkjenning fra Instituttets etiske styre vil bli tatt. Informert skriftlig samtykke vil bli innhentet og informasjon om studien vil bli gitt til studieobjektene og kontrollene før prøveinnsamling.

Estimering av IL-6-, IL-8-, IL-17- og TNFa-nivåer ved ELISA. De oftalmiske svampene (Merocel ) vil bli tint ved romtemperatur i 10 min. Svamper vil deretter settes inn i et mikrosentrifugerør som inneholder et 0,2 μm filter (SpinX sentrifugerør), ekvilibrert ved å tilsette 300 μl ekstraksjonsbuffer og inkubert i 30 minutter ved 4 °C, etterfulgt av sentrifugering ved 4 °C i 30 minutter ved 14.000. rpm. Etter sentrifugering vil den resulterende supernatanten samles for estimering av IL-6-, IL-8-, IL-17- og TNFa-nivåer ved hjelp av ELISA-metoden med kommersielt tilgjengelige sett. Supernatanten vil bli lagret ved -80 °C frem til bruk.

Et monoklonalt antistoff mot antigenene (IL-6, IL-8, IL-17 og TNFα) har blitt forhåndsbelagt på brønnene til de medfølgende mikrotiterstrimlene. Antigener tilstede i prøven eller standarden vil bli inkubert med platene for å tillate binding av antigener til antistoffet. Dette etterfølges av tilsetning av et primært monoklonalt anti-IL-6-, IL-8-, IL-17- og TNFa-antistoff henholdsvis konjugert til biotin i respektive mikrotiterplater. Et avidin-HRP-konjugert antistoff spesifikt for primært antistoff vil deretter bli tilsatt til brønnene. Etter inkubering og etter en vask, for å fjerne eventuell ubundet antistoffenzymreagens, vil en TMB ett-trinns substratreagens som er reaktiv med HRP, tilsettes brønnene. Fargeutviklingen vil bli avsluttet ved å tilsette syre og absorbansen ble målt ved 450 nm. En referansekurve vil bli oppnådd ved å plotte de forskjellige konsentrasjonene av standardprøver versus absorbans, og nivåene av antigenene i prøvene som testes vil bli beregnet ved hjelp av standardplottet.

Antifungal behandling Studiegruppen vil bli behandlet med antifungal behandling ( Tab Fluconazole 100 mg som munnvann ( tablett oppløst i 10 ml drikkevann og brukt som skylling i 2 minutter og svelget) en gang daglig i 14 dager). Prosedyren vil bli demonstrert for hvert studieobjekt før behandlingen starter. Den orale brennende følelsen og de kliniske egenskapene til lesjonene med intraorale fotografier vil bli registrert etter soppdrepende terapi.

Statistisk analyse:

Fordelingen av candida-fenotyper, virulensattributter og antifungal sensitivitet i studie- og kontrollgruppene vil være korrelert med nivåer av IL-6, IL-8, IL-17 og TNFα og klinikopatologiske egenskaper. Korrelasjoner mellom virulensfaktorer og kliniske egenskaper vil bli bestemt. Cohens kappa-statistikk vil bli brukt for å bestemme intraobservatør-pålitelighet. En sammenligning av nivåene av pro-inflammatoriske cytokiner (IL-6, IL-8, IL-17 og TNFα) før og etter antifungal terapi vil bli gjort i studiegruppen. Resultatene vil bli testet for statistisk signifikans. Chi- square og Mann- Whitney U-testene vil bli brukt til å estimere den statistiske signifikansen av forskjellen observert mellom gruppene.

7.Etisk godkjenning oppnådd