Ассоциированные с Candida цитокины при оральной лейкоплакии

Цели

1. Определить связь фенотипов Candida, атрибутов вирулентности (секретируемые аспартилпротеиназы, образование биопленок, фосфолипаза) и чувствительности к противогрибковым препаратам с клинико-патологическими характеристиками при лейкоплакии полости рта.
2. Для определения секреции и уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8. IL-17, TNFα) при лейкоплакии полости рта до и после противогрибковой терапии.
3. Изучить корреляцию между кандидозом и провоспалительными цитокинами при лейкоплакии полости рта на фоне противогрибковой терапии.

Подробная методология, включая дизайн исследования, показатели результатов, размер выборки и статистический анализ.

Дизайн исследования:

Проспективное обсервационное исследование случай-контроль

Отбор пациентов:

Пациенты в исследовательской группе и контрольной группе будут последовательно набраны из клиники оральной медицины и радиологии Центра стоматологического образования и исследований AIIMS.

Размер образца:

Исследование будет включать 60 OL (30 гомогенных OL, 30 негомогенных OL) и 30 здоровых контролей.

Клинико-патологические характеристики:

Клинические характеристики и стадии/классификация будут регистрироваться в соответствии с подготовленной формой для каждой группы. Перед любым дальнейшим расследованием будет получено письменное информированное согласие. Табак в анамнезе, употребление орехов бетеля, употребление алкоголя с частотой, продолжительностью привычки и текущим состоянием, ощущение жжения во рту с оценками по визуальной аналоговой шкале (ВАШ) будут проводиться перед инцизионной биопсией и гистопатологическим подтверждением диагноза. Гистопатологические признаки H & E с окрашиванием периодической кислотой Шиффа (PAS) будут зарегистрированы, и будет проведена оценка для исследовательской группы в соответствии со стандартными критериями Всемирной организации здравоохранения. Клиническая стадия OL будет проводиться в соответствии с системой стадирования OL (OLEP) (van der Waal 2000) с фотографическими записями поражений двумя квалифицированными наблюдателями. Будут даны консультации по отказу от табака, бетеля и алкоголя, а также инструкции по гигиене полости рта.

Сбор образцов для изучения:

А). Исследование фенотипов Candida, вирулентности и чувствительности к противогрибковым препаратам. Сбор, транспортировка и обработка: два мазка из полости рта каждого пациента (предварительно смоченные стерильным физиологическим раствором) берутся из полости рта и отправляются в микологическую лабораторию отделения микробиологии для дальнейшей обработки в соответствии со стандартными лабораторными процедурами.

Прямая микроскопия: Один образец мазка исследуют под микроскопом на предмет выявления дрожжевых клеток путем подготовки окраски по Граму.

Посев: второй мазок инокулируют на среде с декстрозным агаром Сабуро (SDA) с гентамицином и выдерживают при 37°C для инкубации в течение 48 часов. Окрашивание по Граму проводят на любом росте, морфологически напоминающем рост дрожжей.

Фенотипическая идентификация: Идентификация изолятов проводилась с использованием зародышевой трубки, морфологии на агаре из кукурузной муки, окраски на хлориде трифенилтетразолия и агаровой среде CHROM. Определение факторов вирулентности Candida spp. Различные факторы вирулентности, такие как активность фосфолипазы, секретируемая аспартилпротеиназа (SAP) и биопленка. формирование (BF) будет определяться в соответствии со стандартным протоколом.

Определение активности фосфолипазы (PL) Активность фосфолипазы будет измеряться путем выращивания клеток на агаровой среде с яичным желтком и измерения размера зоны преципитации. Готовят клеточную суспензию 106 дрожжевых клеток/мл в физиологическом растворе и 5 мкл помещают на поверхность среды с яичным желтком. Затем культуру инкубируют при 37°С в течение 7-8 дней, после чего определяют диаметр зоны преципитации вокруг колонии. Активность фосфолипазы (Pz) измеряют путем деления диаметра колонии на диаметр зоны преципитации (pz) вокруг колонии, образовавшейся на чашке. Каждый изолят будет протестирован в двух повторностях. Штамм C. albicans SC 5314 будет использоваться в качестве положительного контроля.

Определение активности секретируемой аспартилпротеиназы (SAP) Все изоляты будут проверены на их способность расти и образовывать четкую зону гидролиза в агаре с бычьим сывороточным альбумином (BSA). . 5 мкл 1x106 клеток/мл помещают на твердую среду и инкубируют при 37°C в течение 3-4 дней. Впоследствии будет записано устранение помутнения путем гидролиза осажденного альбумина. Штамм C. albicans SC 5314 будет использоваться в качестве положительного контроля.

Определение образования биопленки (BF) Суспензию объемом 100 мкл с концентрацией 1 x 106 клеток/мл помещают на стерильные полистироловые плоскодонные 96-луночные микротитровальные планшеты и инкубируют в течение 48 ч при 37°C для прилипания и образования биопленки. Через 48 часов лунки промывают PBS и определяют полукачественную меру биопленки с помощью XTT [2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5- анализ восстановления карбоксанилида] Колориметрическое изменение в анализе восстановления XTT, прямая корреляция с метаболической активностью биопленки, будет затем измерена в титрационном микропланшет-ридере при 490 нм после 2 часов инкубации.

Тестирование чувствительности изолятов к противогрибковым препаратам Определение чувствительности изолятов к вориконазолу, флуконазолу и клотримазолу будет проводиться методом диско-диффузии в соответствии с рекомендацией CLSI M44-A2 для изолятов дрожжей.

Б). Исследование провоспалительных цитокинов Сбор образцов оральных выделений из очага поражения Четыре стерильных офтальмологических губки из поливинилового спирта (Merocel) будут использоваться для сбора образцов орального секрета для четырех исследований провоспалительных цитокинов из орального очага (кроме участка биопсии). Это неинвазивный метод, который делает его локализованным, что является преимуществом по сравнению с другими методами оценки сыворотки и слюны. Кроме того, оценка локальных уровней цитокинов путем лонгитудинальной выборки у пациентов, получающих противогрибковую терапию при ОЛ, может позволить понять временной характер повышения уровня цитокинов и клинического ответа на противогрибковые препараты.

Эта процедура будет выполнена как для исследовательской группы, так и для контрольной группы. Субъектам будет предложено воздержаться от еды, питья и полоскания рта по крайней мере за 2 часа до отбора проб. Губки будут предварительно смочены стерильным физиологическим раствором, оставлены в контакте с поражением без трения или движения или в течение 1 минуты, а затем немедленно сохранены в стерильных контейнерах при температуре -80 ° C до дальнейшего анализа в отделении биохимии AIIMS. Фотографии и клинические записи места отбора проб будут храниться вместе с картой пациента для дальнейшего использования. Эта процедура будет повторяться в том же месте после противогрибковой терапии для исследуемой группы, и для сравнения будут сохраняться фотографии. Будет получено этическое разрешение от совета по этике Института. Будет получено информированное письменное согласие, и информация об исследовании будет предоставлена ​​субъектам исследования и контролям до сбора образцов.

Оценка уровней IL-6, IL-8, IL-17 и TNFα с помощью ELISA. Офтальмологические губки (Merocel) оттаивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем губки помещают в микроцентрифужную пробирку, содержащую фильтр 0,2 мкм (центрифужная пробирка SpinX), уравновешивают добавлением 300 мкл буфера для экстракции и инкубируют в течение 30 минут при 4 °C, после чего следует центрифугирование при 4 °C в течение 30 минут при 14000 об/мин. об/мин. После центрифугирования полученный супернатант собирают для оценки уровней IL-6, IL-8, IL-17 и TNFα методом ELISA с коммерчески доступными наборами. Супернатант будет храниться при -80 ° C до использования.

Моноклональные антитела против антигенов (IL-6, IL-8, IL-17 и TNFα) были предварительно нанесены на лунки предоставленных микротитровальных полосок. Антигены, присутствующие в образце или стандарте, инкубируют с планшетами, чтобы обеспечить связывание антигенов с антителами. За этим следует добавление первичных моноклональных антител против IL-6, IL-8, IL-17 и TNFα, соответственно конъюгированных с биотином, в соответствующие микротитровальные планшеты. Затем в лунки добавляют конъюгированное с авидином-HRP антитело, специфичное в отношении первичного антитела. После инкубации и последующей промывки для удаления любого несвязанного реагента фермента антитела в лунки будет добавлен реагент одностадийного субстрата TMB, реагирующий с HRP. Развитие окраски будет прекращено добавлением кислоты, и поглощение будет измерено при 450 нм. Эталонная кривая будет получена путем построения различных концентраций стандартных образцов в зависимости от абсорбции, а уровни антигенов в тестируемых образцах будут рассчитаны по ее стандартному графику.

Противогрибковая терапия. Исследуемая группа будет получать противогрибковую терапию (Табл Флуконазол 100 мг в виде жидкости для полоскания рта (таблетку растворяют в 10 мл питьевой воды и используют для полоскания в течение 2 минут и проглатывают) один раз в день в течение 14 дней). Процедура будет продемонстрирована каждому субъекту исследования перед началом лечения. Ощущение жжения во рту и клинические характеристики поражений с внутриротовыми фотографиями будут зарегистрированы после противогрибковой терапии.

Статистический анализ:

Распределение фенотипов Candida, атрибутов вирулентности и противогрибковой чувствительности в исследуемой и контрольной группах будет коррелировать с уровнями IL-6, IL-8, IL-17 и TNFα и клинико-патологическими характеристиками. Будут определены корреляции между факторами вирулентности и клиническими характеристиками. Каппа-статистика Коэна будет использоваться для определения надежности внутри наблюдателя. В исследуемой группе будет проведено сравнение уровней провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-17 и ФНОα) до и после противогрибковой терапии. Результаты будут проверены на статистическую значимость. Критерии Хи-квадрат и U-критерий Манна-Уитни будут использоваться для оценки статистической значимости различий, наблюдаемых между группами.

7. Получено этическое разрешение