Candida associerade cytokiner i oral leukoplaki

Mål

1. För att bestämma associeringen av candida-fenotyper, virulensattribut (utsöndrade aspartylproteinaser, biofilmbildning, fosfolipas) och svampdödande känslighet med klinisk patologiska egenskaper i oral leukoplaki
2. För att bestämma utsöndringen och nivåerna av pro-inflammatoriska cytokiner (IL-6, IL-8. IL-17, TNFa) vid oral leukoplaki före och efter antifungal terapi.
3. Att studera sambandet mellan candida och pro-inflammatoriska cytokiner i oral leukoplaki med svampdödande terapi

Detaljerad metodik inklusive studiedesign, resultatmått, urvalsstorlek och statistisk analys.

Studera design:

Prospektiv fall-kontroll observationsstudie

Urval av patienter:

Patienterna i studiegruppen och kontrollgruppen kommer att rekryteras i följd från Oral Medicine & Radiology clinic vid Center for Dental Education & Research AIIMS.

Provstorlek:

Studien kommer att omfatta 60 OL (30 homogena OL, 30 icke-homogena OL) och 30 friska kontroller

Klinikopatologiska egenskaper:

De kliniska egenskaperna och stadieindelningen/graderingen skulle registreras enligt förberedd proforma för varje grupp. Skriftligt informerat samtycke skulle tas innan ytterligare utredning. Historik av tobak, betelnöt, alkoholvanor med frekvens, varaktighet av vana och nuvarande status, oral brännande känsla med Visual Analogue Scale (VAS) poäng kommer att göras Rutinmässiga blodundersökningar skulle göras före incisionsbiopsi och histopatologisk bekräftelse av diagnosen. H & E histopatologiska egenskaper med periodic Acid Schiff (PAS) färgning skulle registreras och gradering göras för studiegruppen enligt Världshälsoorganisationens standardkriterier. Den kliniska iscensättningen av OL kommer att göras enligt OL-staging-systemet (OLEP) (van der Waal 2000) med fotografiska registreringar av lesioner av två kalibrerade observatörer. Rådgivning om slutande av tobak, betelnötter och alkohol och munhygieninstruktioner kommer att ges.

Provsamling för studie:

A). Studie av Candida-fenotyper, virulens och svampdödande känslighet. Insamling, transport och bearbetning: Två orala pinnprover från varje patient (förvåtade med steril normal koksaltlösning) kommer att tas från den orala lesionen och skickas till Mycology Laboratory, Department of Microbiology för vidare bearbetning enligt standardlaboratorieprocedurer.

Direktmikroskopi: Ett pinnprov kommer att undersökas med mikroskopi för detektion av jästceller genom att förbereda gramfärgning.

Odling: Den andra provtagningspinnen kommer att inokuleras på Sabouraud dextrosagar (SDA) medium med gentamicin och förvaras vid 37°C för inkubation i 48 timmar. Gramfärgning kommer att utföras på varje tillväxt som morfologiskt liknar den för jäst.

Fenotypisk identifiering: Identifiering av isolat utfördes genom att använda groddrör, morfologi på majsmjölsagar, färg på trifenyltetrazoliumklorid och CHROM-agarmedium Bestämning av virulensfaktorer för Candida spp Olika virulensfaktorer som fosfolipasaktivitet, utsöndrat aspartylproteinas (SAP) och bildning (BF) kommer att bestämmas enligt standardprotokollet.

Bestämning av fosfolipas (PL) aktivitet Fosfolipas aktivitet kommer att mätas genom att odla celler på äggula agar medium och mäta storleken på nederbördszonen. En cellsuspension av 106 jästceller/ml i saltlösning kommer att förberedas och 5 μl kommer att placeras på ytan av äggulemediet. Kulturen kommer sedan att inkuberas vid 37°C i 7-8 dagar, varefter diametern på nederbördszonen runt kolonin kommer att bestämmas. Fosfolipasaktivitet (Pz) kommer att mätas genom att dividera kolonidiametern med diametern av utfällningszonen (pz) runt kolonin som bildas på plattan. Varje isolat kommer att testas i duplikat. C. albicans SC 5314-stammen kommer att användas som positiv kontroll.

Bestämning av utsöndrat aspartylproteinas-aktivitet (SAP) Alla isolat kommer att testas för sin förmåga att växa och producera en klar hydrolyszon i bovint serumalbumin (BSA)-agar. . En 5μl 1x106 celler/ml kommer att placeras på fast medium och kommer att inkuberas vid 37°C i 3-4 dagar. Därefter kommer rensning av opaciteten genom hydrolys av utfällt albumin att registreras. C. albicans SC 5314-stammen kommer att användas som positiv kontroll.

Bestämning av biofilmbildning (BF) En 100 μl volym av 1 x 106 celler/ml suspension kommer att placeras på sterila, polystyren, plattbottnade 96-brunnars mikrotiterplattor och kommer att inkuberas i 48 timmar vid 37 °C för vidhäftning och biofilm. Efter 48 timmar kommer brunnarna att tvättas med PBS och ett semikvalitativt mått av biofilm kommer att detekteras av XTT [2,3-bis (2-metoxi-4nitro-5-sulfo-fenyl) - 2H - tetra-zolium-5- karboxanilid] -reduktionsanalys En kolorimetrisk förändring i XTT-reduktionsanalysen, en direkt korrelation av biofilmens metaboliska aktivitet, kommer sedan att mätas i en mikrotiterplattläsare vid 490 nm efter 2 timmars inkubation.

Antisvampkänslighetstest av isolat Antifungal känslighet för vorikonazol flukonazol och klotrimazol kommer att utföras med diskdiffusionsmetod enligt CLSI M44-A2-rekommendationen för jästisolaten.

B). Studie av pro-inflammatoriska cytokiner Provinsamling av orala sekret från lesion Fyra sterila PVA oftalmiska svampar (Merocel) kommer att användas för att samla in prover av orala sekret för fyra pro-inflammatoriska cytokinstudier från den orala lesionen (annat än biopsistället). Detta är en icke-invasiv metod och gör den platsspecifik, vilket är en fördel jämfört med andra serum- och salivuppskattningar. Dessutom kan bedömning av lokala cytokinnivåer via longitudinell provtagning hos patienter som genomgår antimykotikabehandling i OL möjliggöra en förståelse av den tidsmässiga karaktären av cytokinhöjningar och kliniskt svar på antimykotika.

Denna procedur kommer att göras för både studiegruppen och kontrollgruppen. Försökspersonerna kommer att uppmanas att avstå från att äta, dricka och skölja munnen minst 2 timmar före provtagning. Svamparna kommer att förvätas med steril normal koksaltlösning, hållas i kontakt med lesionen utan att gnugga eller röra sig eller 1 minut och sedan omedelbart förvaras i sterila behållare vid -80 °C tills vidare analys i biokemiavdelningen AIIMS. En fotografisk och klinisk dokumentation av provstället kommer att förvaras tillsammans med patientens proforma för framtida referens. Denna procedur kommer att upprepas på samma plats efter svampdödande terapi för studiegruppen och en fotografisk journal kommer att föras för jämförelse. Etiskt godkännande från Institutets etiska styrelse kommer att tas. Informerat skriftligt medgivande kommer att erhållas och information om studien kommer att ges till försökspersonerna och kontrollerna före provinsamling.

Uppskattning av IL-6-, IL-8-, IL-17- och TNFa-nivåer med ELISA. De oftalmiska svamparna (Merocel) kommer att tinas vid rumstemperatur i 10 minuter. Svampar kommer sedan att sättas in i ett mikrocentrifugrör innehållande ett 0,2 μm filter (SpinX centrifugrör), utjämnas genom att tillsätta 300 μl extraktionsbuffert och inkuberas i 30 minuter vid 4 °C, följt av centrifugering vid 4 °C i 30 minuter vid 14,000. rpm. Efter centrifugering kommer den resulterande supernatanten att samlas in för uppskattning av IL-6-, IL-8-, IL-17- och TNFa-nivåer genom ELISA-metoden med kommersiellt tillgängliga kit. Supernatanten kommer att förvaras vid -80 °C fram till användning.

En monoklonal antikropp mot antigenerna (IL-6, IL-8, IL-17 och TNFa) har förbelagts på brunnarna i de tillhandahållna mikrotiterremsorna. Antigener som finns i provet eller standarden kommer att inkuberas med plattorna för att möjliggöra bindning av antigener till antikroppen. Detta följs av tillägg av en primär monoklonal anti-IL-6, IL-8, IL-17 respektive TNFa-antikropp konjugerad till biotin i respektive mikrotiterplattor. En avidin-HRP-konjugerad antikropp specifik för primär antikropp kommer sedan att läggas till brunnarna. Efter inkubation och efter en tvätt, för att avlägsna eventuellt obundet antikroppsenzymreagens, tillsätts ett TMB enstegssubstratreagens som är reaktivt med HRP till brunnarna. Färgutvecklingen kommer att avslutas genom tillsats av syra och absorbansen mättes vid 450 nm. En referenskurva kommer att erhållas genom att plotta de olika koncentrationerna av standardprover kontra absorbans och nivåerna av antigenerna i proverna som testas kommer att beräknas genom dess standarddiagram.

Antifungal terapi Studiegruppen kommer att behandlas med svampdödande terapi ( Tab Fluconazole 100 mg som munvatten ( tablett löst i 10 ml dricksvatten och används som sköljning i 2 minuter och sväljas) en gång om dagen i 14 dagar). Förfarandet kommer att demonstreras för varje försöksperson innan behandlingen påbörjas. Den orala brännande känslan och kliniska egenskaper hos lesionerna med intraorala fotografier kommer att registreras efter svampdödande behandling.

Statistisk analys:

Fördelningen av candida-fenotyper, virulensegenskaper och antifungal känslighet i studie- och kontrollgrupperna skulle vara korrelerad med nivåer av IL-6, IL-8, IL-17 och TNFa och kliniskt patologiska egenskaper. Korrelationer mellan virulensfaktorer och kliniska egenskaper kommer att bestämmas. Cohens kappa-statistik kommer att användas för att bestämma intraobservatörens tillförlitlighet. En jämförelse av nivåerna av pro-inflammatoriska cytokiner (IL-6, IL-8, IL-17 och TNFα) före och efter svampdödande behandling kommer att göras i studiegruppen. Resultaten skulle testas för statistisk signifikans. Chi-quadrat- och Mann-Whitney U-testen kommer att användas för att uppskatta den statistiska signifikansen av skillnader som observerats mellan grupperna.

7. Etiskt tillstånd erhållits