Candida-geassocieerde cytokines bij orale leukoplakie

Doelstellingen

1. Om de associatie van candida-fenotypes, virulentie-attributen (uitgescheiden aspartyl-proteïnasen, biofilmvorming, fosfolipase) en antischimmelgevoeligheid met klinisch-pathologische kenmerken bij orale leukoplakie te bepalen
2. Om de secretie en niveaus van pro-inflammatoire cytokines (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) bij orale leukoplakie voor en na antifungale therapie.
3. Het bestuderen van de correlatie tussen candida en pro-inflammatoire cytokines bij orale leukoplakie met antischimmeltherapie

Gedetailleerde methodologie inclusief onderzoeksopzet, uitkomstmaten, steekproefomvang en statistische analyse.

Studie ontwerp:

Prospectieve case-control observationele studie

Selectie van patiënten:

De patiënten in de studiegroep en de controlegroep zullen achtereenvolgens worden gerekruteerd uit de kliniek Oral Medicine & Radiology van Centre for Dental Education & Research AIIMS.

Steekproefgrootte:

De studie omvat 60 OL (30 homogene OL, 30 niet-homogene OL) en 30 gezonde controles

Klinisch-pathologische kenmerken:

De klinische kenmerken en stadiëring/indeling zouden worden geregistreerd volgens de opgestelde proforma voor elke groep. Voorafgaand aan enig verder onderzoek zou schriftelijke geïnformeerde toestemming worden verkregen. Geschiedenis van tabak, betelnoot, alcoholgewoonten met frequentie, duur van gewoonte en huidige status, oraal brandend gevoel met Visual Analogue Scale (VAS)-scores zullen routinematig bloedonderzoek worden uitgevoerd vóór incisiebiopsie en histopathologische bevestiging van de diagnose. De H & E histopathologische kenmerken met Periodic Acid Schiff (PAS)-kleuring zouden worden geregistreerd en beoordeeld voor de studiegroep volgens de standaard criteria van de Wereldgezondheidsorganisatie. De klinische stadiëring van OL zal worden uitgevoerd volgens het OL-stadiëringssysteem (OLEP) (van der Waal 2000) met fotografische registraties van laesies door twee gekalibreerde waarnemers. Er zullen tabaks-, betelnoot- en alcoholstopbegeleiding en instructies voor mondhygiëne worden gegeven.

Monsterverzameling voor studie:

A). Candida fenotypes, virulentie en antifungale gevoeligheidsstudie. Afname, transport en verwerking: Van elke patiënt worden twee orale uitstrijkjes genomen (voorbevochtigd met steriele normale zoutoplossing) van de orale laesie en verzonden naar het Mycologisch Laboratorium, Afdeling Microbiologie voor verdere verwerking volgens de standaardlaboratoriumprocedures.

Directe microscopie: Eén uitstrijkje wordt microscopie onderzocht op detectie van gistcellen door gramkleuring te bereiden.

Kweek: Het tweede wattenstaafje wordt geënt op Sabouraud dextrose agar (SDA) medium met gentamicine en wordt gedurende 48 uur op 37°C gehouden voor incubatie. Gramkleuring zal worden uitgevoerd op elke groei die morfologisch lijkt op die van gist.

Fenotypische identificatie: Identificatie van isolaten werd uitgevoerd met behulp van kiembuis, morfologie op maïsmeelagar, kleur op trifenyltetrazoliumchloride en CHROM-agarmedium Bepaling van virulentiefactoren van Candida spp Verschillende virulentiefactoren zoals fosfolipase-activiteit, uitgescheiden aspartylproteïnase (SAP) en biofilm formatie (BF) zal worden bepaald volgens het standaardprotocol.

Bepaling van fosfolipase (PL)-activiteit De fosfolipase-activiteit zal worden gemeten door cellen te laten groeien op eigeel-agarmedium en de grootte van de neerslagzone te meten. Er wordt een celsuspensie van 106 gistcellen/ml in zoutoplossing bereid en 5 μl wordt op het oppervlak van het eigeelmedium geplaatst. Vervolgens wordt de kweek 7-8 dagen bij 37°C geïncubeerd, waarna de diameter van de neerslagzone rond de kolonie wordt bepaald. De fosfolipase-activiteit (Pz) wordt gemeten door de koloniediameter te delen door de diameter van de precipitatiezone (pz) rond de op de plaat gevormde kolonie. Elk isolaat wordt in tweevoud getest. De stam C. albicans SC 5314 zal als positieve controle worden gebruikt.

Bepaling van de activiteit van uitgescheiden aspartylproteïnase (SAP) Alle isolaten zullen worden getest op hun vermogen om te groeien en een heldere zone van hydrolyse te produceren in runderserumalbumine (BSA)-agar. . Een 5μl van 1x106 cellen/ml wordt op vast medium geplaatst en gedurende 3-4 dagen bij 37°C geïncubeerd. Vervolgens wordt de vertroebeling door hydrolyse van geprecipiteerd albumine geregistreerd. De stam C. albicans SC 5314 zal als positieve controle worden gebruikt.

Bepaling van biofilmvorming (BF) Een 100 μl volume van 1 x 106 cellen/ml suspensie wordt op steriele polystyreen microtiterplaten met 96 putjes met vlakke bodem geplaatst en gedurende 48 uur bij 37°C geïncubeerd voor hechting en biofilm. Na 48 uur zullen de putjes worden gewassen met PBS en zal een semi-kwalitatieve meting van biofilm worden gedetecteerd door XTT [2,3-bis (2-methoxy-4nitro-5-sulfo-fenyl) - 2H - tetra-zolium-5- carboxanilide]-reductietest Een colorimetrische verandering in de XTT-reductietest, een directe correlatie van de metabole activiteit van de biofilm, zal vervolgens worden gemeten in een microtiterplaatlezer bij 490 nm na 2 uur incubatie.

Antifungale gevoeligheidstesten van isolaten Antifungale gevoeligheid voor voriconazol, fluconazol en clotrimazol zullen worden uitgevoerd met de schijfdiffusiemethode volgens de CLSI M44-A2-aanbeveling op de gistisolaten.

B). Onderzoek naar pro-inflammatoire cytokines Monstername van orale secreties van laesie Vier steriele PVA-oogsponzen (Merocel) zullen worden gebruikt om monsters van orale secreties te verzamelen voor vier pro-inflammatoire cytokine-onderzoeken van de orale laesie (anders dan biopsieplaats). Dit is een niet-invasieve methode en maakt deze plaatsspecifiek, wat een voordeel is ten opzichte van andere serum- en speekselschattingen. Bovendien kan beoordeling van lokale cytokineniveaus via longitudinale bemonstering bij patiënten die antischimmeltherapie in OL ondergaan, inzicht geven in de temporele aard van cytokineverhoging en klinische respons op antischimmelmiddelen.

Deze procedure wordt uitgevoerd voor zowel de onderzoeksgroep als de controlegroep. De proefpersonen wordt gevraagd zich te onthouden van eten, drinken en het spoelen van de mond ten minste 2 uur voorafgaand aan de bemonstering. De sponzen worden voorbevochtigd met steriele normale zoutoplossing, in contact gehouden met de laesie zonder te wrijven of te bewegen of 1 minuut en daarna onmiddellijk opgeslagen in steriele containers bij -80 °C tot verdere analyse in Biochemie afdeling AIIMS. Een fotografisch en klinisch verslag van de plaats van het monster zal bij de proforma van de patiënt worden bewaard voor toekomstig gebruik. Deze procedure wordt op dezelfde plaats herhaald na antischimmeltherapie voor de onderzoeksgroep en er wordt een fotografisch verslag bijgehouden ter vergelijking. Ethische goedkeuring van de ethische raad van het Instituut zal worden genomen. Geïnformeerde schriftelijke toestemming zal worden verkregen en informatie over het onderzoek zal worden gegeven aan de proefpersonen en controles voorafgaand aan het verzamelen van monsters.

Schatting van IL-6-, IL-8-, IL-17- en TNFa-niveaus door ELISA De oogsponzen (Merocel) worden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur ontdooid. De sponzen worden vervolgens in een microcentrifugebuis geplaatst die een filter van 0,2 μm bevat (SpinX-centrifugebuis), geëquilibreerd door toevoeging van 300 μl extractiebuffer en gedurende 30 minuten bij 4 °C geïncubeerd, gevolgd door centrifugatie bij 4 °C gedurende 30 minuten bij 14.000 °C. toerental. Na centrifugatie zal het resulterende supernatant worden verzameld voor de schatting van IL-6-, IL-8-, IL-17- en TNFa-niveaus met behulp van de ELISA-methode met in de handel verkrijgbare kits. Het supernatant wordt tot gebruik bij -80 °C bewaard.

Een monoklonaal antilichaam tegen de antigenen (IL-6, IL-8, IL-17 en TNFa) is vooraf gecoat op de putjes van de meegeleverde microtiterstrips. Antigenen die in het monster of de standaard aanwezig zijn, worden met de platen geïncubeerd om binding van antigenen aan het antilichaam mogelijk te maken. Dit wordt gevolgd door de toevoeging van een primair monoklonaal anti-IL-6-, IL-8-, IL-17- en TNFa-antilichaam respectievelijk geconjugeerd aan biotine in respectievelijke microtiterplaten. Een avidine-HRP-geconjugeerd antilichaam dat specifiek is voor het primaire antilichaam zal vervolgens aan de putjes worden toegevoegd. Na incubatie en na een wasbeurt zal, om eventueel ongebonden antilichaam-enzymreagens te verwijderen, een TMB eenstaps-substraatreagens dat reactief is met HRP aan de putjes worden toegevoegd. De kleurontwikkeling wordt beëindigd door zuur toe te voegen en de absorptie werd gemeten bij 450 nm. Er wordt een referentiecurve verkregen door de verschillende concentraties van standaardmonsters uit te zetten tegen de absorptie, en niveaus van de antigenen in geteste monsters worden berekend aan de hand van de standaardgrafiek.

Antischimmeltherapie De onderzoeksgroep zal worden behandeld met antischimmeltherapie (Tab Fluconazol 100 mg als mondwater (tablet opgelost in 10 ml drinkwater en gedurende 2 minuten als spoelmiddel gebruikt en doorgeslikt) eenmaal daags gedurende 14 dagen). De procedure zal aan elke proefpersoon worden gedemonstreerd voordat met de behandeling wordt begonnen. Het orale branderige gevoel en de klinische kenmerken van de laesies met intraorale foto's zullen worden vastgelegd na antifungale therapie.

Statistische analyse:

De verdeling van candida-fenotypes, virulentiekenmerken en antifungale gevoeligheid in de onderzoeks- en controlegroepen zou gecorreleerd zijn met niveaus van IL-6, IL-8, IL-17 en TNFα en klinisch-pathologische kenmerken. Correlaties tussen virulentiefactoren en klinische kenmerken zullen worden bepaald. Cohens kappa-statistiek zal worden gebruikt om de intraobserver-betrouwbaarheid te bepalen. Een vergelijking van de niveaus van pro-inflammatoire cytokines (IL-6, IL-8, IL-17 en TNFα) voor en na antifungale therapie zal worden gedaan in de onderzoeksgroep. De resultaten zouden worden getest op statistische significantie. De Chi-square en de Mann-Whitney U-tests zullen worden gebruikt om de statistische significantie van het waargenomen verschil tussen de groepen te schatten.

7. Ethische toestemming verkregen