Citocinas asociadas a Candida en la leucoplasia oral

Objetivos

1. Determinar la asociación de fenotipos de candida, atributos de virulencia (aspartil proteinasas secretadas, formación de biopelículas, fosfolipasa) y sensibilidad antifúngica con características clinicopatológicas en leucoplasia oral.
2. Determinar la secreción y los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) en la leucoplasia oral antes y después de la terapia antifúngica.
3. Estudiar la correlación entre candidiasis y citoquinas proinflamatorias en leucoplasia oral con terapia antifúngica

Metodología detallada que incluye el diseño del estudio, las medidas de resultado, el tamaño de la muestra y el análisis estadístico.

Diseño del estudio:

Estudio observacional prospectivo de casos y controles

Selección de pacientes:

Los pacientes en el grupo de estudio y el grupo de control serán reclutados consecutivamente de la clínica de Radiología y Medicina Oral en el Centro de Educación e Investigación Dental AIIMS.

Tamaño de la muestra:

El estudio incluirá 60 OL (30 OL homogéneos, 30 OL no homogéneos) y 30 controles sanos

Características clinicopatológicas:

Las características clínicas y la estadificación/graduación se registrarían según el formulario preparado para cada grupo. Se tomaría el consentimiento informado por escrito antes de cualquier investigación adicional. Historia de hábitos de tabaco, nuez de betel, alcohol con frecuencia, duración del hábito y estado actual, sensación de ardor oral con puntajes de escala analógica visual (VAS) Se realizarán análisis de sangre de rutina antes de la biopsia incisional y la confirmación histopatológica del diagnóstico. Las características histopatológicas de H y E con tinción de ácido peryódico de Schiff (PAS) se registrarían y se clasificarían para el grupo de estudio según los criterios estándar de la Organización Mundial de la Salud. La estadificación clínica de la LO se realizará según el sistema de estadificación de la LO (OLEP) (van der Waal 2000) con registros fotográficos de las lesiones por parte de dos observadores calibrados. Se brindarán consejos para dejar el tabaco, la nuez de betel y el alcohol e instrucciones de higiene bucal.

Colección de muestras para estudio:

A). Estudio de fenotipos de Candida, virulencia y sensibilidad antifúngica. Recolección, transporte y procesamiento: Se tomarán dos hisopos orales de cada paciente (prehumedecidos con solución salina normal estéril) de la lesión oral y se enviarán al Laboratorio de Micología, Departamento de Microbiología para su posterior procesamiento según los procedimientos estándar de laboratorio.

Microscopía directa: una muestra de hisopo se examinará mediante microscopía para detectar células de levadura mediante la preparación de tinción de Gram.

Cultivo: El segundo hisopo se inoculará en medio Sabouraud dextrosa agar (SDA) con gentamicina y se mantendrá a 37°C para su incubación durante 48 horas. La tinción de Gram se realizará en cualquier crecimiento morfológicamente parecido al de la levadura.

Identificación fenotípica: La identificación de los aislamientos se realizó mediante tubo germinativo, morfología en agar harina de maíz, color en cloruro de trifeniltetrazolio y medio de agar CHROM Determinación de factores de virulencia de Candida spp Diversos factores de virulencia como actividad de fosfolipasa, aspartil proteinasa secretada (SAP) y biopelícula formación (BF) se determinará según el protocolo estándar.

Determinación de la actividad de fosfolipasa (PL) La actividad de fosfolipasa se medirá cultivando células en medio de agar yema de huevo y midiendo el tamaño de la zona de precipitación. Se preparará una suspensión celular de 106 células de levadura/ml en solución salina y se colocarán 5 μl en la superficie del medio de yema de huevo. Luego, el cultivo se incubará a 37°C durante 7-8 días, luego de lo cual se determinará el diámetro de la zona de precipitación alrededor de la colonia. La actividad de fosfolipasa (Pz) se medirá dividiendo el diámetro de la colonia por el diámetro de la zona de precipitación (pz) alrededor de la colonia formada en la placa. Cada aislamiento se analizará por duplicado. La cepa C. albicans SC 5314 se utilizará como control positivo.

Determinación de la actividad de la aspartil proteinasa secretada (SAP) Todos los aislados se analizarán para determinar su capacidad para crecer y producir una zona clara de hidrólisis en agar de albúmina de suero bovino (BSA). . Se colocarán 5μl de 1x106 células/ml en medio sólido y se incubarán a 37°C durante 3-4 días. Posteriormente se registrará el aclaramiento de la opacidad por hidrólisis de la albúmina precipitada. La cepa C. albicans SC 5314 se utilizará como control positivo.

Determinación de la formación de biopelícula (BF) Se colocará un volumen de 100 μl de suspensión de 1 x 106 células/ml en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano, de poliestireno estériles y se incubarán durante 48 h a 37 °C para determinar la adherencia y la biopelícula. Después de 48 h, los pocillos se lavarán con PBS y XTT detectará una medida semicualitativa de biopelícula [2,3-bis (2-metoxi-4nitro-5-sulfo-fenil) - 2H - tetra-zolio-5- ensayo de reducción de carboxanilida] Se medirá un cambio colorimétrico en el ensayo de reducción de XTT, una correlación directa de la actividad metabólica de la biopelícula, en un lector de placas de microtitulación a 490 nm después de 2 horas de incubación.

Pruebas de susceptibilidad antifúngica de los aislados La susceptibilidad antifúngica para voriconazol, fluconazol y clotrimazol se realizará mediante el método de difusión en disco según la recomendación CLSI M44-A2 sobre los aislados de levadura.

B). Estudio de citoquinas proinflamatorias Recolección de muestras de secreciones orales de la lesión Se utilizarán cuatro esponjas oftálmicas de PVA estériles (Merocel) para recolectar muestras de secreciones orales para el estudio de cuatro citoquinas proinflamatorias de la lesión oral (que no sea el sitio de la biopsia). Este es un método no invasivo y lo hace específico del sitio, lo que es una ventaja sobre otras estimaciones de suero y saliva. Además, la evaluación de los niveles locales de citoquinas a través de un muestreo longitudinal en pacientes que reciben terapia antimicótica en OL puede permitir comprender la naturaleza temporal de la elevación de citoquinas y la respuesta clínica a los antimicóticos.

Este procedimiento se realizará tanto para el grupo de estudio como para el grupo de control. Se pedirá a los sujetos que se abstengan de comer, beber y enjuagarse la boca al menos 2 horas antes de la toma de muestras. Las esponjas se humedecerán previamente con solución salina normal estéril, se mantendrán en contacto con la lesión sin frotar ni moverse durante 1 minuto y luego se almacenarán inmediatamente en recipientes estériles a -80 °C hasta su posterior análisis en el departamento de Bioquímica AIIMS. Se mantendrá un registro fotográfico y clínico del sitio de la muestra con el formulario del paciente para futuras referencias. Este procedimiento se repetirá en el mismo sitio después de la terapia antifúngica para el grupo de estudio y se mantendrá un registro fotográfico para comparación. Se tomará la autorización ética del consejo de ética del Instituto. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito y se proporcionará información sobre el estudio a los sujetos del estudio y a los controles antes de la recogida de muestras.

Estimación de los niveles de IL-6, IL-8, IL-17 y TNFα por ELISA Las esponjas oftálmicas (Merocel) se descongelarán a temperatura ambiente durante 10 min. Luego, las esponjas se insertarán en un tubo de microcentrífuga que contiene un filtro de 0,2 μm (tubo de centrífuga SpinX), se equilibrarán agregando 300 μl de tampón de extracción y se incubarán durante 30 min a 4 °C, seguido de centrifugación a 4 °C durante 30 min a 14 000 rpm. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se recolectará para la estimación de los niveles de IL-6, IL-8, IL-17 y TNFα mediante el método ELISA con kits disponibles comercialmente. El sobrenadante se almacenará a -80 °C hasta su uso.

Un anticuerpo monoclonal contra los antígenos (IL-6, IL-8, IL-17 y TNFα) se recubrió previamente en los pocillos de las tiras de microtitulación proporcionadas. Los antígenos presentes en la muestra o el estándar se incubarán con las placas para permitir la unión de los antígenos al anticuerpo. A esto le sigue la adición de un anticuerpo monoclonal primario anti-IL-6, IL-8, IL-17 y TNFα respectivamente conjugado con biotina en placas de microtitulación respectivas. A continuación, se añadirá a los pocillos un anticuerpo conjugado con avidina-HRP específico para el anticuerpo primario. Después de la incubación y después de un lavado, para eliminar cualquier reactivo de enzima de anticuerpo no unido, se agregará a los pocillos un reactivo de sustrato de un solo paso TMB reactivo con HRP. El desarrollo del color terminará agregando ácido y la absorbancia se midió a 450 nm. Se obtendrá una curva de referencia al graficar las diferentes concentraciones de las muestras estándar frente a la absorbancia y los niveles de los antígenos en las muestras analizadas se calcularán mediante su gráfico estándar.

Terapia antifúngica El grupo de estudio será tratado con terapia antifúngica ( Tab Fluconazol 100 mg como enjuague bucal ( comprimido disuelto en 10 ml de agua potable y utilizado como enjuague durante 2 minutos y tragado) una vez al día durante 14 días). El procedimiento se demostrará a cada sujeto del estudio antes de comenzar el tratamiento. Se registrará la sensación de ardor oral y las características clínicas de las lesiones con fotografías intraorales después de la terapia antifúngica.

Análisis estadístico:

La distribución de los fenotipos de candida, los atributos de virulencia y la sensibilidad antifúngica en los grupos de estudio y control estarían correlacionados con los niveles de IL-6, IL-8, IL-17 y TNFα y las características clinicopatológicas. Se determinarán las correlaciones entre los factores de virulencia y las características clínicas. Se utilizará la estadística kappa de Cohen para determinar la fiabilidad intraobservador. Se realizará una comparación de los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-6, IL-8, IL-17 y TNFα) antes y después de la terapia antifúngica en el grupo de estudio. Se probaría la significación estadística de los resultados. Se utilizarán las pruebas Chi-cuadrado y U de Mann-Whitney para estimar la significación estadística de la diferencia observada entre los grupos.

7. Autorización ética obtenida