Citochine associate alla candida nella leucoplachia orale

Obiettivi

1. Per determinare l'associazione di fenotipi di candida, attributi di virulenza (aspartil proteinasi secrete, formazione di biofilm, fosfolipasi) e sensibilità antimicotica con caratteristiche clinicopatologiche nella leucoplachia orale
2. Per determinare la secrezione e i livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) nella leucoplachia orale prima e dopo la terapia antimicotica.
3. Studiare la correlazione tra candida e citochine pro-infiammatorie nella leucoplachia orale con terapia antimicotica

Metodologia dettagliata che include il disegno dello studio, le misure dei risultati, la dimensione del campione e l'analisi statistica.

Disegno dello studio:

Studio osservazionale prospettico caso-controllo

Selezione dei pazienti:

I pazienti nel gruppo di studio e nel gruppo di controllo saranno reclutati consecutivamente dalla clinica di medicina orale e radiologia presso il Center for Dental Education & Research AIIMS.

Misura di prova:

Lo studio includerà 60 OL (30 OL omogeneo, 30 OL non omogeneo) e 30 controlli sani

Caratteristiche clinicopatologiche:

Le caratteristiche cliniche e la stadiazione/classificazione verrebbero registrate come proforma preparata per ciascun gruppo. Il consenso informato scritto sarebbe preso prima di qualsiasi ulteriore indagine. Storia di tabacco, noce di betel, abitudini alcoliche con frequenza, durata dell'abitudine e stato attuale, sensazione di bruciore orale con i punteggi della scala analogica visiva (VAS). Le caratteristiche istopatologiche H & E con colorazione Periodic Acid Schiff (PAS) verrebbero registrate e la classificazione effettuata per il gruppo di studio secondo i criteri standard dell'Organizzazione mondiale della sanità. La stadiazione clinica dell'OL sarà effettuata secondo il sistema di stadiazione dell'OL (OLEP) (van der Waal 2000) con registrazioni fotografiche delle lesioni da parte di due osservatori calibrati.

Raccolta di campioni per lo studio:

UN). Studio dei fenotipi, della virulenza e della sensibilità antimicotica della Candida. Raccolta, trasporto e trattamento: due tamponi orali da ciascun paziente (pre-inumiditi con soluzione fisiologica normale sterile) verranno prelevati dalla lesione orale e inviati al Laboratorio di micologia, Dipartimento di microbiologia per l'ulteriore elaborazione secondo le procedure di laboratorio standard.

Microscopia diretta: un campione di tampone sarà esaminato al microscopio per il rilevamento delle cellule di lievito preparando la colorazione di Gram.

Coltura: Il secondo tampone sarà inoculato su terreno Sabouraud destrosio (SDA) con gentamicina e sarà tenuto a 37°C per incubazione per 48 ore. La colorazione di Gram verrà eseguita su qualsiasi crescita morfologicamente simile a quella del lievito.

Identificazione fenotipica: l'identificazione degli isolati è stata eseguita utilizzando provette germinali, morfologia su agar farina di mais, colore su trifenil tetrazolio cloruro e terreno CHROM agar Determinazione dei fattori di virulenza di Candida spp Vari fattori di virulenza come attività fosfolipasica, aspartil proteinasi secreta (SAP) e biofilm formazione (BF) sarà determinata secondo il protocollo standard.

Determinazione dell'attività della fosfolipasi (PL) L'attività della fosfolipasi sarà misurata facendo crescere le cellule su terreno di agar tuorlo d'uovo e misurando la dimensione della zona di precipitazione. Verrà preparata una sospensione cellulare di 106 cellule di lievito/ml in soluzione fisiologica e 5μl saranno posti sulla superficie del mezzo di tuorlo d'uovo. La coltura verrà poi incubata a 37°C per 7-8 giorni, dopodiché verrà determinato il diametro della zona di precipitazione attorno alla colonia. L'attività fosfolipasica (Pz) sarà misurata dividendo il diametro della colonia per il diametro della zona di precipitazione (pz) attorno alla colonia formata sulla piastra. Ogni isolato sarà testato in duplicato. Il ceppo di C. albicans SC 5314 sarà utilizzato come controllo positivo.

Determinazione dell'attività secreta dell'aspartil proteinasi (SAP) Tutti gli isolati saranno testati per la loro capacità di crescere e produrre una zona chiara di idrolisi in agar di albumina di siero bovino (BSA). . Un 5μl di 1x106 cellule/ml sarà posto su terreno solido e sarà incubato a 37°C per 3-4 giorni. Successivamente, verrà registrato lo schiarimento dell'opacità mediante idrolisi dell'albumina precipitata. Il ceppo di C. albicans SC 5314 sarà utilizzato come controllo positivo.

Determinazione della formazione di biofilm (BF) Un volume di 100μl di 1 x 106 cellule/ml di sospensione verrà posto su piastre per microtitolazione sterili, in polistirene, a fondo piatto da 96 pozzetti e verrà incubato per 48 ore a 37°C per l'aderenza e il biofilm. Dopo 48 ore i pozzetti saranno lavati con PBS e una misura semi-qualitativa del biofilm sarà rilevata mediante XTT [2,3-bis (2-metossi-4nitro-5-sulfo-fenil) - 2H - tetra-zolio-5- carboxanilide] -reduction assay Una variazione colorimetrica nel test di XTT-reduction, una correlazione diretta dell'attività metabolica del biofilm, sarà quindi misurata in un lettore di micropiastre a 490 nm dopo 2 ore di incubazione.

Test di sensibilità antimicotica degli isolati La sensibilità antimicotica per voriconazolo, fluconazolo e clotrimazolo sarà eseguita mediante il metodo della diffusione su disco secondo la raccomandazione CLSI M44-A2 sugli isolati di lievito.

B). Studio delle citochine pro-infiammatorie Raccolta di campioni di secrezioni orali dalla lesione Quattro spugne oftalmiche sterili in PVA (Merocel) saranno utilizzate per raccogliere campioni di secrezioni orali per lo studio di quattro citochine pro-infiammatorie dalla lesione orale (diversa dal sito di biopsia). Questo è un metodo non invasivo e lo rende specifico per il sito, il che è un vantaggio rispetto ad altre stime di siero e saliva. Inoltre, la valutazione dei livelli di citochine locali tramite campionamento longitudinale in pazienti sottoposti a terapia antimicotica in OL può consentire una comprensione della natura temporale dell'elevazione delle citochine e della risposta clinica agli antimicotici.

Questa procedura verrà eseguita sia per il gruppo di studio che per il gruppo di controllo. Ai soggetti verrà chiesto di astenersi dal mangiare, bere e sciacquarsi la bocca almeno 2 ore prima del campionamento. Le spugne saranno pre-bagnate con soluzione fisiologica sterile, mantenute a contatto con la lesione senza sfregamento o movimento o 1 minuto e quindi immediatamente conservate in contenitori sterili a -80 °C fino a ulteriori analisi nel dipartimento di biochimica AIIMS. Una documentazione fotografica e clinica del sito campione sarà conservata con la proforma del paziente per future consultazioni. Questa procedura verrà ripetuta nello stesso sito dopo la terapia antimicotica per il gruppo di studio e verrà conservata una documentazione fotografica per il confronto. Verrà presa l'autorizzazione etica dal comitato etico dell'Istituto. Verrà ottenuto il consenso informato scritto e le informazioni relative allo studio verranno fornite ai soggetti dello studio e ai controlli prima della raccolta del campione.

Stima dei livelli di IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα mediante ELISA Le spugne oftalmiche (Merocel) saranno scongelate a temperatura ambiente per 10 min. Le spugne verranno quindi inserite in una provetta da microcentrifuga contenente un filtro da 0,2 μm (provetta da centrifuga SpinX), equilibrata aggiungendo 300 μl di tampone di estrazione e incubate per 30 min a 4 °C, seguita da centrifugazione a 4 °C per 30 min a 14.000 giri/min. Dopo la centrifugazione, il surnatante risultante sarà raccolto per la stima dei livelli di IL-6, IL-8, IL-17 e TNFa mediante metodo ELISA con kit disponibili in commercio. Il supernatante sarà conservato a -80 °C fino al momento dell'uso.

Un anticorpo monoclonale contro gli antigeni (IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα) è stato pre-rivestito sui pozzetti delle strisce di microtitolazione fornite. Gli antigeni presenti nel campione o standard saranno incubati con le piastre per consentire il legame degli antigeni all'anticorpo. Segue l'aggiunta di un anticorpo monoclonale primario anti-IL-6, IL-8, IL-17 e TNFa rispettivamente coniugato con biotina nelle rispettive piastre di microtitolazione. Verrà quindi aggiunto ai pozzetti un anticorpo coniugato avidina-HRP specifico per l'anticorpo primario. Dopo l'incubazione e dopo un lavaggio, per rimuovere qualsiasi reagente enzimatico anticorpo non legato, verrà aggiunto ai pozzetti un reagente substrato TMB one-step reattivo con HRP. Lo sviluppo del colore sarà terminato aggiungendo acido e l'assorbanza è stata misurata a 450 nm. Una curva di riferimento sarà ottenuta tracciando le diverse concentrazioni di campioni standard rispetto all'assorbanza e i livelli degli antigeni nei campioni testati saranno calcolati dal suo grafico standard.

Terapia antifungina Il gruppo di studio sarà trattato con terapia antifungina (Tab Fluconazolo 100 mg come collutorio (compressa sciolta in 10 ml di acqua da bere e utilizzata come risciacquo per 2 minuti e deglutita) una volta al giorno per 14 giorni). La procedura sarà dimostrata a ciascun soggetto dello studio prima di iniziare il trattamento. La sensazione di bruciore orale e le caratteristiche cliniche delle lesioni con fotografie intraorali saranno registrate dopo la terapia antimicotica.

Analisi statistica:

La distribuzione dei fenotipi di candida, degli attributi di virulenza e della sensibilità antifungina nei gruppi di studio e di controllo sarebbe correlata con i livelli di IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα e le caratteristiche clinicopatologiche. Verranno determinate le correlazioni tra fattori di virulenza e caratteristiche cliniche. La statistica kappa di Cohens verrà utilizzata per determinare l'affidabilità intraosservatore. Nel gruppo di studio verrà effettuato un confronto dei livelli di citochine proinfiammatorie (IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα) prima e dopo la terapia antimicotica. I risultati verrebbero testati per la significatività statistica. I test Chi-quadrato e U di Mann-Whitney saranno utilizzati per stimare la significatività statistica della differenza osservata tra i gruppi.

7. Autorizzazione etica ottenuta