Candida-assoziierte Zytokine bei oraler Leukoplakie

Ziele

1. Bestimmung der Assoziation von Candida-Phänotypen, Virulenzattributen (Sekretierte Aspartyl-Proteinasen, Biofilmbildung, Phospholipase) und Antimykotika-Empfindlichkeit mit klinisch-pathologischen Merkmalen bei oraler Leukoplakie
2. Zur Bestimmung der Sekretion und der Spiegel proinflammatorischer Zytokine (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) bei oraler Leukoplakie vor und nach antimykotischer Therapie.
3. Es sollte die Korrelation zwischen Candida und entzündungsfördernden Zytokinen bei oraler Leukoplakie mit antimykotischer Therapie untersucht werden

Detaillierte Methodik einschließlich Studiendesign, Ergebnismessungen, Stichprobengröße und statistische Analyse.

Studiendesign:

Prospektive Fall-Kontroll-Beobachtungsstudie

Auswahl der Patienten:

Die Patienten in der Studiengruppe und der Kontrollgruppe werden nacheinander aus der Oral Medicine & Radiology Clinic am Center for Dental Education & Research AIIMS rekrutiert.

Probengröße:

Die Studie umfasst 60 OL (30 homogene OL, 30 nicht-homogene OL) und 30 gesunde Kontrollpersonen

Klinisch-pathologische Merkmale:

Die klinischen Merkmale und die Einstufung/Einstufung würden gemäß dem vorbereiteten Formular für jede Gruppe aufgezeichnet. Vor jeder weiteren Untersuchung würde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Vorgeschichte von Tabak, Betelnuss, Alkoholgewohnheiten mit Häufigkeit, Dauer der Gewohnheit und aktuellem Status, orales Brennen mit visuellen Analogskalen (VAS)-Scores werden routinemäßige Blutuntersuchungen durchgeführt, bevor eine Inzisionsbiopsie und histopathologische Bestätigung der Diagnose durchgeführt werden. Die histopathologischen Merkmale von H & E mit Periodic Acid Schiff (PAS)-Färbung würden aufgezeichnet und für die Studiengruppe gemäß den Standardkriterien der Weltgesundheitsorganisation eingestuft. Die klinische Einstufung von OL erfolgt gemäß dem OL-Einstufungssystem (OLEP) (van der Waal 2000) mit fotografischen Aufzeichnungen von Läsionen durch zwei kalibrierte Beobachter. Tabak-, Betelnuss- und Alkoholentwöhnungsberatung und Anweisungen zur Mundhygiene werden gegeben.

Probensammlung zum Studium:

A). Studie zu Candida-Phänotypen, Virulenz und antimykotischer Empfindlichkeit. Entnahme, Transport und Verarbeitung: Von jedem Patienten werden zwei Mundabstriche (vorbenetzt mit steriler physiologischer Kochsalzlösung) aus der oralen Läsion entnommen und zur weiteren Verarbeitung gemäß Standardlaborverfahren an das Mykologische Labor, Abteilung für Mikrobiologie, geschickt.

Direktmikroskopie: Eine Abstrichprobe wird mikroskopisch auf den Nachweis von Hefezellen untersucht, indem eine Gram-Färbung hergestellt wird.

Kultur: Der zweite Tupfer wird auf Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA)-Medium mit Gentamicin inokuliert und für 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Gram-Färbung wird an jedem Wachstum durchgeführt, das morphologisch dem von Hefe ähnelt.

Phänotypische Identifizierung: Die Identifizierung der Isolate erfolgte anhand von Keimröhrchen, Morphologie auf Maismehlagar, Farbe auf Triphenyltetrazoliumchlorid und CHROM-Agarmedium. Bestimmung der Virulenzfaktoren von Candida spp. Verschiedene Virulenzfaktoren wie Phospholipaseaktivität, sekretierte Aspartylproteinase (SAP) und Biofilm Formation (BF) wird nach dem Standardprotokoll bestimmt.

Bestimmung der Phospholipase (PL)-Aktivität Die Phospholipase-Aktivität wird gemessen, indem Zellen auf Eigelb-Agarmedium gezüchtet und die Größe der Präzipitationszone gemessen wird. Eine Zellsuspension von 106 Hefezellen/ml in Kochsalzlösung wird hergestellt und 5 μl werden auf die Oberfläche des Eigelbmediums gegeben. Die Kultur wird dann 7-8 Tage bei 37°C inkubiert, wonach der Durchmesser der Präzipitationszone um die Kolonie bestimmt wird. Die Phospholipase-Aktivität (Pz) wird gemessen, indem der Koloniedurchmesser durch den Durchmesser der Präzipitationszone (pz) um die auf der Platte gebildete Kolonie geteilt wird. Jedes Isolat wird doppelt getestet. Als positive Kontrolle wird der Stamm C. albicans SC 5314 verwendet.

Bestimmung der Aktivität der sezernierten Aspartylproteinase (SAP) Alle Isolate werden auf ihre Fähigkeit getestet, in Rinderserumalbumin (BSA)-Agar zu wachsen und eine klare Hydrolysezone zu erzeugen. . 5 μl von 1 x 106 Zellen/ml werden auf festes Medium gegeben und 3–4 Tage bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird die Aufhebung der Opazität durch Hydrolyse von ausgefälltem Albumin aufgezeichnet. Als positive Kontrolle wird der Stamm C. albicans SC 5314 verwendet.

Bestimmung der Biofilmbildung (BF) Ein 100-μl-Volumen von 1 x 106 Zellen/ml-Suspension wird auf sterile Polystyrol-Flachboden-96-Well-Mikrotiterplatten gegeben und 48 h bei 37 °C für Anhaftung und Biofilm inkubiert. Nach 48 Stunden werden die Wells mit PBS gewaschen und eine semiqualitative Messung des Biofilms wird durch XTT nachgewiesen [2,3-bis (2-methoxy-4nitro-5-sulfo-phenyl) - 2H - tetra-zolium-5- Carboxanilid]-Reduktionsassay Eine kolorimetrische Änderung im XTT-Reduktionsassay, eine direkte Korrelation der metabolischen Aktivität des Biofilms, wird dann in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 490 nm nach 2 h Inkubation gemessen.

Antimykotische Empfindlichkeitstests von Isolaten Die antimykotische Empfindlichkeit für Voriconazol, Fluconazol und Clotrimazol wird mit der Scheibendiffusionsmethode gemäß der CLSI M44-A2-Empfehlung an den Hefeisolaten durchgeführt.

B). Studie zu entzündungsfördernden Zytokinen Probenentnahme von oralen Sekreten aus der Läsion Vier sterile PVA-Augenschwämme (Merocel) werden verwendet, um Proben von oralen Sekreten für vier Studien zu entzündungsfördernden Zytokinen aus der oralen Läsion (außer der Biopsiestelle) zu entnehmen. Dies ist eine nicht-invasive Methode und macht sie ortsspezifisch, was einen Vorteil gegenüber anderen Serum- und Speichelschätzungen darstellt. Darüber hinaus kann die Beurteilung der lokalen Zytokinspiegel durch Längsschnittproben bei Patienten, die sich einer Antimykotikatherapie bei OL unterziehen, ein Verständnis der zeitlichen Natur der Zytokinerhöhung und des klinischen Ansprechens auf Antimykotika ermöglichen.

Dieses Verfahren wird sowohl für die Studiengruppe als auch für die Kontrollgruppe durchgeführt. Die Probanden werden gebeten, mindestens 2 Stunden vor der Probenahme auf Essen, Trinken und Mundspülung zu verzichten. Die Schwämme werden mit steriler normaler Kochsalzlösung vorbefeuchtet, ohne Reiben oder Bewegen oder 1 Minute lang in Kontakt mit der Läsion gehalten und dann sofort in sterilen Behältern bei -80 °C bis zur weiteren Analyse in der Biochemieabteilung AIIMS gelagert. Eine fotografische und klinische Aufzeichnung der Probenstelle wird zusammen mit dem Patienten-Formular zur späteren Bezugnahme aufbewahrt. Dieses Verfahren wird nach der antimykotischen Therapie für die Studiengruppe an derselben Stelle wiederholt, und es wird eine fotografische Aufzeichnung zum Vergleich aufbewahrt. Es wird eine ethische Freigabe von der Ethikkommission des Instituts eingeholt. Eine schriftliche Zustimmung nach Aufklärung wird eingeholt und Informationen über die Studie werden den Studienteilnehmern und Kontrollen vor der Probenentnahme gegeben.

Abschätzung der IL-6-, IL-8-, IL-17- und TNFα-Spiegel durch ELISA Die Augenschwämme (Merocel) werden bei Raumtemperatur 10 Minuten lang aufgetaut. Die Schwämme werden dann in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem 0,2-μm-Filter (SpinX-Zentrifugenröhrchen) eingeführt, durch Zugabe von 300 μl Extraktionspuffer äquilibriert und 30 min bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer 30-minütigen Zentrifugation bei 4 °C bei 14.000 U/min. Nach der Zentrifugation wird der resultierende Überstand zur Bestimmung der IL-6-, IL-8-, IL-17- und TNFα-Spiegel durch das ELISA-Verfahren mit im Handel erhältlichen Kits gesammelt. Der Überstand wird bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

Die Vertiefungen der mitgelieferten Mikrotiterstreifen wurden mit einem monoklonalen Antikörper gegen die Antigene (IL-6, IL-8, IL-17 und TNFα) vorbeschichtet. In der Probe oder im Standard vorhandene Antigene werden mit den Platten inkubiert, um die Bindung von Antigenen an den Antikörper zu ermöglichen. Darauf folgt die Zugabe eines primären monoklonalen Anti-IL-6-, IL-8-, IL-17- und TNFα-Antikörpers, jeweils konjugiert an Biotin, in entsprechenden Mikrotiterplatten. Den Vertiefungen wird dann ein Avidin-HRP-konjugierter Antikörper hinzugefügt, der für den Primärantikörper spezifisch ist. Nach der Inkubation und nach einem Waschgang wird zur Entfernung von ungebundenem Antikörper-Enzymreagenz ein mit HRP reaktives TMB-Ein-Schritt-Substratreagenz in die Vertiefungen gegeben. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von Säure beendet und die Extinktion bei 450 nm gemessen. Eine Referenzkurve wird erhalten, indem die verschiedenen Konzentrationen von Standardproben gegen die Extinktion aufgetragen werden, und die Konzentrationen der Antigene in den getesteten Proben werden anhand ihrer Standardkurve berechnet.

Antimykotische Therapie Die Studiengruppe wird mit einer antimykotischen Therapie behandelt (Tab Fluconazol 100 mg als Mundspülung (Tablette in 10 ml Trinkwasser aufgelöst und 2 Minuten lang als Spülung verwendet und geschluckt) einmal täglich für 14 Tage). Das Verfahren wird jedem Studienteilnehmer vor Beginn der Behandlung demonstriert. Das orale Brennen und die klinischen Merkmale der Läsionen mit intraoralen Fotografien werden nach der antimykotischen Therapie aufgezeichnet.

Statistische Analyse:

Die Verteilung von Candida-Phänotypen, Virulenzattributen und Antimykotika-Empfindlichkeit in den Studien- und Kontrollgruppen würde mit den Spiegeln von IL-6, IL-8, IL-17 und TNFα und klinisch-pathologischen Merkmalen korreliert. Korrelationen zwischen Virulenzfaktoren und klinischen Merkmalen werden ermittelt. Die Cohens-Kappa-Statistik wird verwendet, um die Intraobserver-Zuverlässigkeit zu bestimmen. In der Studiengruppe wird ein Vergleich der Spiegel entzündungsfördernder Zytokine (IL-6, IL-8, IL-17 und TNFα) vor und nach einer antimykotischen Therapie durchgeführt. Die Ergebnisse werden auf statistische Signifikanz getestet. Der Chi-Quadrat- und der Mann-Whitney-U-Test werden verwendet, um die statistische Signifikanz der zwischen den Gruppen beobachteten Unterschiede abzuschätzen.

7.Ethische Freigabe erhalten