Candidaan liittyvät sytokiinit suun leukoplakiassa

Tavoitteet

1. Candida-fenotyyppien, virulenssiominaisuuksien (erittyneet aspartyyliproteinaasit, biofilmin muodostus, fosfolipaasi) ja sienilääkkeiden herkkyyden ja klinikopatologisten ominaisuuksien yhteys suun leukoplakiassa
2. Proinflammatoristen sytokiinien (IL-6, IL-8) erityksen ja tasojen määrittämiseksi. IL-17, TNFa) suun leukoplakiassa ennen sienilääkitystä ja sen jälkeen.
3. Tutkia candidan ja tulehdusta edistävien sytokiinien välistä korrelaatiota suun leukoplakiassa sienilääkkeillä

Yksityiskohtainen metodologia, mukaan lukien tutkimuksen suunnittelu, tulosmittaukset, otoskoko ja tilastollinen analyysi.

Opintojen suunnittelu:

Prospektiivinen tapaus-kontrolli havaintotutkimus

Potilaiden valinta:

Tutkimusryhmän ja kontrolliryhmän potilaat rekrytoidaan peräkkäin Center for Dental Education & Research AIIMS:n suun lääketieteen ja radiologian klinikalta.

Otoskoko:

Tutkimukseen kuuluu 60 OL (30 homogeenista OL, 30 ei-homogeenistä OL) ja 30 tervettä kontrollia

Kliiniset ominaisuudet:

Kliiniset ominaisuudet ja vaiheet/luokittelu kirjataan kunkin ryhmän valmistetun esikuvan mukaisesti. Kirjallinen tietoinen suostumus otetaan ennen lisätutkimuksia. Tupakka, betelpähkinä, alkoholitottumukset ja esiintymistiheys, tottumuksen kesto ja nykyinen tila, suun polttava tunne Visual Analogue Scale (VAS) -pisteillä. Rutiininomaiset verikokeet tehdään ennen leikkausbiopsiaa ja diagnoosin histopatologista vahvistusta. H & E histopatologiset piirteet Periodic Acid Schiff (PAS) -värjäyksellä kirjataan ja luokitus tehdään tutkimusryhmälle Maailman terveysjärjestön standardikriteerien mukaisesti. OL:n kliininen staging tehdään OL-vaiheen määritysjärjestelmän (OLEP) (van der Waal 2000) mukaisesti kahden kalibroidun tarkkailijan valokuvakirjoilla leesioista. Tupakka-, betelpähkinä- ja alkoholin lopettamisneuvontaa ja suun hygieniaohjeita annetaan.

Näytekokoelma tutkimukseen:

A). Candida-fenotyypit, virulenssi ja sienilääkkeiden herkkyystutkimus. Keräys, kuljetus ja käsittely: Jokaiselta potilaalta otetaan kaksi vanupuikkoa (esikostutettu steriilillä normaalilla suolaliuoksella) suuvauriosta ja lähetetään Mykologian laboratorioon, Mikrobiologian osastolle jatkokäsittelyä varten tavanomaisten laboratoriomenetelmien mukaisesti.

Suora mikroskopia: Yksi vanupuikkonäyte tutkitaan mikroskoopilla hiivasolujen havaitsemiseksi valmistamalla gramvärjäys.

Viljely: Toinen vanupuikko siirrostetaan Sabouraud dekstroosiagar (SDA) -elatusaineeseen gentamysiinillä ja sitä pidetään 37 °C:ssa inkubaatiota varten 48 tunnin ajan. Gram-värjäys suoritetaan mille tahansa kasvulle, joka morfologisesti muistuttaa hiivaa.

Fenotyyppinen tunnistus: Isolaattien tunnistus suoritettiin käyttämällä ituputkea, morfologiaa maissijauho-agarilla, väriä trifenyylitetratsoliumkloridilla ja CHROM-agar-elatusaineella. Candida spp:n virulenssitekijöiden määrittäminen. muodostuminen (BF) määritetään standardiprotokollan mukaisesti.

Fosfolipaasin (PL) aktiivisuuden määrittäminen Fosfolipaasin aktiivisuus mitataan kasvattamalla soluja munankeltuaisen agar-elatusaineella ja mittaamalla saostumisvyöhykkeen koko. Valmistetaan solususpensio, jossa on 106 hiivasolua/ml suolaliuoksessa, ja 5 μl asetetaan munankeltuaisen alustan pinnalle. Viljelmää inkuboidaan sitten 37 °C:ssa 7-8 päivää, minkä jälkeen määritetään pesäkkeen ympärillä olevan saostumisvyöhykkeen halkaisija. Fosfolipaasin aktiivisuus (Pz) mitataan jakamalla pesäkkeen halkaisija levylle muodostuneen pesäkkeen ympärillä olevan saostumisvyöhykkeen (pz) halkaisijalla. Jokainen isolaatti testataan kahtena kappaleena. C. albicans SC 5314 -kantaa käytetään positiivisena kontrollina.

Eritetyn aspartyyliproteinaasin (SAP) aktiivisuuden määrittäminen Kaikkien isolaattien kyky kasvaa ja tuottaa selkeää hydrolyysialuetta naudan seerumialbumiiniagarissa (BSA) testataan. . 5 μl 1x106 solua/ml asetetaan kiinteälle alustalle ja inkuboidaan 37 °C:ssa 3-4 päivää. Tämän jälkeen rekisteröidään saostuneen albumiinin opasiteetin poistaminen hydrolyysillä. C. albicans SC 5314 -kantaa käytetään positiivisena kontrollina.

Biofilmin muodostumisen (BF) määritys 100 μl:n tilavuus 1 x 106 solua/ml suspensiota asetetaan steriileille, polystyreenisille tasapohjaisille 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille ja inkuboidaan 48 tuntia 37 °C:ssa kiinnittymisen ja biofilmin saamiseksi. 48 tunnin kuluttua kuopat pestään PBS:llä ja biofilmin puolikvalitatiivinen mitta havaitaan XTT:llä [2,3-bis(2-metoksi-4nitro-5-sulfo-fenyyli)-2H-tetra-tsolium-5- karboksanilidi]-pelkistysmääritys Kolorimetrinen muutos XTT-pelkistysmäärityksessä, joka on suora korrelaatio biofilmin metabolisen aktiivisuuden välillä, mitataan sitten mikrotiitterilevynlukijassa 490 nm:ssä 2 tunnin inkubaation jälkeen.

Isolaattien antifungaalisen herkkyyden testaus Flukonatsolin ja klotrimatsolin sienilääkkeiden herkkyys tehdään levydiffuusiomenetelmällä CLSI M44-A2 -suosituksen mukaisesti hiiva-isolaateille.

B). Pro-inflammatoriset sytokiinit -tutkimus Näytteenotto vauriosta suun eritteistä Neljää steriiliä PVA-silmäsientä (Merocel) käytetään näytteiden keräämiseen suun eritteistä neljää tulehdusta edistävää sytokiinitutkimusta varten suuvauriosta (muu kuin biopsiakohta). Tämä on ei-invasiivinen menetelmä ja tekee siitä paikkaspesifisen, mikä on etu muihin seerumin ja syljen arvioihin verrattuna. Lisäksi paikallisten sytokiinitasojen arviointi pitkittäisnäytteenoton avulla potilailla, jotka saavat sienilääkehoitoa OL:ssa, voi auttaa ymmärtämään sytokiinien nousun ja kliinisen vasteen ajallista luonnetta sienilääkkeille.

Tämä menettely tehdään sekä tutkimusryhmälle että kontrolliryhmälle. Koehenkilöitä pyydetään pidättäytymään syömästä, juomasta ja huuhtelemasta suu vähintään 2 tuntia ennen näytteenottoa. Sienet esikostutetaan steriilillä normaalilla suolaliuoksella, pidetään kosketuksissa leesion kanssa hankaamatta tai liikuttamatta tai 1 minuutin ajan ja säilytetään sitten välittömästi steriileissä astioissa -80 °C:ssa jatkoanalyysiin asti biokemian osastolla AIIMS. Näytteenottopaikan valokuva- ja kliininen tallenne säilytetään potilaan esikuvan mukana tulevaa käyttöä varten. Tämä toimenpide toistetaan samassa paikassa antifungaalisen hoidon jälkeen tutkimusryhmälle ja valokuvaus tallennetaan vertailua varten. Instituutin eettiseltä lautakunnalta otetaan eettinen hyväksyntä. Tietoihin perustuva kirjallinen suostumus hankitaan ja tutkimusta koskevat tiedot annettaisiin tutkittaville ja kontrolleille ennen näytteenottoa.

IL-6-, IL-8-, IL-17- ja TNFa-tasojen arviointi ELISA:lla Oftalmiset sienet (Merocel) sulatetaan huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan. Sienet asetetaan sitten mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää 0,2 μm:n suodattimen (SpinX-sentrifugiputki), tasapainotetaan lisäämällä 300 μl uuttopuskuria ja inkuboidaan 30 minuuttia 4 °C:ssa, minkä jälkeen sentrifugoidaan 4 °C:ssa 30 minuuttia 14 000:ssa. rpm. Sentrifugoinnin jälkeen tuloksena oleva supernatantti kerätään IL-6-, IL-8-, IL-17- ja TNFa-tasojen arvioimiseksi ELISA-menetelmällä kaupallisesti saatavilla olevilla pakkauksilla. Supernatantti säilytetään -80 °C:ssa käyttöön asti.

Monoklonaalinen vasta-aine antigeenejä (IL-6, IL-8, IL-17 ja TNFa) vastaan ​​on esipäällystetty toimitettujen mikrotiitteriliuskojen kuoppiin. Näytteessä tai standardissa olevia antigeenejä inkuboidaan levyjen kanssa, jotta antigeenit voivat sitoutua vasta-aineeseen. Tätä seuraa primaarisen monoklonaalisen anti-IL-6-, IL-8-, IL-17- ja TNFa-vasta-aineen lisääminen, joka on vastaavasti konjugoitu biotiiniin vastaaville mikrotiitterilevyille. Tämän jälkeen kuoppiin lisätään primaariselle vasta-aineelle spesifinen avidiini-HRP-konjugoitu vasta-aine. Inkubaation ja pesun jälkeen kuoppiin lisätään HRP:n kanssa reagoiva yksivaiheinen TMB-substraattireagenssi sitoutumattoman vasta-aineentsyymireagenssin poistamiseksi. Värin kehittyminen lopetetaan lisäämällä happoa ja absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä. Vertailukäyrä saadaan piirtämällä standardinäytteiden eri pitoisuudet absorbanssin funktiona, ja testattujen näytteiden antigeenien tasot lasketaan sen standardikäyrällä.

Sienilääkitys Tutkimusryhmää hoidetaan sienilääkkeillä (Tab Fluconazole 100 mg suuveteenä (tabletti liuotettuna 10 ml:aan juomavettä ja huuhteluaineena 2 minuutin ajan ja nieltynä) kerran päivässä 14 päivän ajan). Toimenpide esitellään jokaiselle tutkittavalle ennen hoidon aloittamista. Suun polttava tunne ja leesioiden kliiniset ominaisuudet suunsisäisillä valokuvilla tallennetaan antifungaalisen hoidon jälkeen.

Tilastollinen analyysi:

Candida-fenotyyppien jakauma, virulenssiattribuutit ja sienilääkkeiden herkkyys tutkimus- ja kontrolliryhmissä korreloisivat IL-6:n, IL-8:n, IL-17:n ja TNFa:n tasojen ja kliiniset patologisten ominaisuuksien kanssa. Virulenssitekijöiden ja kliinisten ominaisuuksien väliset korrelaatiot määritetään. Cohens kappa -tilastoa käytetään palvelimen sisäisen luotettavuuden määrittämiseen. Tutkimusryhmässä tehdään tulehdusta edistävien sytokiinien (IL-6, IL-8, IL-17 ja TNFa) tasojen vertailu ennen sienilääkitystä ja sen jälkeen. Tulokset testattaisiin tilastollisen merkitsevyyden suhteen. Ryhmien välillä havaittujen erojen tilastollista merkitsevyyttä arvioitaessa käytetään Chiquar- ja Mann-Whitney U -testejä.

7. Eettinen hyväksyntä saatu