Candida associerede cytokiner i oral leukoplakia

Mål

1. For at bestemme associationen af ​​candida-fænotyper, virulensattributter (udskilte aspartylproteinaser, biofilmdannelse, phospholipase) og svampedræbende følsomhed med klinikopatologiske karakteristika i oral leukoplaki
2. For at bestemme sekretion og niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner (IL-6, IL-8. IL-17, TNFa) i oral leukoplaki før og efter antifungal terapi.
3. At studere sammenhængen mellem candida og pro-inflammatoriske cytokiner i oral leukoplaki med antifungal terapi

Detaljeret metodologi, herunder undersøgelsesdesign, resultatmål, stikprøvestørrelse og statistisk analyse.

Studere design:

Prospektiv case-kontrol observationsundersøgelse

Udvalg af patienter:

Patienterne i undersøgelsesgruppen og kontrolgruppen vil blive rekrutteret fortløbende fra Oral Medicine & Radiology clinic på Center for Dental Education & Research AIIMS.

Prøvestørrelse:

Undersøgelsen vil omfatte 60 OL (30 homogene OL, 30 ikke-homogene OL) og 30 sunde kontroller

Klinisk patologiske karakteristika:

De kliniske karakteristika og iscenesættelse/klassificering vil blive registreret i henhold til udarbejdet proforma for hver gruppe. Skriftligt informeret samtykke vil blive taget før enhver yderligere undersøgelse. Anamnese med tobak, betelnød, alkoholvaner med hyppighed, varighed af vane og nuværende status, oral brændende fornemmelse med Visual Analogue Scale (VAS)-score vil være Rutinemæssige blodundersøgelser vil blive udført før incisionsbiopsi og histopatologisk bekræftelse af diagnosen. De H&E-histopatologiske træk med Periodic Acid Schiff (PAS)-farvning vil blive registreret og klassificeret for undersøgelsesgruppen i henhold til Verdenssundhedsorganisationens standardkriterier. Den kliniske iscenesættelse af OL vil blive udført i henhold til OL iscenesættelsessystem (OLEP) (van der Waal 2000) med fotografiske registreringer af læsioner af to kalibrerede observatører. Rådgivning om ophør af tobak, betelnød og alkohol og mundhygiejneinstruktioner vil blive givet.

Prøvesamling til undersøgelse:

EN). Candida fænotyper, virulens og antifungal følsomhed undersøgelse. Indsamling, transport og behandling: To orale podninger fra hver patient (for-våde med sterilt normalt saltvand) tages fra den orale læsion og sendes til Mykologisk Laboratorium, Mikrobiologisk Afdeling til yderligere behandling i henhold til standard laboratorieprocedurer.

Direkte mikroskopi: En podningsprøve vil blive undersøgt ved mikroskopi for påvisning af gærceller ved at forberede gramfarvning.

Dyrkning: Den anden podning inokuleres på Sabouraud dextrose agar (SDA) medium med gentamicin og vil blive opbevaret ved 37°C til inkubation i 48 timer. Gram-farvning vil blive udført på enhver vækst, der morfologisk ligner den for gær.

Fænotypisk identifikation: Identifikation af isolater blev udført ved brug af kimrør, morfologi på majsmel-agar, farve på triphenyltetrazoliumchlorid og CHROM-agarmedium Bestemmelse af virulensfaktorer for Candida spp. Forskellige virulensfaktorer som phospholipaseaktivitet, udskilt aspartylproteinase (SAP) og dannelse (BF) vil blive bestemt i henhold til standardprotokollen.

Bestemmelse af phospholipase (PL) aktivitet Phospholipase aktivitet vil blive målt ved at dyrke celler på æggeblomme agar medium og måle størrelsen af ​​nedbørszonen. En cellesuspension på 106 gærceller/ml i saltvand vil blive klargjort, og 5μl vil blive placeret på overfladen af ​​æggeblommemediet. Kulturen inkuberes derefter ved 37°C i 7-8 dage, hvorefter diameteren af ​​nedbørszonen omkring kolonien bestemmes. Phospholipaseaktivitet (Pz) vil blive målt ved at dividere kolonidiameteren med diameteren af ​​udfældningszonen (pz) omkring kolonien dannet på pladen. Hvert isolat vil blive testet i to eksemplarer. C. albicans SC 5314-stammen vil blive brugt som positiv kontrol.

Bestemmelse af udskilt aspartylproteinase (SAP) aktivitet Alle isolater vil blive testet for deres evne til at vokse og producere en klar hydrolysezone i bovint serumalbumin (BSA) agar. . En 5μl 1x106 celler/ml vil blive placeret på fast medium og vil blive inkuberet ved 37°C i 3-4 dage. Efterfølgende vil rensning af opaciteten ved hydrolyse af udfældet albumin blive registreret. C. albicans SC 5314-stammen vil blive brugt som positiv kontrol.

Bestemmelse af biofilmdannelse (BF) En 100 μl volumen på 1 x 106 celler/ml suspension placeres på sterile, polystyren, fladbundede 96-brønds mikrotiterplader og inkuberes i 48 timer ved 37°C for vedhæftning og biofilm. Efter 48 timer vil brøndene blive vasket med PBS, og et semikvalitativt mål for biofilm vil blive detekteret af XTT [2,3-bis (2-methoxy-4nitro-5-sulfo-phenyl) - 2H - tetra-zolium-5- carboxanilid] -reduktionsassay En kolorimetrisk ændring i XTT-reduktionsanalysen, en direkte korrelation af biofilmens metaboliske aktivitet, vil derefter blive målt i en mikrotiterpladelæser ved 490 nm efter 2 timers inkubation.

Antifungal modtagelighedstest af isolater Antifungal modtagelighed for voriconazol fluconazol og clotrimazol vil blive udført ved diskdiffusionsmetode i henhold til CLSI M44-A2-anbefalingen på gærisolaterne.

B). Pro-inflammatoriske cytokiner undersøgelse Prøveindsamling af orale sekreter fra læsion Fire sterile PVA oftalmiske svampe (Merocel) vil blive brugt til at indsamle prøver af orale sekreter til fire pro-inflammatoriske cytokinundersøgelser fra den orale læsion (bortset fra biopsistedet). Dette er en ikke-invasiv metode og gør den stedspecifik, hvilket er en fordel i forhold til andre serum- og spytvurderinger. Derudover kan vurdering af lokale cytokinniveauer via langsgående prøvetagning hos patienter, der gennemgår antifungal terapi i OL, give mulighed for en forståelse af den tidsmæssige karakter af cytokinstigning og klinisk respons på antimykotika.

Denne procedure vil blive udført for både undersøgelsesgruppen og kontrolgruppen. Forsøgspersonerne vil blive bedt om at afholde sig fra at spise, drikke og skylle munden mindst 2 timer før prøvetagning. Svampene vil være forvåde med sterilt normalt saltvand, holdes i kontakt med læsionen uden gnidning eller bevægelse eller 1 minut og derefter straks opbevaret i sterile beholdere ved -80 °C indtil videre analyse i Biokemisk afdeling AIIMS. En fotografisk og klinisk registrering af prøvestedet vil blive opbevaret sammen med patientproformaen til fremtidig reference. Denne procedure vil blive gentaget på samme sted efter svampedræbende terapi for studiegruppen, og en fotografisk registrering vil blive opbevaret til sammenligning. Der vil blive taget etisk godkendelse fra Instituttets etiske bestyrelse. Der vil blive indhentet informeret skriftligt samtykke, og oplysninger om undersøgelsen vil blive givet til forsøgspersonerne og kontrollerne forud for prøveindsamling.

Estimering af IL-6, IL-8, IL-17 og TNFa niveauer ved ELISA. De oftalmiske svampe (Merocel) vil blive optøet ved stuetemperatur i 10 min. Svampe vil derefter blive indsat i et mikrocentrifugerør indeholdende et 0,2 μm filter (SpinX centrifugerør), ækvilibreret ved at tilsætte 300 μl ekstraktionsbuffer og inkuberet i 30 minutter ved 4 °C, efterfulgt af centrifugering ved 4 °C i 30 minutter ved 14.000. rpm. Efter centrifugering vil den resulterende supernatant blive opsamlet til estimering af IL-6-, IL-8-, IL-17- og TNFa-niveauer ved ELISA-metoden med kommercielt tilgængelige kits. Supernatanten vil blive opbevaret ved -80 °C indtil brug.

Et monoklonalt antistof mod antigenerne (IL-6, IL-8, IL-17 og TNFa) er blevet præcoatet på brøndene i de medfølgende mikrotiterstrimler. Antigener til stede i prøven eller standarden vil blive inkuberet med pladerne for at tillade binding af antigener til antistoffet. Dette efterfølges af tilføjelsen af ​​et primært monoklonalt anti-IL-6-, IL-8-, IL-17- og TNFa-antistof, der er konjugeret til biotin i respektive mikrotiterplader. Et avidin-HRP-konjugeret antistof specifikt for primært antistof vil derefter blive tilføjet til brøndene. Efter inkubation og efter en vask vil et TMB et-trins substratreagens, der er reaktivt med HRP, blive tilsat til brøndene for at fjerne ubundet antistofenzymreagens. Farveudviklingen vil blive afsluttet ved tilsætning af syre, og absorbansen blev målt ved 450 nm. En referencekurve vil blive opnået ved at plotte de forskellige koncentrationer af standardprøver versus absorbans, og niveauer af antigenerne i de testede prøver vil blive beregnet ved hjælp af standardplot.

Antifungal terapi Studiegruppen vil blive behandlet med svampedræbende terapi ( Tab Fluconazol 100 mg som mundskyl ( tablet opløst i 10 ml drikkevand og brugt som skylning i 2 minutter og synket) en gang dagligt i 14 dage). Proceduren vil blive demonstreret for hvert forsøgsperson, før behandlingen påbegyndes. Den orale brændende fornemmelse og kliniske karakteristika af læsionerne med intraorale fotografier vil blive registreret efter antifungal terapi.

Statistisk analyse:

Fordelingen af ​​candida-fænotyper, virulensegenskaber og svampedræbende følsomhed i undersøgelses- og kontrolgrupperne ville være korreleret med niveauer af IL-6, IL-8, IL-17 og TNFα og klinisk-patologiske karakteristika. Korrelationer mellem virulensfaktorer og kliniske karakteristika vil blive bestemt. Cohens kappa-statistik vil blive brugt til at bestemme intraobservatørens pålidelighed. En sammenligning af niveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner (IL-6, IL-8, IL-17 og TNFα) før og efter antifungal terapi vil blive udført i undersøgelsesgruppen. Resultaterne vil blive testet for statistisk signifikans. Chi- square og Mann- Whitney U testene vil blive brugt til at estimere den statistiske signifikans af forskel observeret mellem grupperne.

7.Etisk godkendelse opnået