口腔白斑念珠菌相关细胞因子

目标

1. 确定念珠菌表型、毒力属性（分泌的天冬氨酰蛋白酶、生物膜形成、磷脂酶）和抗真菌敏感性与口腔白斑临床病理学特征的关联
2. 测定促炎细胞因子（IL-6、IL-8. 抗真菌治疗前后口腔白斑中的 IL-17、TNFα）。
3. 研究口腔白斑念珠菌与促炎细胞因子与抗真菌治疗的相关性

详细的方法包括研究设计、结果测量、样本量和统计分析。

学习规划：

前瞻性病例对照观察研究

患者选择：

研究组和对照组的患者将从 AIIMS 牙科教育与研究中心的口腔医学与放射学诊所连续招募。

样本量：

该研究将包括 60 名 OL（30 名同质 OL、30 名非同质 OL）和 30 名健康对照

临床病理特征：

临床特征和分期/分级将根据为每个组准备的形式记录。 在进行任何进一步调查之前，将获得书面知情同意书。 吸烟史、槟榔、饮酒习惯和频率、习惯持续时间和当前状态、口腔烧灼感和视觉模拟量表 (VAS) 评分将在切开活检和组织病理学确认诊断之前进行常规血液检查。 将记录 H & E 组织病理学特征和高碘酸席夫 (PAS) 染色，并根据标准世界卫生组织标准对研究组进行分级。 OL 的临床分期将根据 OL 分期系统 (OLEP) (van der Waal 2000) 进行，并由两名经过校准的观察员对病变进行照片记录。将提供戒烟、槟榔和酒精戒断咨询和口腔卫生指导。

研究样本采集：

A）。念珠菌表型、毒力和抗真菌敏感性研究。 收集、运输和处理：将从口腔病变处取出每位患者的两份口腔拭子（用无菌生理盐水预湿），并送到微生物学系的真菌学实验室，按照标准实验室程序进行进一步处理。

直接显微镜检查：将通过显微镜检查一个拭子样本，以通过制备革兰氏染色来检测酵母细胞。

培养：将第二根拭子接种在含有庆大霉素的沙氏葡萄糖琼脂 (SDA) 培养基上，并在 37°C 下孵育 48 小时。 将对形态上类似于酵母的任何生长物进行革兰氏染色。

表型鉴定：通过使用胚芽管、玉米粉琼脂上的形态学、氯化三苯基四唑和 CHROM 琼脂培养基上的颜色来鉴定分离株 念珠菌属毒力因子的测定 各种毒力因子，如磷脂酶活性、分泌的天冬氨酰蛋白酶 (SAP) 和生物膜编队 (BF) 将根据标准协议确定。

磷脂酶(PL) 活性的测定磷脂酶活性将通过在蛋黄琼脂培养基上培养细胞并测量沉淀区的大小来测量。 将制备 106 个酵母细胞/ml 的生理盐水细胞悬浮液，并将 5μl 置于蛋黄培养基表面。 然后将培养物在 37°C 下孵育 7-8 天，之后将确定菌落周围沉淀区的直径。 磷脂酶活性 (Pz) 将通过将菌落直径除以在平板上形成的菌落周围的沉淀区 (pz) 的直径来测量。 每个分离株将一式两份进行测试。 白色念珠菌 SC 5314 菌株将用作阳性对照。

分泌的天冬氨酰蛋白酶 (SAP) 活性的测定 将测试所有分离株在牛血清白蛋白 (BSA) 琼脂中生长和产生透明水解区的能力。 . 将 5μl 的 1x106 个细胞/ml 置于固体培养基上，并在 37°C 下孵育 3-4 天。 随后，通过沉淀白蛋白的水解清除不透明度将被记录。 白色念珠菌 SC 5314 菌株将用作阳性对照。

生物膜形成 (BF) 的测定 将 100μl 体积的 1 x 106 个细胞/ml 悬浮液置于无菌的聚苯乙烯平底 96 孔微量滴定板上，并在 37°C 下孵育 48 小时以形成粘附和生物膜。 48 小时后，孔将用 PBS 清洗，生物膜的半定性测量将通过 XTT [2,3-bis (2-methoxy-4nitro-5-sulfo-phenyl) - 2H - tetra-zolium-5- carboxanilide]-还原测定 XTT-还原测定中的比色变化与生物膜的代谢活性直接相关，然后将在孵育 2 小时后在 490 nm 的微量滴定板读数器中进行测量。

分离物的抗真菌药敏试验 伏立康唑、氟康唑和克霉唑的抗真菌药敏性将根据 CLSI M44-A2 对酵母分离物的建议，通过纸片扩散法进行。

B).促炎性细胞因子研究 来自损伤的口腔分泌物的样本收集 四种无菌 PVA 眼用海绵 (Merocel) 将用于从口腔损伤（活检部位除外）收集口腔分泌物样本，用于四种促炎性细胞因子研究。 这是一种非侵入性方法并使其具有特定位置，这优于其他血清和唾液估计。 此外，通过对接受 OL 抗真菌治疗的患者进行纵向取样来评估局部细胞因子水平，可能有助于了解细胞因子升高的时间性质和对抗真菌药物的临床反应。

将对研究组和对照组执行此程序。 将要求受试者在取样前至少 2 小时禁食、饮水和漱口。 海绵将用无菌生理盐水预润湿，与病灶保持接触而不摩擦或移动或 1 分钟，然后立即储存在 -80 °C 的无菌容器中，直到在生物化学部门 AIIMS 进行进一步分析。 样品部位的照片和临床记录将与患者形式表一起保存，以供将来参考。 在对研究组进行抗真菌治疗后，将在同一部位重复该程序，并将保存照片记录以供比较。 将获得研究所道德委员会的道德许可。 将获得知情的书面同意，并且将在样品收集之前将有关研究的信息提供给研究对象和对照。

通过 ELISA 估计 IL-6、IL-8、IL-17 和 TNFα 水平眼科海绵 (Merocel) 将在室温下解冻 10 分钟。 然后将海绵插入装有 0.2 μm 过滤器的微量离心管（SpinX 离心管）中，通过添加 300 μl 提取缓冲液进行平衡并在 4 °C 下孵育 30 分钟，然后在 4 °C 下以 14,000 离心 30 分钟转数。 离心后，收集所得上清液，用于使用市售试剂盒通过 ELISA 方法评估 IL-6、IL-8、IL-17 和 TNFα 水平。 上清液将储存在-80 °C 直至使用。

针对抗原（IL-6、IL-8、IL-17 和 TNFα）的单克隆抗体已预先包被到所提供的微量滴定条的孔中。 样品或标准品中存在的抗原将与板一起孵育，以允许抗原与抗体结合。 随后在相应的微量滴定板中添加分别与生物素缀合的初级单克隆抗 IL-6、IL-8、IL-17 和 TNFα 抗体。 然后将对一抗特异的亲和素-HRP 偶联抗体添加到孔中。 孵育和洗涤后，为了去除任何未结合的抗体酶试剂，将与 HRP 反应的 TMB 一步底物试剂添加到孔中。 加入酸终止显色，并在 450 nm 处测量吸光度。 参考曲线将通过绘制不同浓度的标准样品与吸光度的关系来获得，并且测试样品中的抗原水平将通过其标准图计算。

抗真菌治疗 研究组将接受抗真菌治疗（Tab Fluconazole 100 mg 作为漱口水（片剂溶解在 10 ml 饮用水中作为漱口水使用 2 分钟并吞服）每天一次，持续 14 天）。 在开始治疗之前，将向每个研究对象演示该程序。 抗真菌治疗后记录口腔烧灼感及病灶临床特征及口腔内照片。

统计分析：

研究组和对照组中念珠菌表型、毒力属性和抗真菌敏感性的分布与 IL-6、IL-8、IL-17 和 TNFα 的水平以及临床病理学特征相关。 将确定毒力因子和临床特征之间的相关性。 Cohens kappa 统计量将用于确定观察者内的可靠性。 比较研究组抗真菌治疗前后促炎细胞因子(IL-6、IL-8、IL-17和TNFα)水平。 将检验结果的统计显着性。卡方检验和 Mann-Whitney U 检验将用于估计组间观察到的差异的统计显着性。

7.获得道德许可