Cytokines associées à Candida dans la leucoplasie orale

Objectifs

1. Déterminer l'association des phénotypes de candida, des attributs de virulence (protéinases aspartyl sécrétées, formation de biofilm, phospholipase) et de la sensibilité antifongique avec des caractéristiques clinicopathologiques dans la leucoplasie buccale
2. Pour déterminer la sécrétion et les niveaux de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα ) dans la leucoplasie orale avant et après traitement antifongique.
3. Étudier la corrélation entre le candida et les cytokines pro-inflammatoires dans la leucoplasie orale avec un traitement antifongique

Méthodologie détaillée comprenant la conception de l'étude, les mesures des résultats, la taille de l'échantillon et l'analyse statistique.

Étudier le design:

Étude observationnelle cas-témoin prospective

Sélection des patients :

Les patients du groupe d'étude et du groupe témoin seront recrutés consécutivement à la clinique de médecine buccale et de radiologie du Centre d'éducation et de recherche dentaire AIIMS.

Taille de l'échantillon:

L'étude comprendra 60 OL (30 OL homogènes, 30 OL non homogènes) et 30 contrôles sains.

Caractéristiques clinicopathologiques :

Les caractéristiques cliniques et la stadification/gradation seraient enregistrées selon le formulaire préparé pour chaque groupe. Un consentement éclairé écrit serait recueilli avant toute enquête plus approfondie. Les antécédents de tabac, de noix de bétel, les habitudes d'alcool avec la fréquence, la durée de l'habitude et l'état actuel, la sensation de brûlure buccale avec les scores de l'échelle visuelle analogique (EVA) seront effectués. Des analyses sanguines de routine seront effectuées avant la biopsie incisionnelle et la confirmation histopathologique du diagnostic. Les caractéristiques histopathologiques H & E avec coloration à l'acide périodique Schiff (PAS) seraient enregistrées et le classement effectué pour le groupe d'étude selon les critères standard de l'Organisation mondiale de la santé. La stadification clinique de l'OL sera effectuée selon le système de stadification OL (OLEP) (van der Waal 2000) avec des enregistrements photographiques des lésions par deux observateurs calibrés. Des conseils sur l'arrêt du tabac, de la noix de bétel et de l'alcool et des instructions d'hygiène buccale seront donnés.

Prélèvement d'échantillons pour étude :

UN). Phénotypes de Candida, étude de la virulence et de la sensibilité aux antifongiques. Collecte, transport et traitement : deux écouvillons oraux de chaque patient (préhumidifiés avec une solution saline normale stérile) seront prélevés de la lésion buccale et envoyés au laboratoire de mycologie, département de microbiologie pour un traitement ultérieur conformément aux procédures de laboratoire standard.

Microscopie directe : Un échantillon d'écouvillon sera examiné par microscopie pour la détection de cellules de levure en préparant une coloration de Gram.

Culture : Le second écouvillon sera ensemencé sur milieu Sabouraud dextrose agar (SDA) avec gentamicine et sera conservé à 37°C pour une incubation de 48 heures. La coloration de Gram sera effectuée sur toute croissance ressemblant morphologiquement à celle de la levure.

Identification phénotypique : l'identification des isolats a été réalisée à l'aide d'un tube germinatif, de la morphologie sur gélose à la farine de maïs, de la couleur sur du chlorure de triphényltétrazolium et du milieu gélosé CHROM. Détermination des facteurs de virulence de Candida spp. formation (BF) sera déterminée selon le protocole standard.

Détermination de l'activité phospholipase (PL) L'activité phospholipase sera mesurée en cultivant des cellules sur un milieu de gélose au jaune d'œuf et en mesurant la taille de la zone de précipitation. Une suspension cellulaire de 106 cellules de levure/ml dans une solution saline sera préparée et 5μl seront déposés à la surface du milieu au jaune d'œuf. La culture sera ensuite incubée à 37°C pendant 7-8 jours, après quoi le diamètre de la zone de précipitation autour de la colonie sera déterminé. L'activité phospholipase (Pz) sera mesurée en divisant le diamètre de la colonie par le diamètre de la zone de précipitation (pz) autour de la colonie formée sur la plaque. Chaque isolat sera testé en double. La souche C. albicans SC 5314 sera utilisée comme contrôle positif.

Détermination de l'activité de l'aspartyl protéinase sécrétée (SAP) Tous les isolats seront testés pour leur capacité à se développer et à produire une zone claire d'hydrolyse dans de la gélose à l'albumine de sérum bovin (BSA). . Un 5µl de 1x106 cellules/ml sera placé sur milieu solide et sera incubé à 37°C pendant 3-4 jours. Par la suite, la clairance de l'opacité par hydrolyse de l'albumine précipitée sera enregistrée. La souche C. albicans SC 5314 sera utilisée comme contrôle positif.

Détermination de la formation de biofilm (BF) Un volume de 100 μl de 1 x 106 cellules / ml de suspension sera placé sur des plaques de microtitrage stériles en polystyrène à fond plat à 96 puits et sera incubé pendant 48 h à 37 ° C pour l'adhérence et le biofilm. Après 48 h, les puits seront lavés avec du PBS et une mesure semi-qualitative du biofilm sera détectée par XTT [2,3-bis (2-méthoxy-4nitro-5-sulfo-phényl) - 2H - tétra-zolium-5- carboxanilide] -test de réduction Un changement colorimétrique dans le test de réduction XTT, une corrélation directe de l'activité métabolique du biofilm, sera ensuite mesuré dans un lecteur de plaque de microtitration à 490 nm après 2 h d'incubation.

Test de sensibilité aux antifongiques des isolats La sensibilité aux antifongiques pour le voriconazole, le fluconazole et le clotrimazole sera réalisée par la méthode de diffusion sur disque conformément à la recommandation CLSI M44-A2 sur les isolats de levure.

B). Étude des cytokines pro-inflammatoires Collecte d'échantillons de sécrétions orales de la lésion Quatre éponges ophtalmiques stériles en PVA (Mérocel) seront utilisées pour prélever des échantillons de sécrétions orales pour quatre études de cytokines pro-inflammatoires de la lésion buccale (autre que le site de biopsie). Il s'agit d'une méthode non invasive et spécifique au site, ce qui est un avantage par rapport aux autres estimations de sérum et de salive. En outre, l'évaluation des niveaux locaux de cytokines via un échantillonnage longitudinal chez les patients subissant un traitement antifongique en OL peut permettre de comprendre la nature temporelle de l'élévation des cytokines et de la réponse clinique aux antifongiques.

Cette procédure sera effectuée à la fois pour le groupe d'étude et le groupe de contrôle. Il sera demandé aux sujets de s'abstenir de manger, de boire et de se rincer la bouche au moins 2 heures avant le prélèvement. Les éponges seront pré-humidifiées avec une solution saline normale stérile, maintenues en contact avec la lésion sans frottement ni mouvement pendant 1 minute, puis immédiatement stockées dans des récipients stériles à -80 ° C jusqu'à une analyse plus approfondie dans le département de biochimie AIIMS. Un dossier photographique et clinique du site d'échantillonnage sera conservé avec le formulaire du patient pour référence future. Cette procédure sera répétée sur le même site après traitement antifongique pour le groupe d'étude et un enregistrement photographique sera conservé à des fins de comparaison. Une autorisation éthique du comité d'éthique de l'Institut sera prise. Un consentement écrit éclairé sera obtenu et des informations concernant l'étude seront données aux sujets de l'étude et aux témoins avant le prélèvement de l'échantillon.

Estimation des taux d'IL-6, IL-8, IL-17 et TNFα par ELISA Les éponges ophtalmiques (Mérocel) seront décongelées à température ambiante pendant 10 min. Les éponges seront ensuite insérées dans un microtube contenant un filtre de 0,2 μm (tube à centrifuger SpinX), équilibré en ajoutant 300 μl de tampon d'extraction et incubé pendant 30 min à 4 ° C, suivi d'une centrifugation à 4 ° C pendant 30 min à 14 000 tr/min. Après centrifugation, le surnageant résultant sera collecté pour l'estimation des niveaux d'IL-6, IL-8, IL-17 et TNFα par la méthode ELISA avec des kits disponibles dans le commerce. Le surnageant sera conservé à -80 °C jusqu'à utilisation.

Un anticorps monoclonal dirigé contre les antigènes (IL-6, IL-8, IL-17 et TNFα) a été pré-enduit sur les puits des barrettes de microtitration fournies. Les antigènes présents dans l'échantillon ou le standard seront incubés avec les plaques pour permettre la liaison des antigènes à l'anticorps. Ceci est suivi par l'ajout d'un anticorps monoclonal primaire anti-IL-6, IL-8, IL-17 et TNFα respectivement conjugué à la biotine dans des plaques de microtitration respectives. Un anticorps conjugué avidine-HRP spécifique de l'anticorps primaire sera ensuite ajouté aux puits. Après incubation et après un lavage, pour éliminer tout réactif enzymatique anticorps non lié, un réactif de substrat en une étape TMB réactif avec HRP sera ajouté aux puits. Le développement de la couleur sera terminé par l'ajout d'acide et l'absorbance a été mesurée à 450 nm. Une courbe de référence sera obtenue en traçant les différentes concentrations d'échantillons standard en fonction de l'absorbance et les niveaux des antigènes dans les échantillons testés seront calculés par son tracé standard.

Traitement antifongique Le groupe d'étude sera traité avec un traitement antifongique (Tab Fluconazole 100 mg en bain de bouche (comprimé dissous dans 10 ml d'eau de boisson et utilisé comme rinçage pendant 2 minutes et avalé) une fois par jour pendant 14 jours). La procédure sera démontrée à chaque sujet de l'étude avant de commencer le traitement. La sensation de brûlure buccale et les caractéristiques cliniques des lésions avec des photographies intrabuccales seront enregistrées après traitement antifongique.

Analyses statistiques:

La distribution des phénotypes de candida, les attributs de virulence et la sensibilité aux antifongiques dans les groupes d'étude et de contrôle seraient corrélés avec les niveaux d'IL-6, IL-8, IL-17 et TNFα et les caractéristiques clinicopathologiques. Les corrélations entre les facteurs de virulence et les caractéristiques cliniques seront déterminées. La statistique kappa de Cohens sera utilisée pour déterminer la fiabilité intra-observateur. Une comparaison des niveaux de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8, IL-17 et TNFα) avant et après traitement antifongique sera effectuée dans le groupe d'étude. Les résultats seraient testés pour leur signification statistique. Les tests du chi carré et de Mann-Whitney U seront utilisés pour estimer la signification statistique de la différence observée entre les groupes.

7. Autorisation éthique obtenue