Candida Citocinas Associadas na Leucoplasia Oral

Objetivos

1. Determinar a associação de fenótipos de cândida, atributos de virulência (aspartil proteinases secretadas, formação de biofilme, fosfolipase) e sensibilidade antifúngica com características clinicopatológicas na leucoplasia oral
2. Para determinar a secreção e os níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα ) na leucoplasia oral antes e depois da terapia antifúngica.
3. Estudar a correlação entre candida e citocinas pró-inflamatórias na leucoplasia oral com terapia antifúngica

Metodologia detalhada, incluindo desenho do estudo, medidas de resultados, tamanho da amostra e análise estatística.

Design de estudo:

Estudo observacional prospectivo de caso-controle

Seleção de pacientes:

Os pacientes do grupo de estudo e do grupo de controle serão recrutados consecutivamente na clínica de Medicina Oral e Radiologia do Centro de Educação e Pesquisa Odontológica AIIMS.

Tamanho da amostra:

O estudo incluirá 60 OL (30 OL homogêneos, 30 OL não homogêneos) e 30 controles saudáveis

Características clinicopatológicas:

As características clínicas e estadiamento/classificação seriam registradas de acordo com o proforma preparado para cada grupo. O consentimento informado por escrito seria obtido antes de qualquer investigação adicional. História de tabagismo, noz de areca, hábitos alcoólicos com frequência, duração do hábito e estado atual, sensação de queimação oral com escores da Escala Visual Analógica (VAS) serão realizadas investigações de sangue de rotina antes da biópsia incisional e confirmação histopatológica do diagnóstico. As características histopatológicas de H & E com coloração de ácido periódico de Schiff (PAS) seriam registradas e a classificação feita para o grupo de estudo de acordo com os critérios padrão da Organização Mundial da Saúde. O estadiamento clínico de OL será feito de acordo com o sistema de estadiamento de OL (OLEP) (van der Waal 2000) com registros fotográficos das lesões por dois observadores calibrados. Aconselhamento para parar de fumar, noz de bétele e álcool e instruções de higiene oral serão fornecidos.

Coleta de amostra para estudo:

A). Estudo de fenótipos de Candida, virulência e sensibilidade antifúngica. Coleta, transporte e processamento: Dois swabs orais de cada paciente (pré-umedecidos com solução salina normal estéril) serão retirados da lesão oral e enviados ao Laboratório de Micologia, Departamento de Microbiologia para processamento adicional de acordo com os procedimentos laboratoriais padrão.

Microscopia direta: Uma amostra de swab será examinada por microscopia para detecção de células de levedura, preparando a coloração de Gram.

Cultura: O segundo swab será inoculado em meio Sabouraud dextrose agar (SDA) com gentamicina e será mantido a 37°C para incubação por 48 horas. A coloração de Gram será realizada em qualquer crescimento morfologicamente semelhante ao da levedura.

Identificação fenotípica: A identificação dos isolados foi realizada por meio de tubo germinativo, morfologia em ágar fubá de milho, coloração em meio de cloreto de trifenil tetrazólio e ágar CHROM Determinação de fatores de virulência de Candida spp Vários fatores de virulência como atividade de fosfolipase, aspartil proteinase secretada (SAP) e biofilme formação (BF) será determinada de acordo com o protocolo padrão.

Determinação da atividade da fosfolipase (PL) A atividade da fosfolipase será medida pelo crescimento das células em meio de ágar gema de ovo e medição do tamanho da zona de precipitação. Uma suspensão celular de 106 células de levedura/ml em solução salina será preparada e 5μl serão colocados na superfície do meio de gema de ovo. A cultura será então incubada a 37°C por 7-8 dias, após o que será determinado o diâmetro da zona de precipitação ao redor da colônia. A atividade da fosfolipase (Pz) será medida dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da zona de precipitação (pz) ao redor da colônia formada na placa. Cada isolado será testado em duplicata. A cepa C. albicans SC 5314 será utilizada como controle positivo.

Determinação da atividade da aspartil proteinase secretada (SAP) Todos os isolados serão testados quanto à sua capacidade de crescer e produzir uma zona clara de hidrólise em ágar de albumina de soro bovino (BSA). . Um 5μl de 1x106 células/ml será colocado em meio sólido e será incubado a 37°C por 3-4 dias. Posteriormente, será registrada a eliminação da opacidade por hidrólise da albumina precipitada. A cepa C. albicans SC 5314 será utilizada como controle positivo.

Determinação da formação de biofilme (BF) Um volume de 100μl de suspensão de 1 x 106 células /ml será colocado em placas de microtitulação de 96 poços estéreis de poliestireno de fundo plano e incubadas por 48 h a 37°C para aderência e biofilme. Após 48h os poços serão lavados com PBS e uma medida semi-qualitativa de biofilme será detectada por XTT [2,3-bis (2-metoxi-4nitro-5-sulfo-fenil) - 2H - tetra-zólio-5- Ensaio de redução de carboxanilida] Uma alteração colorimétrica no ensaio de redução de XTT, uma correlação direta da atividade metabólica do biofilme, será então medida em um leitor de placas de microtitulação a 490 nm após 2 horas de incubação.

Teste de suscetibilidade antifúngica de isolados A suscetibilidade antifúngica para voriconazol fluconazol e clotrimazol será realizada pelo método de difusão em disco de acordo com a recomendação CLSI M44-A2 sobre os isolados de levedura.

B). Estudo de citocinas pró-inflamatórias Coleta de amostras de secreções orais da lesão Quatro esponjas oftálmicas PVA estéreis (Merocel) serão utilizadas para coletar amostras de secreções orais para estudo de quatro citocinas pró-inflamatórias da lesão oral (que não seja o local da biópsia). Este é um método não invasivo e o torna específico do local, o que é uma vantagem sobre outras estimativas de soro e saliva. Além disso, a avaliação dos níveis locais de citocinas por amostragem longitudinal em pacientes submetidos à terapia antifúngica em OL pode permitir a compreensão da natureza temporal da elevação de citocinas e da resposta clínica aos antifúngicos.

Este procedimento será feito tanto para o grupo de estudo quanto para o grupo controle. Os indivíduos serão solicitados a se abster de comer, beber e enxaguar a boca pelo menos 2 horas antes da amostragem. As esponjas serão pré-umedecidas com solução salina normal estéril, mantidas em contato com a lesão sem fricção ou movimento ou 1 minuto e imediatamente armazenadas em recipientes estéreis a -80 °C até análise posterior no departamento de Bioquímica AIIMS. Um registro fotográfico e clínico do local da amostra será mantido com o proforma do paciente para referência futura. Este procedimento será repetido no mesmo local após a terapia antifúngica para o grupo de estudo e um registro fotográfico será mantido para comparação. A autorização ética do conselho de ética do Instituto será obtida. O consentimento informado por escrito será obtido e as informações sobre o estudo serão dadas aos sujeitos do estudo e aos controles antes da coleta da amostra.

Estimativa dos níveis de IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα por ELISA As esponjas oftálmicas (Merocel ) serão descongeladas em temperatura ambiente por 10 min. As esponjas serão então inseridas em um tubo de microcentrífuga contendo um filtro de 0,2 μm (tubo de centrífuga SpinX), equilibrado pela adição de 300 μl de tampão de extração e incubado por 30 min a 4 °C, seguido de centrifugação a 4 °C por 30 min a 14.000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante resultante será coletado para a estimativa dos níveis de IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα pelo método ELISA com kits disponíveis comercialmente. O sobrenadante será armazenado a -80 °C até o uso.

Um anticorpo monoclonal contra os antígenos (IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα) foi pré-revestido nos poços das tiras de microtitulação fornecidas. Os antígenos presentes na amostra ou padrão serão incubados com as placas para permitir a ligação dos antígenos ao anticorpo. Isto é seguido pela adição de um anticorpo monoclonal primário anti-IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα respectivamente conjugado com biotina nas respectivas placas de microtitulação. Um anticorpo conjugado avidina-HRP específico para anticorpo primário será então adicionado aos poços. Após a incubação e após uma lavagem, para remover qualquer reagente enzimático de anticorpo não ligado, um reagente de substrato TMB de uma etapa reativo com HRP será adicionado aos poços. O desenvolvimento da cor será finalizado pela adição de ácido e a absorbância foi medida a 450 nm. Uma curva de referência será obtida plotando as diferentes concentrações de amostras padrão versus absorbância e os níveis dos antígenos nas amostras testadas serão calculados por seu gráfico padrão.

Terapia antifúngica O grupo de estudo será tratado com terapia antifúngica (Tab Fluconazol 100 mg como enxaguatório bucal (comprimido dissolvido em 10 ml de água potável e usado como enxágue por 2 minutos e engolido) uma vez ao dia por 14 dias). O procedimento será demonstrado a cada sujeito do estudo antes de iniciar o tratamento. A sensação de queimação oral e as características clínicas das lesões com fotografias intraorais serão registradas após a terapia antifúngica.

Análise estatística:

A distribuição dos fenótipos de cândida, atributos de virulência e sensibilidade antifúngica nos grupos de estudo e controle seriam correlacionados com os níveis de IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα e características clínico-patológicas. Correlações entre fatores de virulência e características clínicas serão determinadas. A estatística kappa de Cohens será utilizada para determinar a confiabilidade intraobservador. Uma comparação dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-8, IL-17 e TNFα) antes e após a terapia antifúngica será feita no grupo de estudo. Os resultados seriam testados quanto à significância estatística. Os testes Qui-quadrado e Mann-Whitney U serão utilizados para estimar a significância estatística da diferença observada entre os grupos.

7. Autorização Ética Obtida