Cytokiny spojené s Candidou u orální leukoplakie

Cíle

1. Stanovit asociaci fenotypů kandidy, atributů virulence (sekretované aspartylproteinázy, tvorba biofilmu, fosfolipáza) a antifungální citlivosti s klinicko-patologickými charakteristikami u orální leukoplakie
2. Ke stanovení sekrece a hladin prozánětlivých cytokinů (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) u orální leukoplakie před a po antimykotické léčbě.
3. Studovat korelaci mezi kandidou a prozánětlivými cytokiny u orální leukoplakie s antifungální terapií

Podrobná metodologie včetně návrhu studie, měření výsledků, velikosti vzorku a statistické analýzy.

Studovat design:

Prospektivní případ-kontrolní observační studie

Výběr pacientů:

Pacienti ve studijní skupině a kontrolní skupině budou postupně rekrutováni z kliniky orální medicíny a radiologie v Centru pro dentální vzdělávání a výzkum AIIMS.

Velikost vzorku:

Studie bude zahrnovat 60 OL (30 homogenních OL, 30 nehomogenních OL) a 30 zdravých kontrol

Klinicko-patologické vlastnosti:

Klinické charakteristiky a staging/grading by byly zaznamenány podle připraveného proforma pro každou skupinu. Před dalším vyšetřováním by byl přijat písemný informovaný souhlas. Anamnéza tabáku, betelových ořechů, návyků na alkohol s frekvencí, trváním návyku a aktuálním stavem, pocit pálení v ústech se skóre na vizuální analogové škále (VAS) bude před incizní biopsií a histopatologickým potvrzením diagnózy provedeno rutinní vyšetření krve. Histopatologické znaky H&E s barvením periodickou kyselinou Schiffovou (PAS) by byly zaznamenány a klasifikovány pro studijní skupinu podle standardních kritérií Světové zdravotnické organizace. Klinický staging OL bude proveden podle stagingového systému OL (OLEP) (van der Waal 2000) s fotografickými záznamy lézí dvěma kalibrovanými pozorovateli. Bude poskytnuto poradenství při odvykání tabáku, betelu a alkoholu a pokyny k ústní hygieně.

Sbírka vzorků pro studium:

A). Studie fenotypů, virulence a antimykotické citlivosti Candida. Odběr, transport a zpracování: Od každého pacienta budou odebrány dva ústní stěry (předem navlhčené sterilním fyziologickým roztokem) z ústní léze a odeslány do mykologické laboratoře, oddělení mikrobiologie k dalšímu zpracování podle standardních laboratorních postupů.

Přímá mikroskopie: Jeden vzorek tamponu bude mikroskopicky vyšetřen pro detekci kvasinkových buněk přípravou gramového barviva.

Kultivace: Druhý tampon bude naočkován na Sabouraudovo dextrózové agarové (SDA) médium s gentamicinem a bude uchováván při 37 °C pro inkubaci po dobu 48 hodin. Gramovo barvení bude provedeno na jakémkoli růstu morfologicky podobném růstu kvasinek.

Fenotypová identifikace: Identifikace izolátů byla provedena pomocí zárodečné zkumavky, morfologie na agaru z kukuřičné mouky, barva na trifenyltetrazoliumchloridu a agarovém médiu CHROM Stanovení faktorů virulence Candida spp Různé faktory virulence, jako je fosfolipázová aktivita, secernovaná aspartylproteináza (SAP) a Biofilm formace (BF) bude stanovena podle standardního protokolu.

Stanovení aktivity fosfolipázy (PL) Aktivita fosfolipázy bude měřena pěstováním buněk na agarovém médiu s vaječným žloutkem a měřením velikosti zóny srážení. Připraví se buněčná suspenze 106 kvasinkových buněk/ml ve fyziologickém roztoku a 5 μl se umístí na povrch média vaječného žloutku. Kultura bude poté inkubována při 37 °C po dobu 7-8 dnů, po kterých bude určen průměr precipitační zóny kolem kolonie. Aktivita fosfolipázy (Pz) bude měřena vydělením průměru kolonie průměrem precipitační zóny (pz) kolem kolonie vytvořené na plotně. Každý izolát bude testován v duplikátech. Kmen C. albicans SC 5314 bude použit jako pozitivní kontrola.

Stanovení aktivity secernované aspartylproteinázy (SAP) Všechny izoláty budou testovány na jejich schopnost růst a produkovat jasnou zónu hydrolýzy na agaru s hovězím sérovým albuminem (BSA). . 5 μl 1x106 buněk/ml bude umístěno na pevné médium a bude inkubováno při 37 °C po dobu 3-4 dnů. Následně bude zaznamenáno odstranění opacity hydrolýzou vysráženého albuminu. Kmen C. albicans SC 5314 bude použit jako pozitivní kontrola.

Stanovení tvorby biofilmu (BF) 100μl objem 1 x 106 buněk/ml suspenze se umístí na sterilní, polystyrenové, 96jamkové mikrotitrační destičky s plochým dnem a inkubuje se po dobu 48 hodin při 37 °C pro adherenci a biofilm. Po 48 hodinách se jamky promyjí PBS a semi-kvalitativní míra biofilmu bude detekována pomocí XTT [2,3-bis (2-methoxy-4nitro-5-sulfo-fenyl) - 2H - tetra-zolium-5- karboxanilid]-redukční test Kolorimetrická změna v XTT-redukčním testu, přímá korelace metabolické aktivity biofilmu, bude poté měřena ve čtečce mikrotitračních destiček při 490 nm po 2 hodinách inkubace.

Testování antimykotické citlivosti izolátů Antifungální citlivost pro vorikonazol, flukonazol a klotrimazol bude provedena diskovou difúzní metodou podle doporučení CLSI M44-A2 na kvasinkových izolátech.

B). Studie prozánětlivých cytokinů Odběr vzorků orálního sekretu z léze Čtyři sterilní oční houby PVA (Merocel) budou použity k odběru vzorků orálního sekretu pro čtyři studie prozánětlivých cytokinů z orální léze (jiné než místo biopsie). Jedná se o neinvazivní metodu, která je místně specifická, což je výhoda oproti jiným odhadům séra a slin. Kromě toho hodnocení lokálních hladin cytokinů prostřednictvím longitudinálního odběru vzorků u pacientů podstupujících antifungální terapii v OL může umožnit pochopení časové povahy zvýšení cytokinů a klinické odpovědi na antimykotika.

Tento postup bude proveden jak pro studijní skupinu, tak pro kontrolní skupinu. Subjekty budou požádány, aby se zdržely jídla, pití a vyplachování úst alespoň 2 hodiny před odběrem vzorků. Houbičky budou předem navlhčeny sterilním normálním fyziologickým roztokem, udržovány v kontaktu s lézí bez tření nebo pohybu nebo 1 minutu a poté okamžitě uloženy ve sterilních nádobách při -80 °C do další analýzy na oddělení biochemie AIIMS. Fotografický a klinický záznam místa odběru bude uchován spolu s proformou pacienta pro budoucí použití. Tento postup bude opakován na stejném místě po antimykotické terapii pro studijní skupinu a bude uchován fotografický záznam pro srovnání. Bude provedena etická prověrka od etické rady institutu. Před odběrem vzorků bude získán informovaný písemný souhlas a informace týkající se studie budou poskytnuty subjektům studie a kontrolám.

Stanovení hladin IL-6, IL-8, IL-17 a TNFa pomocí ELISA Oční houby (Merocel) se nechají rozmrazit při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Houby se poté vloží do mikrocentrifugační zkumavky obsahující 0,2 μm filtr (centrifugační zkumavka SpinX), ekvilibrují se přidáním 300 μl extrakčního pufru a inkubují se 30 minut při 4 °C, následuje centrifugace při 4 °C po dobu 30 minut při 14 000 ot./min. Po odstředění bude výsledný supernatant shromážděn pro stanovení hladin IL-6, IL-8, IL-17 a TNFa metodou ELISA s komerčně dostupnými soupravami. Supernatant bude až do použití skladován při -80 °C.

Na jamky dodaných mikrotitračních proužků byla předem nanesena monoklonální protilátka proti antigenům (IL-6, IL-8, IL-17 a TNFα). Antigeny přítomné ve vzorku nebo standardu budou inkubovány s destičkami, aby se umožnilo navázání antigenů na protilátku. Poté následuje přidání primární monoklonální protilátky anti-IL-6, IL-8, IL-17 a TNFa konjugované s biotinem v příslušných mikrotitračních destičkách. Potom se do jamek přidá protilátka konjugovaná s avidinem-HRP specifická pro primární protilátku. Po inkubaci a po promytí se do jamek přidá jednokrokové substrátové činidlo TMB reagující s HRP, aby se odstranilo jakékoli nevázané enzymové činidlo protilátky. Vyvíjení barvy bude ukončeno přidáním kyseliny a absorbance byla měřena při 450 nm. Referenční křivka bude získána vynesením různých koncentrací standardních vzorků proti absorbanci a hladiny antigenů v testovaných vzorcích budou vypočteny pomocí jejího standardního grafu.

Antimykotická terapie Studovaná skupina bude léčena antimykotickou terapií ( Tab Fluconazole 100 mg jako ústní voda (tableta rozpuštěná v 10 ml pitné vody a užívaná jako výplach po dobu 2 minut a spolknuta) jednou denně po dobu 14 dnů). Postup bude demonstrován každému subjektu studie před zahájením léčby. Po antifungální terapii bude zaznamenán pocit pálení v ústech a klinické charakteristiky lézí pomocí intraorálních fotografií.

Statistická analýza:

Distribuce fenotypů kandidy, atributy virulence a antimykotická citlivost ve studijních a kontrolních skupinách by korelovala s hladinami IL-6, IL-8, IL-17 a TNFα a klinicko-patologickými charakteristikami. Budou stanoveny korelace mezi faktory virulence a klinickými charakteristikami. Cohens kappa statistika bude použita ke stanovení intraobserver spolehlivosti. Ve studované skupině bude provedeno srovnání hladin prozánětlivých cytokinů (IL-6, IL-8, IL-17 a TNFα) před a po antimykotické léčbě. Výsledky by byly testovány na statistickou významnost. K odhadu statistické významnosti rozdílu pozorovaného mezi skupinami budou použity Chikvadrát a Mann-Whitneyův U test.

7. Získání etické prověrky