구강 백반증에서 칸디다 관련 사이토카인

목표

1. 구강 백반증에서 칸디다 표현형, 독성 속성(Secreted aspartyl proteinases, biofilm formation, Phospholipase) 및 항진균제 감수성과 임상병리학적 특성의 연관성을 확인하기 위해
2. 전염증성 사이토카인(IL-6, IL-8. IL-17, TNFα ) 항진균제 치료 전후의 구강 백반증.
3. 항진균제 치료를 받는 구강 백반증에서 칸디다와 전염증성 사이토카인의 상관관계를 연구하기 위해

연구 설계, 결과 측정, 샘플 크기 및 통계 분석을 포함한 자세한 방법론.

연구 설계:

전향적 사례 대조군 관찰 연구

환자 선택:

연구군과 대조군 환자는 치의학연구센터 AIIMS 구강의학과 영상의학과에서 순차적으로 모집한다.

표본의 크기:

이 연구에는 60개의 OL(30개의 균일한 OL, 30개의 비균질한 OL) 및 30개의 건강한 대조군이 포함됩니다.

임상병리학적 특성:

임상 특성 및 병기/등급은 각 그룹에 대해 준비된 양식에 따라 기록됩니다. 서면 동의는 추가 조사 전에 이루어집니다. 담배 이력, 빈랑나무 열매, 빈도, 습관 기간 및 현재 상태를 포함한 알코올 습관, VAS(Visual Analogue Scale) 점수를 통한 구강 작열감은 절개 생검 및 진단의 조직병리학적 확인 전에 일상적인 혈액 조사가 수행될 것입니다. PAS(Periodic Acid Schiff) 염색을 사용한 H & E 조직병리학적 특징을 기록하고 표준 세계 보건 기구 기준에 따라 연구 그룹에 대해 등급을 매겼습니다. OL의 임상 단계는 2명의 보정된 관찰자가 병변의 사진 기록을 사용하여 OL 단계 시스템(OLEP)(van der Waal 2000)에 따라 수행됩니다. 담배, 빈랑 및 알코올 중단 상담 및 구강 위생 지침이 제공됩니다.

연구를 위한 샘플 수집:

ㅏ). 칸디다 표현형, 독성 및 항진균제 감수성 연구. 수집, 운반 및 처리: 각 환자의 구강 면봉 2개(무균 생리 식염수로 미리 적신 것)를 구강 병변에서 채취하여 표준 실험실 절차에 따라 추가 처리를 위해 미생물학과의 균류 실험실로 보냅니다.

직접 현미경 검사: 그람 염색을 준비하여 효모 세포를 검출하기 위해 하나의 면봉 샘플을 현미경으로 검사합니다.

배양: 두 번째 면봉은 겐타마이신이 포함된 SDA(Sabouraud dextrose agar) 배지에 접종되고 48시간 동안 배양을 위해 37°C에서 유지됩니다. 그람 염색은 효모의 성장과 형태학적으로 유사한 모든 성장에서 수행됩니다.

표현형 동정: 분리균의 동정은 발아관, 옥수수 가루 한천의 형태, 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드 및 CHROM 한천 배지의 색상을 이용하여 수행됨 칸디다 종의 독성 인자 결정 phospholipase 활성, Secreted aspartyl proteinase (SAP) 및 Biofilm과 같은 다양한 독성 인자 형성(BF)은 표준 프로토콜에 따라 결정됩니다.

포스포리파제(PL) 활성의 결정 포스포리파제 활성은 달걀 노른자 한천 배지에서 세포를 성장시키고 침전 구역의 크기를 측정하여 측정됩니다. 식염수에 106 효모 세포/ml의 세포 현탁액을 준비하고 5μl를 달걀 노른자 배지 표면에 놓습니다. 그런 다음 배양물을 37°C에서 7-8일 동안 배양한 후 콜로니 주변의 침전 구역의 직경을 결정합니다. 포스포리파제 활성(Pz)은 콜로니 직경을 플레이트에 형성된 콜로니 주변의 침전 구역(pz)의 직경으로 나누어 측정합니다. 각 분리물은 이중으로 테스트됩니다. C. albicans SC 5314 균주는 양성 대조군으로 사용됩니다.

분비된 아스파르틸 프로테이나제(SAP) 활성의 결정 모든 단리물은 소 혈청 알부민(BSA) 한천에서 성장하고 명확한 가수분해 구역을 생성하는 능력에 대해 테스트됩니다. . 5μl의 1x106 세포/ml를 고체 배지에 놓고 3-4일 동안 37°C에서 배양합니다. 이어서, 침전된 알부민의 가수분해에 의한 불투명도의 제거가 기록될 것이다. C. albicans SC 5314 균주는 양성 대조군으로 사용됩니다.

생물막 형성(BF)의 결정 1 x 106개 세포/ml 현탁액의 100μl 부피를 멸균 폴리스티렌, 바닥이 평평한 96웰 마이크로타이터 플레이트에 놓고 부착 및 생물막을 위해 37°C에서 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후 웰을 PBS로 세척하고 XTT [2,3-bis(2-methoxy-4nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetra-zolium-5- 카르복사닐리드]-환원 분석 XTT-환원 분석의 비색 변화, 생물막의 대사 활성의 직접적인 상관관계는 배양 2시간 후 마이크로타이터 플레이트 판독기에서 490nm에서 측정됩니다.

분리주에 대한 항진균제 감수성 시험 보리코나졸 플루코나졸 및 클로트리마졸에 대한 항진균제 감수성은 효모 분리주에 대한 CLSI M44-A2 권장 사항에 따라 디스크 확산 방법으로 수행됩니다.

비). 전염증성 사이토카인 연구 병변에서 구강 분비물의 샘플 수집 4개의 멸균 PVA 안과용 스펀지(Merocel)를 사용하여 구강 병변(생검 부위 제외)에서 4개의 전염증성 사이토카인 연구를 위한 구강 분비물 샘플을 수집합니다. 이것은 비침습적 방법이며 다른 혈청 및 타액 추정에 비해 이점인 부위 특정적입니다. 또한, OL에서 항진균제 치료를 받는 환자의 세로 샘플링을 통한 국소 사이토카인 수준의 평가는 사이토카인 상승의 시간적 특성과 항진균제에 대한 임상 반응을 이해할 수 있게 합니다.

이 절차는 연구 그룹과 통제 그룹 모두에 대해 수행됩니다. 피험자는 샘플링하기 최소 2시간 전에 먹고, 마시고, 입을 헹구지 않도록 요청받을 것입니다. 스폰지는 멸균 생리 식염수로 미리 적셔 문지르거나 움직이지 않고 1분 동안 병변과 접촉한 다음 생화학 부서 AIIMS에서 추가 분석이 이루어질 때까지 즉시 -80°C에서 멸균 용기에 보관됩니다. 샘플 사이트의 사진 및 임상 기록은 나중에 참조할 수 있도록 환자 양식과 함께 보관됩니다. 이 절차는 연구 그룹에 대한 항진균제 치료 후 동일한 부위에서 반복되며 비교를 위해 사진 기록이 보관됩니다. 연구소 윤리 위원회의 윤리 승인을 받습니다. 정보에 입각한 서면 동의를 얻고 연구에 관한 정보를 연구 피험자에게 제공하고 사전 샘플 수집을 제어합니다.

ELISA에 의한 IL-6, IL-8, IL-17 및 TNFα 수준의 추정 안과용 스펀지(Merocel )를 실온에서 10분 동안 해동시킨다. 그런 다음 스폰지를 0.2 μm 필터(SpinX 원심분리기 튜브)가 포함된 마이크로원심분리기 튜브에 삽입하고 300 μl의 추출 버퍼를 추가하여 평형화하고 4°C에서 30분 동안 배양한 다음 4°C에서 14,000에서 30분 동안 원심분리합니다. 회전수 원심분리 후, 시판되는 키트를 사용하여 ELISA 방법에 의해 IL-6, IL-8, IL-17 및 TNFα 수준의 추정을 위해 생성된 상청액을 수집할 것이다. 상층액은 사용할 때까지 -80°C에서 보관됩니다.

항원(IL-6, IL-8, IL-17 및 TNFα)에 대한 단클론 항체는 제공된 마이크로타이터 스트립의 웰에 미리 코팅되어 있습니다. 샘플 또는 표준에 존재하는 항원은 항원이 항체에 결합할 수 있도록 플레이트와 함께 배양됩니다. 이어서 각각의 마이크로타이터 플레이트에서 각각 비오틴에 접합된 1차 단일클론 항-IL-6, IL-8, IL-17 및 TNFα 항체를 첨가합니다. 1차 항체에 특이적인 아비딘-HRP 접합 항체가 웰에 추가됩니다. 배양 후 세척 후 결합되지 않은 항체 효소 시약을 제거하기 위해 HRP와 반응하는 TMB 1단계 기질 시약을 웰에 추가합니다. 발색은 산을 첨가함으로써 종결될 것이고 흡광도는 450 nm에서 측정되었다. 기준 곡선은 표준 샘플의 다양한 농도 대 흡광도를 플로팅하여 얻을 수 있으며 테스트 샘플의 항원 수준은 표준 플롯으로 계산됩니다.

항진균 요법 연구 그룹은 항진균 요법(Tab Fluconazole 100mg을 구강 세정제(정제를 식수 10ml에 녹여 2분간 헹구고 삼킴)으로 14일 동안 하루에 한 번) 치료합니다. 절차는 치료를 시작하기 전에 각 연구 피험자에게 시연됩니다. 항진균제 치료 후 구강 내 사진으로 병변의 구강 화끈거림과 임상적 특징을 기록한다.

통계 분석:

연구 및 대조군에서의 칸디다 표현형, 독성 특성 및 항진균제 감수성의 분포는 IL-6, IL-8, IL-17 및 TNFα의 수준 및 임상병리학적 특성과 상관관계가 있을 것이다. 독성 인자와 임상적 특성 사이의 상관관계가 결정될 것이다. Cohens kappa 통계는 관찰자 내 신뢰도를 결정하는 데 사용됩니다. 항진균제 치료 전과 후의 전 염증성 사이토카인(IL-6, IL-8, IL-17 및 TNFα) 수준의 비교가 연구 그룹에서 수행될 것입니다. 결과는 통계적 유의성에 대해 테스트됩니다. Chi-square 및 Mann-Whitney U 테스트는 그룹 간에 관찰된 차이의 통계적 유의성을 추정하는 데 사용됩니다.

7.윤리적 승인 획득