Cytokiny związane z Candida w leukoplakii jamy ustnej

Cele

1. Określenie związku fenotypów Candida, cech wirulencji (wydzielane proteinazy aspartylowe, tworzenie biofilmu, fosfolipaza) i wrażliwości przeciwgrzybiczej z charakterystyką kliniczno-patologiczną leukoplakii jamy ustnej
2. W celu określenia wydzielania i poziomu cytokin prozapalnych (IL-6, IL-8. IL-17, TNFα) w leukoplakii jamy ustnej przed i po leczeniu przeciwgrzybiczym.
3. Badanie korelacji między drożdżakami a cytokinami prozapalnymi w leukoplakii jamy ustnej z terapią przeciwgrzybiczą

Szczegółowa metodologia, w tym projekt badania, miary wyników, wielkość próby i analiza statystyczna.

Projekt badania:

Prospektywne obserwacyjne badanie kliniczno-kontrolne

Selekcja pacjentów:

Pacjenci z grupy badanej i grupy kontrolnej będą kolejno rekrutowani z kliniki Oral Medicine & Radiology w Centre for Dental Education & Research AIIMS.

Wielkość próbki:

Badanie obejmie 60 OL (30 jednorodnych OL, 30 niejednorodnych OL) i 30 zdrowych kontroli

Charakterystyka kliniczno-patologiczna:

Charakterystyka kliniczna i stopień zaawansowania/klasyfikacja byłyby rejestrowane zgodnie z przygotowanym formularzem dla każdej grupy. Pisemna świadoma zgoda zostanie podjęta przed dalszym dochodzeniem. Historia palenia tytoniu, orzechów betelu, nawyków alkoholowych wraz z częstotliwością, czasem trwania nałogu i aktualnym stanem, uczucie pieczenia w jamie ustnej z wynikami wizualnej skali analogowej (VAS) będą Rutynowe badania krwi zostaną wykonane przed biopsją nacięcia i histopatologicznym potwierdzeniem diagnozy. Cechy histopatologiczne H & E z barwieniem kwasem nadjodowym Schiffa (PAS) byłyby rejestrowane i oceniane dla grupy badanej zgodnie ze standardowymi kryteriami Światowej Organizacji Zdrowia. Klasyfikacja kliniczna OL zostanie przeprowadzona zgodnie z systemem stopniowania OL (OLEP) (van der Waal 2000) z zapisami fotograficznymi zmian dokonanymi przez dwóch skalibrowanych obserwatorów. Udzielone zostaną porady dotyczące zaprzestania palenia tytoniu, orzechów betelu i alkoholu oraz instrukcje dotyczące higieny jamy ustnej.

Pobieranie próbek do badań:

A). Badanie fenotypów Candida, wirulencji i wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Pobieranie, transport i przetwarzanie: Od każdego pacjenta po dwa wymazy z jamy ustnej (wstępnie zwilżone sterylnym roztworem soli fizjologicznej) zostaną pobrane ze zmiany w jamie ustnej i przesłane do Laboratorium Mikologicznego Wydziału Mikrobiologii w celu dalszego przetworzenia zgodnie ze standardowymi procedurami laboratoryjnymi.

Mikroskopia bezpośrednia: Jedna próbka wymazu zostanie zbadana pod mikroskopem w celu wykrycia komórek drożdży poprzez przygotowanie barwienia metodą Grama.

Hodowla: Drugi wymaz zostanie zaszczepiony na podłożu Sabourauda z agarem dekstrozowym (SDA) z gentamycyną i będzie przechowywany w temperaturze 37°C do inkubacji przez 48 godzin. Barwienie metodą Grama zostanie przeprowadzone na każdym wzroście przypominającym morfologicznie wzrost drożdży.

Identyfikacja fenotypowa: Identyfikacja izolatów została przeprowadzona przy użyciu probówki, morfologia na agarze z mączką kukurydzianą, kolor na chlorku trifenylotetrazoliowym i podłożu agarowym CHROM. Określenie czynników wirulencji Candida spp. Różne czynniki wirulencji, takie jak aktywność fosfolipazy, wydzielana proteinaza aspartylowa (SAP) i biofilm tworzenie (BF) zostanie określone zgodnie ze standardowym protokołem.

Oznaczanie aktywności fosfolipazy (PL) Aktywność fosfolipazy będzie mierzona poprzez wzrost komórek na podłożu agarowym z żółtkiem jaja i pomiar wielkości strefy wytrącania. Przygotowana zostanie zawiesina komórek 106 komórek drożdży/ml w roztworze soli fizjologicznej i 5 μl zostanie umieszczone na powierzchni podłoża zawierającego żółtko jaja. Następnie hodowlę inkubuje się w temperaturze 37°C przez 7-8 dni, po czym określa się średnicę strefy opadów wokół kolonii. Aktywność fosfolipazy (Pz) będzie mierzona przez podzielenie średnicy kolonii przez średnicę strefy wytrącania (pz) wokół kolonii utworzonej na płytce. Każdy izolat będzie testowany w dwóch powtórzeniach. Szczep C. albicans SC 5314 zostanie użyty jako kontrola pozytywna.

Oznaczanie aktywności wydzielanej proteinazy aspartylowej (SAP) Wszystkie izolaty będą badane pod kątem zdolności do wzrostu i tworzenia klarownej strefy hydrolizy w agarze z albuminą surowicy bydlęcej (BSA). . 5 μl 1x106 komórek/ml umieszcza się na podłożu stałym i inkubuje w temperaturze 37°C przez 3-4 dni. Następnie rejestrowane będzie usuwanie zmętnienia przez hydrolizę wytrąconej albuminy. Szczep C. albicans SC 5314 zostanie użyty jako kontrola pozytywna.

Oznaczanie tworzenia biofilmu (BF) Objętość 100 μl zawiesiny 1 x 106 komórek/ml zostanie umieszczona na sterylnych, polistyrenowych, płaskodennych 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowania i będzie inkubowana przez 48 godzin w temperaturze 37°C w celu uzyskania przyczepności i biofilmu. Po 48 godzinach studzienki zostaną przemyte PBS i półjakościowa miara biofilmu zostanie wykryta za pomocą XTT [2,3-bis(2-metoksy-4nitro-5-sulfo-fenylo)-2H-tetra-zolium-5- test redukcji karboksanilidu [0077] Zmiana kolorymetryczna w teście redukcji XTT, bezpośrednia korelacja aktywności metabolicznej biofilmu, będzie następnie mierzona w czytniku płytek do mikromiareczkowania przy 490 nm po 2 godzinach inkubacji.

Badanie wrażliwości izolatów na leki przeciwgrzybicze Badanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze na worykonazol, flukonazol i klotrimazol zostanie przeprowadzone metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z zaleceniami CLSI M44-A2 dotyczącymi izolatów drożdży.

B). Badanie cytokin prozapalnych Pobranie próbki wydzieliny z jamy ustnej ze zmiany chorobowej Cztery jałowe gąbki oftalmiczne PVA (Merocel) zostaną użyte do pobrania próbek wydzieliny z jamy ustnej do czterech badań cytokin prozapalnych ze zmiany w jamie ustnej (innej niż miejsce biopsji). Jest to metoda nieinwazyjna i specyficzna dla miejsca, co stanowi przewagę nad innymi metodami oceny surowicy i śliny. Ponadto ocena lokalnych poziomów cytokin poprzez podłużne pobieranie próbek u pacjentów poddawanych terapii przeciwgrzybiczej w OL może pozwolić na zrozumienie czasowej natury wzrostu cytokin i klinicznej odpowiedzi na leki przeciwgrzybicze.

Ta procedura zostanie przeprowadzona zarówno dla grupy badanej, jak i grupy kontrolnej. Osoby badane zostaną poproszone o powstrzymanie się od jedzenia, picia i płukania ust co najmniej 2 godziny przed pobraniem próbki. Gąbki zostaną wstępnie zwilżone sterylnym roztworem soli fizjologicznej, utrzymane w kontakcie ze zmianą chorobową bez pocierania lub poruszania się przez 1 minutę, a następnie natychmiast przechowywane w sterylnych pojemnikach w temperaturze -80°C do dalszej analizy w dziale biochemii AIIMS. Dokumentacja fotograficzna i kliniczna miejsca pobierania próbki będzie przechowywana wraz z formularzem pacjenta do wykorzystania w przyszłości. Ta procedura zostanie powtórzona w tym samym miejscu po terapii przeciwgrzybiczej dla grupy badanej i zachowana zostanie dokumentacja fotograficzna dla porównania. Uzyskana zostanie zgoda etyczna od rady ds. etyki Instytutu. Zostanie uzyskana świadoma pisemna zgoda, a informacje dotyczące badania zostaną przekazane uczestnikom badania i kontrolom przed pobraniem próbki.

Oznaczenie poziomów IL-6, IL-8, IL-17 i TNFα metodą ELISA Gąbki oftalmiczne (Merocel®) rozmraża się w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Gąbki zostaną następnie umieszczone w probówce mikrowirówkowej zawierającej filtr 0,2 μm (probówka wirówkowa SpinX), zrównoważone przez dodanie 300 μl buforu ekstrakcyjnego i inkubowane przez 30 min w 4°C, a następnie wirowane w 4°C przez 30 min w 14 000 obr./min. Po odwirowaniu uzyskany supernatant zostanie zebrany w celu oszacowania poziomów IL-6, IL-8, IL-17 i TNFα metodą ELISA przy użyciu dostępnych w handlu zestawów. Supernatant będzie przechowywany w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

Dołki dostarczonych pasków do mikromiareczkowania zostały wstępnie pokryte przeciwciałem monoklonalnym przeciwko antygenom (IL-6, IL-8, IL-17 i TNFα). Antygeny obecne w próbce lub standardzie będą inkubowane z płytkami, aby umożliwić związanie antygenów z przeciwciałem. Następnie dodaje się pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne anty-IL-6, IL-8, IL-17 i TNFα odpowiednio skoniugowane z biotyną na odpowiednich płytkach do mikromiareczkowania. Następnie do dołków zostanie dodane skoniugowane z awidyną-HRP przeciwciało swoiste dla przeciwciała pierwszorzędowego. Po inkubacji i po przemyciu, w celu usunięcia niezwiązanego odczynnika enzymatycznego przeciwciała, do dołków zostanie dodany jednoetapowy odczynnik substratowy TMB reagujący z HRP. Wywoływanie koloru zostanie zakończone przez dodanie kwasu i zmierzono absorbancję przy 450 nm. Krzywa odniesienia zostanie uzyskana poprzez wykreślenie różnych stężeń próbek standardowych w funkcji absorbancji, a poziomy antygenów w badanych próbkach zostaną obliczone za pomocą jej wykresu standardowego.

Terapia przeciwgrzybicza Grupa badana będzie leczona terapią przeciwgrzybiczą (Tab Fluconazole 100 mg jako płyn do płukania jamy ustnej (tabletka rozpuszczona w 10 ml wody do picia i stosowana jako płukanka przez 2 minuty i połykana) raz dziennie przez 14 dni). Procedura zostanie zademonstrowana każdemu badanemu przed rozpoczęciem leczenia. Uczucie pieczenia w jamie ustnej i charakterystyka kliniczna zmian na zdjęciach wewnątrzustnych zostanie zarejestrowana po leczeniu przeciwgrzybiczym.

Analiza statystyczna:

Rozkład fenotypów Candida, cechy wirulencji i wrażliwość na leki przeciwgrzybicze w grupie badanej i kontrolnej byłyby skorelowane z poziomami IL-6, IL-8, IL-17 i TNFα oraz cechami kliniczno-patologicznymi. Określone zostaną korelacje między czynnikami wirulencji a charakterystyką kliniczną. Do określenia wiarygodności wewnątrzobserwacyjnej zostanie wykorzystana statystyka kappa Cohena. W badanej grupie zostanie przeprowadzone porównanie poziomów cytokin prozapalnych (IL-6, IL-8, IL-17 i TNFα) przed i po terapii przeciwgrzybiczej. Wyniki zostaną przetestowane pod kątem istotności statystycznej. Testy Chi-kwadrat i U Manna-Whitneya zostaną wykorzystane do oszacowania istotności statystycznej różnic zaobserwowanych między grupami.

7. Uzyskanie zgody etycznej